淀粉納米顆粒的醇沉法制備與同步包埋山奈酚的研究

史永桂，林日輝，焦思宇，蒙 薇，韋凱美，陸曉娜，楊麥秋，林春燕

（廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，林產(chǎn)化學(xué)與工程國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530006）

大多數(shù)天然黃酮化合物具有抗炎、抗氧化、抗病毒等功效，在醫(yī)藥和食品添加劑領(lǐng)域引起了眾多研究者的關(guān)注[1]。山奈酚（Kaempferol）是一種天然的多羥基黃酮類化合物，具有良好的生理和藥理作用，已應(yīng)用于食品添加劑和醫(yī)藥方面[2]。Song等[3]研究了山奈酚對體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞影響，在山奈酚用量為60或120 μmol時(shí)可抑制胃癌細(xì)胞的增值，并且對正常的胃細(xì)胞沒有顯著的影響，這為山奈酚的體內(nèi)供藥提供了參考。但是山奈酚分子含有二苯基丙烷結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性，導(dǎo)致山奈酚在水中難以溶解，生物利用度差，且藥效作用也極易受到劑量、體內(nèi)釋放以及體內(nèi)環(huán)境因素等影響[4?5]。為了充分發(fā)掘山奈酚的藥用價(jià)值，需要開發(fā)新的制劑技術(shù)，包埋和緩釋成為了山奈酚的研究方向，天然材料的生物相容性使其成為藥物載體的研究熱點(diǎn)。

淀粉作為一種天然的高分子材料，因其良好的生物相容性，在作為藥物載體方面有廣泛的應(yīng)用[6]。由于原淀粉本身性質(zhì)限制，淀粉多以在水相中對親水性藥物的物理吸附以此作為藥物載體，在有機(jī)溶劑中受自身溶脹性等限制，對疏水性藥物的負(fù)載效果并不理想[7]。由于納米技術(shù)的興起，納米淀粉（Nanometer starch，SNPs）的研究成為熱點(diǎn)，在藥劑學(xué)領(lǐng)域方面，認(rèn)為淀粉顆粒尺寸小于1 μm即為SNPs。SNPs作為藥物載體與藥物有效結(jié)合并在人體內(nèi)有效釋放吸收，有著廣闊發(fā)展前景，因此納米淀粉的研究成為了一種趨勢[8]。

淀粉顆粒在完全糊化狀態(tài)下，其中的淀粉鏈由雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋成單螺旋結(jié)構(gòu)，單螺旋淀粉鏈具有疏水性的空腔和親水性外部螺旋結(jié)構(gòu)，疏水性的空腔可與疏水性分子形成包合物，這為本文提供了理論的基礎(chǔ)[9]。Tan等[10]在丙酮中制備了納米淀粉，并通過熒光光譜法證明疏水性藥物芘在納米淀粉的極性較強(qiáng)介質(zhì)表面轉(zhuǎn)移向極性較小的介質(zhì)內(nèi)部，表明納米微球內(nèi)部存在極性較低的微質(zhì)，該微質(zhì)由直鏈淀粉有序排列構(gòu)成，可用于對疏水性藥物的包封。Arvisenet等[11]在糊化后的淀粉中添加芳香化合物，研究了直鏈淀粉對風(fēng)味化合物的包合作用，結(jié)果表明直鏈淀粉可與芳香化合物形成包合物，對芳香化合物的保留有顯著得影響。Zhu等[12]制備了不同的直鏈玉米淀粉，并研究了與小分子萘酚形成共沉淀的產(chǎn)率，結(jié)果表明相對絡(luò)合的指數(shù)在27.5%~69.1%?？梢姡矸壑械闹辨湹矸酆蚐NPs內(nèi)部極性較小區(qū)域?qū)κ杷运幬锞哂幸欢ǖ陌窈拓?fù)載作用。因此，本文嘗試在淀粉納米顆粒形成過程中同步包埋疏水性藥物山奈酚，探索一種快捷、且在無任何有毒試劑參與下制備出形貌較好、尺寸較均一的納米級別的SNPs-山奈酚顆粒，為納米淀粉的制備及其在疏水性藥物負(fù)載方面提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木薯淀粉 純度95%以上、直鏈淀粉含量10%，市售；無水乙醇 分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；Tween-80 AR，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；山奈酚BR（純度95%） ，上海源葉生物技術(shù)有限公司。

