基于分子動力學(xué)模擬研究溫度對乳酸脫氫酶活性的影響

曹 錕，王若男 ，方雅莉，石植真，熊興東，劉新光,

（1.廣東醫(yī)科大學(xué), 衰老研究所, 生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所, 廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點實驗室,廣東東莞 523808；2.廣東醫(yī)科大學(xué)科研平臺服務(wù)管理中心, 廣東東莞 523808）

近年來，有益菌被用于食品相關(guān)的生產(chǎn)加工屢見不鮮，因為其除了能夠提供給人體營養(yǎng)物質(zhì)之外，也對腸道微生物菌群的平衡起到重要作用[1-3]。干酪乳桿菌是一類有益于人體健康的活性微生物食品原料，與嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌一起被稱為“健康三益菌”[4-5]。近年來，干酪乳桿菌經(jīng)常被用作豆奶、酸乳、牛奶、干酪和奶油等乳制品的發(fā)酵工藝中，這可能與該菌在發(fā)酵過程中擁有較高的乳酸脫氫酶（LDH）活性密不可分[6-9]。該菌的最適生長溫度為37 ℃，但是發(fā)酵工程中，往往需要提高溫度抑制雜菌的生長，甚至需要加熱殺菌以保證奶制品的品質(zhì)，這可能會導(dǎo)致發(fā)酵效率降低甚至口感改變，這也是相關(guān)食品生產(chǎn)過程中遭遇的難題[10-11]。

LDH廣泛存在于動物、植物、細(xì)菌、真菌等幾乎所有生命體的組織細(xì)胞中。該酶一般是以輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH傳遞氫，在生物體內(nèi)能夠催化丙酮酸形成乳酸[12-16]。LDH是同源四聚體結(jié)構(gòu)，一個酶分子含有4個相同的亞基，每個亞基的催化功能都是相對獨立的，當(dāng)催化底物分子為丙酮酸時，該酶首先和輔酶 NADH 發(fā)生結(jié)合，進(jìn)而丙酮酸與該酶結(jié)合并接受 NADH 提供的[H]，丙酮酸發(fā)生氧化反應(yīng)，最終生成乳酸和NAD+的產(chǎn)物[17]。

通常情況下，LDH 可將手性的α-酮酸還原生成手性α-羥基酸，故該酶的底物非常廣泛，除丙酮酸外，還有對羥基苯丙酮酸、草酰乙酸、蘋果酸和苯甲酰甲酸等[18]。因此，研究不同溫度梯度條件對LDH酶活性的影響，對生命體具有普遍性意義。然而，目前研究LDH熱穩(wěn)定性的方法主要體現(xiàn)在常規(guī)的實驗方法上，該方法無法直觀反映出溫度引起氨基酸殘基的波動性、回旋半徑、溶劑可及表面積等微觀原子水平的變化程度。隨著計算生物學(xué)的發(fā)展，近年來，越來越多的研究者采用分子動力學(xué)模擬的技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)分子的運動軌跡，從而分析原子水平的構(gòu)象變化信息[19]。

本研究選擇干酪乳桿菌的LDH為研究目標(biāo)，采用分子動力學(xué)模擬的方法，研究LDH在不同溫度梯度條件下（37、55、70和85 ℃）的熱穩(wěn)定性以及酶活性中心氨基酸殘基的變化，將分析LDH的均方根誤差、回旋半徑、均方根波動值、溶劑可及表面積以及二級結(jié)構(gòu)含量等原子水平的指標(biāo)變化，以期為LDH參與的食品發(fā)酵過程中采取適宜加工溫度提供有利的參考。

1 材料與方法

1.1 分子模擬的條件

本研究利用Gromacs2020.4軟件包，LDH的結(jié)構(gòu)（PDB: 2zqy）來源于RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https://www.rcsb.org/），首先對LDH結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，即去除結(jié)晶水和雜質(zhì)離子。分子模擬分為四個獨立的體系，對應(yīng)的溫度設(shè)置分別為37、55、70和85 ℃，即在正式模擬的mdp文件中分別修改“ref_t和gen_temp”值為開爾文310.15、328.15、343.15和358.15。選擇這四個溫度的依據(jù)分別是，37 ℃為干酪乳桿菌的最適生長溫度，可代表正常狀態(tài)下的LDH；55 ℃為大多數(shù)蛋白比較常見的變性起始溫度[20-21]；70 ℃是經(jīng)過預(yù)實驗測試的大致變性溫度；85 ℃是能夠?qū)е陆^大多數(shù)蛋白變性的溫度。采用Gromos43a1分子力場、SPC水模型進(jìn)行模擬[22]，模擬總時長為80 ns。模擬之前，將LDH的結(jié)構(gòu)作為一個立方周期盒中的起始構(gòu)象，并將蛋白質(zhì)與盒邊界的最小距離設(shè)為1.0 nm。模擬系統(tǒng)的周期性邊界條件適用于X/Y/Z三個方向，在溶膠中加入0.15 mol/L NaCl鹽的溶質(zhì)對系統(tǒng)的電荷進(jìn)行中和。在模擬系統(tǒng)中，用粒子網(wǎng)格法PME計算靜電相互作用，用蛙跳算法計算原子運動。用最速下降能量法進(jìn)行400步能量的最小化。接下來，共軛梯度法被用于執(zhí)行25000步的能量最小化，隨后對每個系統(tǒng)進(jìn)行了50 ps的位置約束仿真。正式動力學(xué)模擬具有隨機的起始速度。利用PyMOL和VMD軟件作為可視化工具，用Origin 8.5軟件生成數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.2 模擬結(jié)果的分析

