石柱參SzPLC1基因的生物信息學(xué)分析及脅迫應(yīng)答

王丹丹,齊彤彤

(遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118003)

石柱參，又名柱參，隸屬于五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)。人參(PanaxginsengC. A. Mey.)是我國東北地區(qū)名貴藥材及補(bǔ)品，在遼寧省丹東市寬甸縣多有分布。石柱參種植地毗鄰鴨綠江，栽培方式不同于普通園參，且生長速度緩慢(長成成品需長達(dá)12～15 年時(shí)間)。在優(yōu)越環(huán)境下生長的石柱參形態(tài)特征與野生人參相似，人參總皂甙含量高于普通園參，在國際中藥市場(chǎng)享有盛譽(yù)。

磷脂(Phospholipid)是細(xì)胞膜的主要成分，其含量與組成存在個(gè)體差異，在細(xì)胞生長和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。磷脂酶可催化細(xì)胞膜中磷脂重構(gòu)，其間產(chǎn)生多種脂源性第二信使。磷脂酶根據(jù)磷酸酯鍵水解位點(diǎn)，分類為4個(gè)基團(tuán)，即磷脂酶A1 (PLA1)、磷脂酶A2 (PLA2)、磷脂酶C (PLC)和磷脂酶D (PLD)[1]。它們存在于不同的亞科或科，在底物選擇性、結(jié)構(gòu)、輔助因子要求和反應(yīng)條件方面均有不同。

磷脂酶C基因家族是磷脂酶家族的重要成員，它能調(diào)控植物生長發(fā)育過程。根據(jù)底物不同，磷脂酶C可分為非特異性磷脂酶C (NPC)和磷脂酰肌肽特異性磷脂酶C (PI-PLC)。PI-PLC可以水解磷脂酰肌醇4, 5-bisphosphate (PIP2)而產(chǎn)生兩個(gè)重要的信號(hào)分子：三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DAG)。蛋白激酶C (PKC)的家族成員可依靠上述信號(hào)分子釋放細(xì)胞中的Ca2+，從而被激活并參與植物的生長發(fā)育過程。NPC可以水解磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)生成磷脂酰絲氨酸(PS)、DAG和相應(yīng)的磷酸基團(tuán)[2-3]。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的PLC基因被鑒定出來：擬南芥含有9個(gè)PI-PLC和6個(gè)NPC，番茄含有6個(gè)PI-PLC成員，棉花含有12個(gè)PI-PLC和9個(gè)NPC，玉米含有5個(gè)PI-PLC和4個(gè)NPC，水稻中有4個(gè)PI-PLC和5個(gè)NPC成員。在高等植物中，擬南芥和水稻中PLC家族基因的生物學(xué)功能分析較為明確：AtPI-PLC1參與高滲脅迫響應(yīng)；AtPI-PLC2參與雌雄配子體發(fā)育的生長素調(diào)控；AtPI-PLC3參與干旱和鹽脅迫的早期反應(yīng)，屬于轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF家族，是乙烯反應(yīng)因子的下游靶基因；AtNPC1、AtPI-PLC3和AtPI-PLC9參與擬南芥的熱脅迫響應(yīng)；AtPI-PLC5過表達(dá)可引起擬南芥葉片早衰或煙草葉片點(diǎn)狀枯萎；脫落酸可誘導(dǎo)AtPI-PLC6參與冷應(yīng)激反應(yīng)；生長素和細(xì)胞分裂素可將植物AtPI-PLC7和AtPI-PLC8表達(dá)上調(diào)，并在鹽脅迫、干旱和冷害下亦能上調(diào)；AtNPC4及其衍生脂質(zhì)可增強(qiáng)對(duì)高滲透脅迫的抵抗力、調(diào)節(jié)ABA反應(yīng)機(jī)制，促進(jìn)植物對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性；AtNPC5和甘油三酯在輕度鹽脅迫下促進(jìn)植物側(cè)根發(fā)育，OsNPC2對(duì)鹽和低溫處理敏感，特別是鹽處理下OsNPC2的表達(dá)增加了近8倍；多種脅迫同時(shí)誘導(dǎo)OsPI-PLC3的表達(dá)，特別是鹽處理下的表達(dá)增加了22倍。綜上所述，植物PLC基因在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[4-8]。