JY92-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；FD-A10N-50型冷凍干燥機(jī) 上海皓莊儀器有限公司；UV23II型紫外可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；Nicolet is10型傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；MiniFlex600型X-射線衍射儀 日本理學(xué)公司；SUPRA 55 Sapphire型場發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司；Nicomp380ZLS型納米激光粒度及電位分析儀 美國PSS粒度儀公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淀粉納米顆粒的制備

1.2.1.1 木薯淀粉乳的制備 參考Hu等[13]配制濃度為5%（W/W）的淀粉溶液，置于恒溫磁力攪拌器中以冷凝器進(jìn)行回流，在90 ℃恒溫1 h至淀粉完全糊化。糊化淀粉液在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)下600 W超聲處理10 min降低粘度。將低粘度淀粉液在8000 r/min下離心5 min，取上清液，即得淀粉乳。

1.2.1.2 不同乙醇濃度制備淀粉納米顆粒 參考孫錦等[14]方法，并做出適當(dāng)調(diào)整。在超聲波運(yùn)行條件下，將3、4、6 mL無水乙醇分別通入處于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)下的7、6、4 mL淀粉乳中，制備乙醇含有量為30%、40%、60%的淀粉納米顆粒混合液。在8000 r/min下離心5 min，取沉淀，冷水沖洗，置于?20 ℃冰箱冷凍10 h，最后置于?45 ℃冷凍干燥至恒重，制備得SNPs。

1.2.1.3 場發(fā)式掃描電鏡觀察（SEM） 用毛細(xì)管取少量的木薯淀粉和SNPs均勻的撒到雙面導(dǎo)電膠上，輕輕吹去多余的浮樣，置于真空鍍膜儀下噴鍍鈀金，制成電鏡觀察樣品，掃描電鏡下用5000倍拍照觀察。

1.2.1.4 樣品顆粒的粒徑檢測 參考涂宗財(cái)?shù)萚15]方法并稍作改進(jìn)，取適量樣品溶于冷超純水中制得混合懸濁液，并在冰浴條件下，將混合液在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)下進(jìn)行超聲分散一段時(shí)間。取適量分散液放入比色皿中，設(shè)定儀器參數(shù)，溫度25 ℃、水折射率1.33、淀粉折射率1.53，通過納米激光粒度在此條件下測量粒度。

1.2.1.5 X-射線衍射（XRD） 用XRD測定納米淀粉的結(jié)晶性。設(shè)置測試條件：電壓大小為40 kV，電流大小為20 mA，使用單色Cu-kα射線和Ni片濾波，以0.02°為掃描步長，以4（°）/min為掃描速率，以4°~40°為2θ的掃描范圍[16]。

1.2.2 納米顆粒對山奈酚的包埋

1.2.2.1 山奈酚的吸收波長選擇與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立稱量山奈酚2.5 mg，于乙醇溶液中溶解，配制成0.05 mg/mL的山奈酚溶液。在全波長200~800 nm范圍內(nèi)用紫外可見分光光度計(jì)對其進(jìn)行掃描。為避免淀粉中雜質(zhì)干擾，將2.5 mg淀粉分散于無水乙醇溶液中，然后8000 r/min進(jìn)行離心，取上清液全波長掃描作為對照組。結(jié)果山奈酚在367 nm處，有最大吸收波長，且淀粉醇的分散液在此波長無吸收，選擇吸收波長為367 nm[17]。

精準(zhǔn)稱取山奈酚50.0 mg溶解于乙醇，定容至100 mL容量瓶中，得濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液。移取母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL定容至250 mL容量瓶中，得濃度為 0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.012 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在367 nm下用紫外可見分光光度計(jì)測量吸光度，以乙醇作為對照液，平行測定兩次，記錄吸光度。以山奈酚濃度為橫坐標(biāo)X （mg/mL），吸光度為縱坐標(biāo)Y，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=75.76X?0.012 （R2=0.9987）。

1.2.2.2 SNPs對山奈酚的包埋 以0.7 mg/mL的山奈酚醇溶液作為非溶劑相，按照1.2.1.2方法為基礎(chǔ)并做改進(jìn)，將山奈酚醇溶液3、4、6 mL，分別通入置于超聲波加強(qiáng)攪拌下的5%淀粉乳溶液7、6、4 mL，得乙醇濃度為30%、40%、60%的山奈酚淀粉納米混合溶液，離心后去除上清液，沉淀少量冷水分散，用冷凍干燥凍干恒重，制備得SNPs-山奈酚顆粒。分別取山奈酚淀粉納米混合溶液1.5 mL用高速冷凍離心機(jī)離心，在12000 r/min下，離心5 min，取上清液。該上清液稀釋100倍，用紫外分光光度計(jì)測量吸光度A，包埋率的計(jì)算公式（1）為：