分別用gmx rmsf工具計算了每個氨基酸殘基的α-C的均方根漲落，用gmx gyrate工具計算了原子演化隨模擬時間的回轉(zhuǎn)半徑。利用VMD-1.9.1軟件從分子動力學(xué)模擬軌跡上觀察四個不同溫度的模擬體系中的蛋白構(gòu)象變化[23]。然后用gmx distance分別測量了LDH的典型丙酮酸結(jié)合位點殘基的平均距離，如精氨酸-106（Arg106）和精氨酸-169（Arg169）、組氨酸-193（His193）和蘇氨酸-247（Thr247）。并用PyMOL和origin 8.5軟件繪制了結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LDH蛋白的三維結(jié)構(gòu)概況

LDH廣泛存在于動物、植物及微生物等生物體內(nèi)，據(jù)報道，該酶的主要存在形式是含有四個相同亞基的同源四聚體結(jié)構(gòu)，且每個亞基都能單獨發(fā)揮催化活性[24-26]。每個亞基由326個氨基酸殘基構(gòu)成蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，如圖1A所示，其分子量約為35.5 kDa，它的二級結(jié)構(gòu)主要由8個α-螺旋和9個β-折疊組成，但大多數(shù)β-折疊被包裹在內(nèi)部，形成疏水基團(tuán)。根據(jù)PDB數(shù)據(jù)庫多種LDH的結(jié)構(gòu)信息得知，其與底物分子的結(jié)合活性中心主要位于α-螺旋之間[27]；而β-折疊則對蛋白整體構(gòu)象的穩(wěn)定起到重要作用。在模擬體系中添加了水分子和NaCl鹽離子，并進(jìn)行了能量最小化，能量優(yōu)化后的晶胞參數(shù)x/y/z分別為8.82403、8.82403、8.82403 nm（圖1B），展示了該蛋白的立方體模擬體系。

圖1 乳酸脫氫酶LDH結(jié)構(gòu)及其模擬體系構(gòu)型Fig.1 LDH structure and its simulation system configuration

2.2 均方根誤差的分析

首先針對37、55、70和85 ℃四個不同溫度，分別構(gòu)建了四個獨立的模擬體系。為了評價蛋白質(zhì)在80 ns總時長模擬過程中是否達(dá)到平衡，采用均方根誤差（root mean square deviation, RMSD） 以度量蛋白質(zhì)構(gòu)象與原始結(jié)構(gòu)之間的平均偏差，RSMD是衡量體系是否穩(wěn)定的重要依據(jù)[28]。如圖2所示，在37 ℃的模擬體系中，LDH最先達(dá)到平衡狀態(tài)，且RMSD值是最小的（約為3.4 ?）；55 ℃的條件下的RMSD值在0～55 ns上升到4.1 ?，55～80 ns進(jìn)入平衡狀態(tài)，說明該條件下的蛋白體系仍然趨于穩(wěn)定；當(dāng)?shù)鞍滋幱?0 ℃和85 ℃條件下，發(fā)現(xiàn)其RMSD值曲折上升，最大值高達(dá)6.0 ?以上，即在80 ns內(nèi)仍無法達(dá)到平衡，這說明溫度大于70 ℃的情況下蛋白質(zhì)的構(gòu)象不穩(wěn)定，逐漸開始變性。根據(jù)文獻(xiàn)報道，GREEN[29]等已證實LDH的熔解溫度為（70.13±0.062）°C，因此，70 ℃的模擬條件大致能代表LDH熔解溫度的臨界值。

圖2 溫度對LDH的均方根誤差的影響Fig.2 Effect of temperature on root mean square deviation of LDH

2.3 氨基酸殘基的均方根波動分析

均方根波動值（root mean square fluctuation,RMSF）的計算，能夠準(zhǔn)確表示出每個原子相對于其平均位置的漲落，它表征了結(jié)構(gòu)相對于時間的平均變化，可以從中分析獲得蛋白柔性區(qū)域尤其是關(guān)鍵氨基酸殘基的穩(wěn)定性等信息，對應(yīng)于晶體學(xué)中的b溫度因子[30]。