目前，對(duì)石柱參的研究主要集中于栽培技術(shù)和功能基因的克隆上，對(duì)其PLC家族成員的克隆及表達(dá)研究還未見報(bào)道。因此，鑒定SzPLC家族成員并探討其功能具有重要的意義。本研究參考擬南芥(NM_125254.2)的AtPLC1基因設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR與RACE技術(shù)克隆石柱參PLC1全長基因，命名為SzPLC1基因。通過蛋白序列比對(duì)、結(jié)構(gòu)域分析、蛋白網(wǎng)絡(luò)互作以及進(jìn)化樹構(gòu)建，為深入研究SzPLC1蛋白的特性及功能，并為最終解釋石柱參SzPLC1參與抗逆脅迫的分子機(jī)制以及基因工程手段在石柱參分子育種中的應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

5年生無病蟲害、生長勢(shì)良好的石柱參根組織，2020年7月采自丹東市寬甸滿族自治縣振江鎮(zhèn)大青村。

1.2 總RNA提取

取新鮮石柱參根組織0.5 g置于液氮中研磨至粉末狀，依據(jù)植物總 RNA 快速抽提試劑盒(Plant Total RNA Isolation Kit)說明書抽提石柱參總RNA，電泳檢測(cè)RNA完整性。以石柱參總RNA為模板，采用AMV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒(AMV First Strand cDNA Synthesis Kit)生成cDNA第一鏈，-20 ℃保存[9]。

1.3 石柱參SzPLC1全長基因的克隆

以擬南芥(NP_568881.1)的AtPLC1基因設(shè)計(jì)引物(見表1)，克隆石柱參SzPLC1的核心片段，并根據(jù)核心片段設(shè)計(jì)5′-RACE和3′-RACE引物。采用生工生物工程(上海)股份有限公司的5′-RACE和3′-RACE試劑盒，以SzPLC1核心片段為模板快速擴(kuò)增SzPLC1基因的5′-RACE片段和3′-RACE片段。PCR 擴(kuò)增體系(50 μL)：5′和3′-RACE cDNA 2.5 μL，LA緩沖液 (10×) 25 μL，LA聚合酶混合液1.0 μL，PCR-Grade H2O 15.5 μL，UPM(10×)5 μL，5′，3′GSP 引物1.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，69 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，40次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用凝膠回收試劑盒純化、回收PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，連接pUC19載體后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。 采用DNAstar軟件拼接5′ -RACE、核心序列與3′-RACE 3個(gè)片段，最終獲得石柱參SzPLC1全長基因[10-12]。

表1 引物信息

1.4 石柱參SzPLC1基因生物信息學(xué)分析

根據(jù)SzPLC1基因全長序列，采用ORF Finder預(yù)測(cè)SzPLC1基因開放閱讀框，采用在線分析軟件Prot Param分析理化特性，采用Prot Scale分析氨基酸序列的疏水性和親水性，采用SWISS MODEL在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，采用String(http://string-db. org/)預(yù)測(cè)其蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；采用DNAMAN軟件與Blast在線軟件對(duì)其同源氨基酸進(jìn)行多重比對(duì)，用Clustalx和MEGA 7.0 軟件構(gòu)建石柱參SzPLC1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹[13]。

1.5 干旱脅迫對(duì)石柱參SzPLC1基因的脅迫表達(dá)

對(duì)土壤進(jìn)行3個(gè)含水量設(shè)置：充分灌溉處理(對(duì)照組)，土壤相對(duì)含水量保持在(90±5) %；輕度干旱脅迫處理，土壤相對(duì)含水量保持在(65±5) %；重度干旱脅迫處理，土壤相對(duì)含水量保持在(35±5)%。每個(gè)處理5盆，在干旱處理的第0、6、12、20 d及復(fù)水后6 d取樣并保存到冰箱。采用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)SzPLC1基因特異性引物PLC1-qF/R，以18S-F/R為內(nèi)參引物，通過qRT-PCR對(duì)SzPLC1基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)分析，檢測(cè)干旱條件下SzPLC1基因表達(dá)量水平，3次生物學(xué)重復(fù)后取平均值[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 石柱參SzPLC1基因cDNA全長克隆