式中：C0：山奈酚濃度（0.7 mg/mL）；V0：山奈酚溶液體積，mL；C1：山奈酚淀粉納米混合液濃度，mg/mL；V1：山奈酚淀粉溶液體積，mL。

包埋量計(jì)算公式（2）為：

式中：C2：淀粉乳濃度，5%；V2：通入淀粉乳體積，mL。

1.2.3 SNPs-山奈酚在體外環(huán)境、模擬胃液和腸液中緩釋性能和穩(wěn)定性分析

1.2.3.1 山奈酚在模擬人體外環(huán)境中的釋放情況以pH7.4的PBS緩沖液作為模擬人體外環(huán)境中的釋放介質(zhì)，由于山奈酚在水中溶解差，在釋放介質(zhì)中以質(zhì)量濃度為1%的Tween-80作為表面活性劑[18]。稱取0.5 g按1.2.2.2方法制得SNPs-山奈酚顆粒（載藥量分別為3.78、2.2、1.96 mg/g），加入5 mL釋放介質(zhì)裝入透析袋，于振蕩培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)速100 r/min、37 ℃下懸浮釋放。分別于0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0、15.0、20.0、24.0 h取釋放介質(zhì)1 mL（并補(bǔ)充等量的相應(yīng)介質(zhì)），以5 mL，0.08 mg/mL山奈酚原料藥作為對照組，測量吸光度[19]。根據(jù)式（3）計(jì)算釋放率：

式中：Ve：釋放介質(zhì)置換體積，mL；Ci：第i次置換時(shí)山奈酚濃度；V0：起始釋放體積，mL；n：置換液體次數(shù)；Ddrug：SNPs-山奈酚載藥量。

1.2.3.2 在模擬人體胃腸消化液中山奈酚的釋放情況 參考楊慧等[19]方法并做適當(dāng)調(diào)整配制模擬體液，分別配制水溶液、30%、50%濃度的乙醇溶液（含1% Tween-80）各100 mL，并用稀鹽酸（含有胃蛋白酶0.2 mg）調(diào)節(jié)pH為2作為模擬胃液；以磷酸緩沖液（含有胰蛋白酶0.2 g）配制水溶液、30%、50%濃度的乙醇溶液（含1% Tween-80）各100 mL，調(diào)節(jié)pH為7.0作為模擬腸液。按照1.2.3.1方法將SNPs-山奈酚顆粒在兩組緩釋介質(zhì)中分別釋放3 h，測量吸光度。

1.2.3.3 包埋后山奈酚在不同時(shí)間下的穩(wěn)定性 將1.2.2.2制備的山奈酚淀粉納米混合液放入血液混凝器上，室溫下避光2、4、6、8、10、12、24 h，以山奈酚醇溶液和山奈酚水溶液（含1% Tween-80）作為對照，記錄混合液的吸光值變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)，采用Excel 2010對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并對平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，采用Origin 2018對實(shí)驗(yàn)參數(shù)和結(jié)果繪圖，Photoshop對圖片進(jìn)行排版。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乙醇濃度下淀粉納米顆粒的表征

2.1.1 在SEM下對淀粉顆粒的表征 木薯淀粉和SNPs的SEM如圖1所示。由圖1a知木薯淀粉顆粒表面和邊緣光滑，淀粉顆粒主要保持圓形和少許不規(guī)則形，顆粒的尺寸為微米級別。對比圖1b、1c、1d，木薯淀粉經(jīng)超聲攪拌后，淀粉顆粒形貌改變較明顯，60%乙醇制備的SNPs形貌較好，顆粒分布均勻；40%乙醇下沉降制備的SNPs主體形貌為納米球，尺寸分布相對均勻，但顆粒之間有輕微的團(tuán)聚產(chǎn)生，并有尺寸較大顆粒生成；30%乙醇下制備下的淀粉顆粒，形貌主體為不規(guī)則顆粒，疏松多孔。超聲波攪拌過程中乙醇含量對SNPs的沉降有著重要影響，乙醇含量較低時(shí)，沉降形成的納米微球的表面和內(nèi)部的水不能被乙醇完全奪取。因此，淀粉納米顆粒在去溶劑化作用時(shí)，隨著乙醇首先的揮發(fā)，水的存留增加了淀粉鏈之間的氫鍵作用力，使淀粉顆粒之間出現(xiàn)粘結(jié)[20]。干燥后的SNPs會(huì)聚集在一起，形成微米級別的聚集顆粒形狀，因SNPs顆粒粒徑小，比表面積大，表面能大，顆粒之間通過聚集狀態(tài)而達(dá)到穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