通過觀察殘基的RMSF值的變化，可以獲取不同溫度下蛋白質(zhì)的變性程度，如圖3所示，37 ℃為干酪乳桿菌的最適生長溫度，該溫度下LDH具備正常工作的酶活力，對應(yīng)的RMSF值最低（正常值），說明此時的蛋白構(gòu)象最穩(wěn)定；與37 ℃的正常值相比，55 ℃的RMSD值幾乎沒有出現(xiàn)劇烈波動，這表明該溫度對蛋白結(jié)構(gòu)沒有造成本質(zhì)的影響；然而，70 ℃對蛋白N端和C端的多數(shù)殘基造成了波動性增大的影響，這說明隨著溫度上升，LDH蛋白碳骨架的波動性逐漸增大；85 ℃條件下，幾乎所有殘基的RMSF值都大于正常值，這說明此時LDH蛋白已經(jīng)變性。因此，溫度會導(dǎo)致LDH蛋白酶的殘基波動性升高，進(jìn)而造成蛋白整體構(gòu)象的不穩(wěn)定性，這不利于LDH與底物分子的結(jié)合，這些結(jié)果都證明溫度越高對該蛋白酶的影響越大。

圖3 溫度對LDH中每個氨基酸殘基的α-C均方根波動的影響Fig.3 Effect of temperature on root mean square fluctuation of α-C of each amino acid residue in LDH

2.4 蛋白骨架α-C的回旋半徑差異分析

每個氨基酸殘基都有一個α-C，而α-C的回旋半徑能夠代表該蛋白在鹽溶液中的結(jié)構(gòu)致密性。因此，統(tǒng)計了LDH的回旋半徑隨80 ns模擬時間而變化的情況，其值越大表示蛋白構(gòu)象越松散，其值越小則構(gòu)象越致密和穩(wěn)定[31]。如圖4所示，37 ℃和55 ℃的兩個體系中，LDH的α-C的回旋半徑值是最低的，分別為1.85 nm和1.86 nm；而在LDH的熔解溫度臨界值70 ℃條件下，α-C的回旋半徑值升高至1.90 nm，該數(shù)據(jù)表明此時LDH蛋白正處于膨脹體系、結(jié)構(gòu)開始改變；85 ℃條件下的蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)遭到劇烈的破壞，對應(yīng)的α-C回旋半徑值為1.92 nm。這一結(jié)果與RMSF的分析結(jié)果保持一致。結(jié)果說明，隨著溫度升高，LDH空間構(gòu)象由致密變成松散狀態(tài)，大于70 ℃會導(dǎo)致蛋白出現(xiàn)不同程度的變性。

圖4 溫度對LDH的α-C回旋半徑的影響Fig.4 Effect of temperature on α-C radius of gyration of LDH

2.5 蛋白構(gòu)象的溶劑可及表面積分析

溶劑可及表面積（solvent accessible surface area,SASA）是描述蛋白質(zhì)與水溶液接觸的表面積的物理量，由于溫度能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)構(gòu)象造成較大的影響，因此精確計算了四個不同溫度條件下，LDH蛋白質(zhì)整體構(gòu)象殘基的SASA隨著時間的變化，并統(tǒng)計了在60～80 ns平衡時間段內(nèi)SASA的平均值，如圖5AB所示，37 ℃和55 ℃的蛋白整體構(gòu)象SASA值分別穩(wěn)定在132.4 nm2和132.2 nm2，而70 ℃和85 ℃的SASA值則分別升高至135.6 nm2及136.7 nm2，這可能是由于埋在蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)被暴露在蛋白表面所致。同時，采用gmx make_ndx將丙酮酸結(jié)合位點殘基Arg106、Arg169、His193和Thr247歸為一個組，進(jìn)而統(tǒng)計了該組對應(yīng)的數(shù)據(jù)，如圖5C展示了丙酮酸的四個結(jié)合位點殘基的SASA值，圖5D則詳細(xì)展示了四個溫度條件下的SASA平均值分別為11.62、12.01、12.72及12.50 nm2。這些結(jié)果說明與正常狀態(tài)下的LDH結(jié)構(gòu)相比，高溫促使丙酮酸結(jié)合位點殘基的溶劑可及表面積變大，因此高溫不利于丙酮酸的結(jié)合。

圖5 溫度對蛋白溶劑可及表面積的影響Fig.5 Effect of temperature on solvent accessible surface area of protein samples