以擬南芥(NP_568881.1)序列為模板設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR與RACE技術(shù)克隆SzPLC1基因全長cDNA序列(圖1)，采用SeqMan程序?qū)?’-RACE(521 bp)、核心序列(1 068 bp)與3’-RACE(387 bp)3段DNA序列進(jìn)行拼接，獲得1條長度為1 725 bp的DNA片段，以該序列為模板，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)SzPLC1基因特異性引物，以石柱參cDNA為模板克隆SzPLC1全長序列。結(jié)果顯示，克隆得到的SzPLC1序列與拼接的序列長度一致，可確定為SzPLC1基因(見圖1)。

2.2 石柱參SzPLC1基因理化特性分析

石柱參SzPLC1基因cDNA全長為1 725 bp(見圖2)，包含1個(gè)1 455 bp的完整開放閱讀框(ORF)，編碼484個(gè)氨基酸，其5’-UTR長252 bp， 3’-UTR長18 bp。Prot Param 分析表明：SzPLC1蛋白質(zhì)分子式為C2444H3803N655O738S21，含8147個(gè)原子，分子質(zhì)量為54.8 ku，等電點(diǎn)pI為5.85，含有63個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基、55個(gè)帶正電荷氨基酸殘基；蘇氨酸(Ser)含量最高(7.9%)，半胱氨酸(Cys)含量最低(1.8%)，脂肪系數(shù)為76.10。Prot Scale分析表明：SzPLC1蛋白親水性氨基酸數(shù)量顯著多于疏水性氨基酸數(shù)量，292、283位氨基酸殘基的親水性最強(qiáng)(MIN：-2.644)，64位的疏水性最強(qiáng)(MAX：1.889)，推斷SzPLC1蛋白為親水性蛋白(圖3)；SignalP-4.1預(yù)測(cè)SzPLC1蛋白無信號(hào)肽，無剪切位點(diǎn)，說明該蛋白翻譯后無需跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；PSORT Prediction預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位表明該蛋白質(zhì)可能存在于細(xì)胞質(zhì)膜。Smart在線分析顯示：GaSQS蛋白具有2個(gè)結(jié)構(gòu)域(見圖4)，即X區(qū)(105～249，1.04×10-53)和Y區(qū)(293～410，1.55×10-61)，約含有150和130個(gè)氨基酸殘基；SOPMA預(yù)測(cè)SzPLC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(見圖5)，包括無規(guī)則卷曲(40.91%)、α-螺旋(37.54%)、延伸鏈(18.39%)和β-轉(zhuǎn)角(4.96%)；SWISS-MODEL預(yù)測(cè)SzPLC蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(見圖6)，表明SzPLC蛋白具有由多個(gè)無規(guī)則卷曲和α-螺旋形成的中央激活位點(diǎn)空穴區(qū)域，符合磷脂酶的理化特性，有利于形成底物結(jié)合域和催化位點(diǎn)，該區(qū)域可與Ca2+結(jié)合，而Ca2+又能與底物二磷酸結(jié)合，因此推測(cè)該核心部位可能是酶的活性中心。

2.3 石柱參SzPLC1蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

String蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明，與SzPLC1蛋白互作的蛋白質(zhì)共有9個(gè)(見圖7)，即： G蛋白α亞基、G蛋白β亞基、G蛋白γ亞基1、G蛋白γ亞基2、 G 蛋白偶聯(lián)受體、鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族、SPA7蛋白、TATC膜蛋白和阿拉伯半乳糖蛋白。這些蛋白均是磷脂酰肌醇信號(hào)通路的重要酶類，說明SzPLC1是磷脂酰肌醇信號(hào)通路中關(guān)鍵的酶，其分子功能涉及催化活性和結(jié)合。生物過程主要涉及代謝過程、細(xì)胞過程、對(duì)刺激的反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

2.4 石柱參SzPLC1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

經(jīng)Blast比對(duì)，SzPLC1蛋白與較多十字花科植物均具有較高同源性(80%～98%)。從NCBI 數(shù)據(jù)庫選取10個(gè)與SzPLC1蛋白高度同源的氨基酸序列，用MEGA7.0構(gòu)建PLC1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖8)。結(jié)果表明：10個(gè)PLC1氨基酸序列匯聚為兩大支，其中十字花科聚為一支，另一支均為豆科的PLC1氨基酸序列。石柱參SzPLC1蛋白與蘿卜Raphanussativus(XP_018480211.1) 的PLC1蛋白表現(xiàn)出較高的同源性(95%)，親緣關(guān)系最為相近，說明該蛋白高度保守。