圖1 木薯淀粉和納米淀粉電鏡圖Fig.1 Electron micrograph of tapioca starch and nano starch

2.1.2 淀粉顆粒的粒度表征 淀粉樣品的粒徑分布如圖2所示。由圖2（a）可以看出，木薯淀粉粒徑主要分布在5~20 μm，經(jīng)超聲波波攪拌法處理后的SPNs的粒徑明顯下降，成為納米級別淀粉顆粒。由圖2（d）知，60%乙醇下制備的SPNs粒徑主要分布在50~200 nm，顆粒分布較均勻，隨乙醇濃度下降，制備的SPNs粒徑開始增大，并且顆粒分布范圍增加。

圖2 木薯淀粉和納米淀粉粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of tapioca starch and nanostarch

2.1.3 在XRD下對淀粉顆粒的表征 由圖3知，木薯淀粉在15°、17°、18°和23°處有較強(qiáng)的衍射峰，其晶型屬于A型[21]。在30%乙醇中制備的SNPs在17°、18°處衍射峰消失，15°和23°處衍射峰的偏移至13°、21°并在8°處有新的衍射峰出現(xiàn)，表明沉降法制備的SPNs晶型發(fā)生明顯改變，生成了新的結(jié)晶區(qū)。根據(jù)Shi[22]的研究報(bào)道，2θ衍射角在8°、13°、21°處的峰是V型淀粉的特征峰。V型淀粉晶體結(jié)構(gòu)主要由直鏈淀粉和乙醇的復(fù)合物生成，表明木薯淀粉經(jīng)超聲攪拌后，雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致原有晶型發(fā)生改變[23]。當(dāng)乙醇濃度增加到40%時(shí)，SNPs僅在13°有微弱衍射峰產(chǎn)生，其他衍射峰消失，說明SNPs的結(jié)晶性隨乙醇的濃度升高而下降。當(dāng)乙醇濃度進(jìn)一步提升至60%時(shí)，SNPs的衍射峰完全消失，形成大包峰，此時(shí)淀粉顆粒無結(jié)晶性。

圖3 木薯淀粉和納米淀粉的XRD圖Fig.3 XRD patterns of tapioca starch and nano starch

2.1.4 SNPs對山奈酚的包埋 山奈酚的二苯基丙烷結(jié)構(gòu)決定其疏水性較強(qiáng)，難溶于水，可溶于乙醇，因此SNPs對山奈酚的包埋受乙醇濃度的影響較大[2]。圖4表明當(dāng)乙醇濃度升高時(shí)，SNPs對山奈酚的包埋率和包埋量呈現(xiàn)下降趨勢。乙醇的濃度為30%時(shí)，SNPs在沉降時(shí)對山奈酚的包埋率最高為62.49%，包埋量為3.78 mg/g。在SNPs在沉降時(shí)，淀粉乳進(jìn)入乙醇非溶劑體系，淀粉分子周圍的水溶劑被置換為乙醇非溶劑，淀粉分子間的羥基重新締和形成氫鍵，形成淀粉納米顆粒沉降。山奈酚在乙醇濃度為30%中的溶解度較低，山奈酚分子上的羥基更易與葡萄糖分子上羥基相互作用生成氫鍵，隨淀粉分子的沉降被包埋進(jìn)SNPs內(nèi)；乙醇濃度升高時(shí)，山奈酚在乙醇中的溶解度增大，山奈酚上的羥基與醇羥基之間形成的氫鍵作用變強(qiáng)，與淀粉分子之間的作用力變?nèi)?，減少了包埋量。因此此過程中山奈酚在非溶劑乙醇中的濃度對包埋率影響較大，這與寇宗亮等[7]在木薯納米淀粉對疏水性藥物姜黃素負(fù)載的研究結(jié)果相似。

圖4 SNPs對山奈酚包埋率Fig.4 Effect of SNPs on embedding rate of kaempferol

2.1.5 山奈酚在模擬人體外環(huán)境中的釋放情況SNPs-山奈酚和山奈酚溶液的釋放率結(jié)果如圖5所示?？梢悦黠@看出，釋放時(shí)間3 h下，山奈酚原料藥基本完全釋放，釋放率為93.75%，釋放速度較快；SNPs-山奈酚顆粒相對山奈酚原料藥釋放速度較為緩慢，可持續(xù)釋放時(shí)長為20 h，SNPs-山奈酚對藥物的緩釋性能明顯。結(jié)合侯敬申等[24]研究成果，山奈酚在50~175 μmol/L的濃度下，可明顯抑制人膽囊癌細(xì)胞的增殖，30%乙醇制備下的SNPs-山奈酚釋放率可達(dá)88.75%，釋藥量與其相近，為SNPs-山奈酚的實(shí)際應(yīng)用提供了參考。此外釋放率還與其山奈酚的包埋量呈現(xiàn)正相關(guān)，包埋量較高時(shí)，釋藥率較高。