2.6 不同溫度影響的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)會受到溫度、電荷、氫鍵以及配體分子結(jié)合的影響，為了明確四種不同溫度梯度對LDH二級結(jié)構(gòu)變化的影響，采用do_dssp插件分析了蛋白模擬的軌跡。如圖6A，37 ℃條件下平均有139個殘基參與形成α-螺旋，56個殘基形成無規(guī)卷曲，28個殘基形成β-轉(zhuǎn)角；與37 ℃相比，55 ℃條件下平均有135個殘基參與形成α-螺旋，55個殘基形成無規(guī)卷曲，25個殘基形成β-轉(zhuǎn)角（圖6B），二級結(jié)構(gòu)含量的變化均較小，因此55 ℃對LDH活性的影響較小。

圖6 LDH在模擬過程中的二級結(jié)構(gòu)變化Fig.6 The secondary structure changes of LDH in different simulation systems

與37 ℃體系形成鮮明對比的是70 ℃和85 ℃，二級結(jié)構(gòu)在高溫條件下受到較大的改變。主要體現(xiàn)在α-螺旋、無規(guī)卷曲、β-轉(zhuǎn)角含量的改變，即在70 ℃僅有123個殘基形成LDH的α-螺旋，28個殘基形成β-轉(zhuǎn)角，而無規(guī)卷曲的數(shù)量則升高到61個（圖6C）；在85 ℃體系中，僅有112個殘基形成α-螺旋，32個殘基形成β-轉(zhuǎn)角，68個殘基形成了無規(guī)卷曲（圖6D）。

根據(jù)這些結(jié)果，可以得知85 ℃體系的α-螺旋含量是四個溫度中最低的，無規(guī)卷曲含量是最高的。這說明高溫促使LDH蛋白內(nèi)部的二級結(jié)構(gòu)出現(xiàn)根本性的轉(zhuǎn)變，從而改變了空間構(gòu)象，破壞了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，最終使酶喪失活性。

2.7 對比37 ℃和85 ℃條件下LDH蛋白構(gòu)象差異以及丙酮酸的結(jié)合能力

上述的數(shù)據(jù)已證明溫度能夠影響LDH的空間結(jié)構(gòu)變化，溫度過高甚至?xí)?dǎo)致蛋白變性，這會導(dǎo)致LDH在食品發(fā)酵過程中酶活性降低，而丙酮酸作為該酶的底物分子之一，其與LDH的結(jié)合亦會受到抑制。計算37 ℃和85 ℃條件下的丙酮酸結(jié)合位點殘基Arg106、Arg169、His193和Thr247的空間位置信息，并利用PymoL軟件進(jìn)行作圖分析，如圖7所示，結(jié)果顯示丙酮酸分子在37 ℃時與LDH結(jié)合緊密，而85 ℃時的結(jié)合位點殘基之間的空間距離較大，這不利于丙酮酸分子的結(jié)合，進(jìn)而抑制了LDH催化的丙酮酸生成乳酸的過程。

圖7 溫度對LDH與丙酮酸分子結(jié)合能力的影響Fig.7 Effect of temperature on pyruvate binding capacity of LDH

3 討論與結(jié)論

本研究以干酪乳桿菌的LDH蛋白為切入點，采用分子動力學(xué)模擬的手段探討了37、55、70和85 ℃溫度梯度對LDH的穩(wěn)定性及酶活性的影響。LDH在低于70 ℃時，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。但是當(dāng)溫度升高至70 ℃或85 ℃，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)開始變得松散、不穩(wěn)定，二級結(jié)構(gòu)含量也被改變。主要表現(xiàn)在，RMSD和回旋半徑值顯著增加，RMSF值顯示不穩(wěn)定殘基數(shù)變多，埋藏在蛋白內(nèi)部的β-折疊疏水基團(tuán)暴露，與37 ℃條件相比，70 ℃和85 ℃分別導(dǎo)致蛋白整體溶劑可及表面積增加了3.2 nm2和4.3 nm2。更重要的是，37 ℃條件下LDH的丙酮酸活性位點為Arg106、Arg169、His193和Thr247，但是70 ℃以上的溫度導(dǎo)致蛋白變性之后，Arg106與Arg169、His193與Thr247的空間距離均不同程度增大，這意味著LDH活性中心微環(huán)境遭到破壞，無法結(jié)合丙酮酸；而且LDH的α-螺旋含量在高溫條件下驟然下降、無規(guī)卷曲含量升高，說明高溫是導(dǎo)致蛋白空間構(gòu)象改變的重要原因，這提示在食品發(fā)酵各個環(huán)節(jié)需要嚴(yán)格控制溫度低于70 ℃。總之，本研究揭示了溫度影響LDH酶活性及構(gòu)象變化的關(guān)鍵信息，為乳酸制品在發(fā)酵過程中選擇合適溫度提供了理論支撐。