2.5 石柱參SzPLC1干旱脅迫表達(dá)

在干旱處理的第0、6、12、20 d及復(fù)水后6 d，分別對(duì)3種處理后的各時(shí)期石柱參SzPLC1蛋白的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：充分灌溉處理(對(duì)照組)的SzPLC1蛋白表達(dá)水平相對(duì)較穩(wěn)定；輕度干旱脅迫處理與重度干旱脅迫處理的石柱參植株SzPLC1蛋白表達(dá)水平隨著干旱處理時(shí)間的延長而升高，直至20 d時(shí)達(dá)到峰值，復(fù)水后6 d表達(dá)量有明顯下降趨勢(shì)，其中，重度干旱脅迫處理的SzPLC1蛋白表達(dá)量高于其他兩個(gè)處理，在干旱處理20 d時(shí)，SzPLC1蛋白的表達(dá)量約為對(duì)照組的5.4倍。說明SzPLC1蛋白的功能具有抗干旱脅迫的作用。

3 討論

磷脂是細(xì)胞膜重要的組成成分，其水解產(chǎn)物是DAG和IP3，也是細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的2個(gè)第二信使，催化上述反應(yīng)的水解酶便是磷脂酶類， IP3可激活PI-PLC水解PIP2，再次生成第二信使DAG和IP3，對(duì)植物細(xì)胞增殖、分化、代謝以及分泌等過程發(fā)揮作用，所以，磷脂酶C是一種重要的脂質(zhì)水解酶，參與脂質(zhì)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在許多植物非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。根據(jù)基質(zhì)的不同，PLC在植物中可分為PI-PLC和NPC。PI-PLC的結(jié)構(gòu)主要由pH結(jié)構(gòu)域(涉及膜靶向和蛋白結(jié)合)、EF-hand結(jié)構(gòu)域(并非所有PI-PLC基因都含有EF-hand結(jié)構(gòu)域)、催化結(jié)構(gòu)域(X和Y結(jié)構(gòu)域)和C2結(jié)構(gòu)域組成，與動(dòng)物的PLC相比，植物中的PLC缺少pH結(jié)構(gòu)域。研究表明PI-PLC的催化活性嚴(yán)格依賴于X/Y結(jié)構(gòu)域(涉及底物結(jié)合和催化)[15]。X結(jié)構(gòu)域非常保守，存在于細(xì)菌、動(dòng)物和植物中。X結(jié)構(gòu)域中單個(gè)氨基酸的變化可以顯著影響PI-PLC的功能。

非生物脅迫包括干旱脅迫、低溫脅迫和鹽脅迫，是植物在其生長發(fā)育過程中常見的脅迫，可導(dǎo)致植物減產(chǎn)。在各種非生物脅迫下，PLC基因被轉(zhuǎn)錄激活說明該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶在植物適應(yīng)惡劣環(huán)境條件時(shí)的重要性。干旱脅迫誘導(dǎo)煙草NtPLC1、馬鈴薯StPLC1和StPLC2表達(dá)，此外，棉花GhNPC5和GhNPC9以及擬南芥的同源基因AtNPC1在高溫脅迫下被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，說明PLC基因在不同植物中具有相似的生理學(xué)功能，可通過系統(tǒng)進(jìn)化預(yù)測(cè)不同物種PLC蛋白質(zhì)功能。例如，OsPLC1和TaPLC1對(duì)鹽脅迫比較敏感，脅迫后PLC蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯上調(diào)，此外，提高玉米的耐旱性可通過過表達(dá)ZmPLC1蛋白[16-17]來實(shí)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)石柱參SzPLC1對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)出了良好的抗逆性，SzPLC1蛋白表達(dá)量隨著干旱脅迫時(shí)間的延長而呈上升趨勢(shì)，其中輕度干旱脅迫處理的SzPLC1蛋白的表達(dá)量明顯低于重度干旱脅迫處理，說明SzPLC1參與了多種細(xì)胞代謝過程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，具有抗干旱脅迫的作用。