圖5 山奈酚在模擬人體外環(huán)境中的釋放情況Fig.5 Release of kaempferol in a simulated human external environment

2.1.6 在模擬人體胃腸消化液中山奈酚的釋放情況如圖6所示，釋放時(shí)間3 h下，SNPs-山奈酚的釋放率受乙醇濃度影響較大，緩釋介質(zhì)中乙醇濃度的升高使得釋放速率加快，這與山奈酚易溶于乙醇，對乙醇的相親性更高有關(guān)。SNPs-山奈酚在模擬胃液中釋放速率高于模擬腸液的釋放速率，pH較低，緩釋的速率較快，這可能歸結(jié)于在較低的pH下，淀粉發(fā)生溶蝕相關(guān)，加快了山奈酚的溶出速率。這與候曉蘋等[25]在微孔淀粉對維生素C、茶堿和BSA緩釋的研究相似。

圖6 在模擬人體胃腸消化液中山奈酚的釋放情況Fig.6 Release of kaempferol in simulated human gastrointestinal digestive juice

2.1.7 山奈酚的穩(wěn)定性 黃酮類化合物由于不飽和結(jié)構(gòu)，水溶液中易于氧化和降解，顏色會(huì)逐漸變淺，吸光值降低，記錄吸光值的變化可以計(jì)算山奈酚的保留率[26?27]。由圖7知，在5 h內(nèi)，SNPs-山奈酚的溶液中山奈酚的保存率都在75%以上，高于山奈酚水溶液的保留率，且保留率和乙醇的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)性，可能是因?yàn)樯侥畏釉诖既芤褐谐浞秩芙猓侥畏由系牧u基與醇羥基形成氫鍵作用，不易被氧化；而在水溶液中，山奈酚不溶解，羥基與氧氣接觸較多，易被氧化。保留率測試數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過納米淀粉包埋后溶液具有一定的穩(wěn)定性，SNPs-山奈酚包埋后的溶液在5 h內(nèi)對山奈酚具有較好的保存作用，為納米淀粉在負(fù)載藥物方面提供參考。這與Sedef等[5]利用天然納米殼聚糖對山奈酚進(jìn)行負(fù)載，其結(jié)果表明可在30 d內(nèi)顯著抑制細(xì)菌的生長，山奈酚具有良好的穩(wěn)定性的研究結(jié)果相似。

圖7 山奈酚在不同時(shí)間下的保留率Fig.7 Retention rate of kaempferol at different time

3 結(jié)論

本文在無任何穩(wěn)定劑和有毒溶劑參與采用超聲波攪拌法下制備出形貌較好，顆粒尺寸分布均勻的納米淀粉顆粒。利用淀粉直鏈分子單螺旋空腔內(nèi)的疏水性和納米淀粉顆粒內(nèi)部的疏水性微質(zhì)，在納米沉降過程中通過淀粉分子與山奈酚之間的氫鍵的締合和直鏈淀粉的疏水空腔，以此完成對疏水性藥物山奈酚的包埋，制備出納米級別的SNPs-山奈酚顆粒。SNPs-山奈酚的包埋率受乙醇濃度影響，在30%乙醇下包埋率最高，為62.94%，60%乙醇下包埋率最低，為9.31%。SNPs-山奈酚在模擬體液條件下的藥物緩釋性能明顯，可持續(xù)在體外釋放在20 h，30%制備SNPs-山奈酚釋藥量可達(dá)88.75%，且釋藥量與包埋量呈現(xiàn)正相關(guān)，且釋放率受緩釋介質(zhì)中乙醇濃度的影響，乙醇濃度增大，釋放速率加快。包埋后的SNPs-山奈酚溶液在5 h內(nèi)的保留率在75%以上，淀粉納米顆粒具有穩(wěn)定的包埋作用。綜上所述，本文在納米淀粉制備的沉降過程中，研究了一種新的納米淀粉對疏水性藥物包埋負(fù)載的方法，為納米淀粉在醫(yī)藥方面的應(yīng)用提供參考。