靳化,趙勇,鐘建容,3,沈夢塵,陳蕾*
1安徽醫(yī)科大學海軍臨床學院,合肥 230032;2解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心婦產(chǎn)科,北京 100048;3華南理工大學醫(yī)學院,廣州 510006
根據(jù)WHO規(guī)定,夫婦未采取任何避孕措施同居生活1年以上,由于男方因素造成女方不孕者,稱為男性不育癥。研究表明,不孕不育的發(fā)病率約為15%,男女因素各占一半[1]。生殖系統(tǒng)感染、性功能障礙、免疫因素、染色體異常等均可導致男性不育癥的發(fā)生[2-5]。在遺傳學病因中,克氏綜合征(47,XXY)及Y染色體微缺失為主要原因,均可導致無精子癥、極嚴重少精子癥及嚴重少精子癥[6-7]。對就診的不育患者進行遺傳學篩查,有助于明確其是否患有導致不育的遺傳學疾病,對后續(xù)診療策略的制定以及輔助生殖方法的選擇至關重要[8]。本研究回顧性分析796例男性的染色體核型、Y染色體微缺失結果及其中部分男性的性激素檢測結果,以探討臨床診療中男性不育人群的遺傳學病因及性激素水平變化特征。
1.1 研究對象 回顧性分析2018年9月-2020年12月于解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心生殖中心就診的550例男性不育癥患者的臨床檢驗資料,其中無精子癥187例,少精子癥363例(極嚴重90例、嚴重101例、輕中度172例)。同時納入健康男性246名(即同期于我院行輔助生殖助孕,經(jīng)檢查無不育因素的男性)作為對照。所有男性禁欲2~7 d,通過自慰獲取精液標本,根據(jù)WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第五版)[9]進行精液分析,并根據(jù)精子濃度進行分級[10]。(1)無精子癥:連續(xù)3次精液及射精后的尿液經(jīng)離心后鏡檢未見精子;(2)極嚴重少精子癥:精子濃度<1×109/L;(3)嚴重少精子癥:精子濃度為(1~5)×109/L;(4)輕中度少精子癥:精子濃度為(5~15)×109/L;(5)正常:精子濃度>15×109/L。所有研究對象均進行染色體核型及Y染色體微缺失檢測。同時對納入此研究中的部分人群(無精子癥156例,極嚴重少精子癥70例,嚴重少精子癥75例,正常對照75例)進行性激素(促黃體生成素、卵泡刺激素、催乳素、睪酮)水平檢測。本研究獲解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心倫理委員會批準(HZKY-PJ-2021-46)。
1.2 檢測指標分析 染色體核型分析:采用GRQ帶技術檢測,根據(jù)《人類細胞遺傳學國際命名體制》描述染色體核型;分析染色體異常與精子濃度之間的關系。Y染色體微缺失情況檢測:使用人Y染色體無精子癥因子(azoospermia factor,AZF)區(qū)微缺失核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法,北京愛普益生物科技有限公司;Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀)檢測Y染色體AZFa、AZFb、AZFc 3個區(qū)域的缺失狀態(tài),每個區(qū)域分別以兩個序列標簽位點(sequence tag site,STS)為代表。AZFa區(qū):sY84和sY86;AZFb區(qū):sY127和sY134;AZFc區(qū):sY254和sY255。以SRY和β-actin位點為內參照,F(xiàn)AM、VIC、CY5為熒光基團;分析Y染色體微缺失在不同精子濃度人群中的發(fā)生情況。性激素4項檢測:使用化學發(fā)光法(UniCel DxI 800儀器及試劑盒均由美國貝克曼公司提供)進行檢測;分別比較不同精子濃度人群、有無Y染色體微缺失人群的性激素水平差異。
1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。定性資料以例(%)表示,組間比較采用χ2檢驗。定量資料不服從正態(tài)分布,均以M(Q1,Q3)表示,組間比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 染色體核型情況 550例不育癥患者及246例健康對照中共有62例染色體核型異?;蛘6鄳B(tài)性變化(62/796,7.8%)。其中無精子癥18例(18/187,9.6%),極嚴重少精子癥11例(11/90,12.2%),嚴重少精子癥5例(5/101,5.0%),輕中度少精子癥9例(9/172,5.2%),健康對照19例(19/246,7.7%)。不育癥患者染色體異常發(fā)生率為4.0%(22/550),健康對照為2.4%(6/246),差異無統(tǒng)計學意義。所有男性中常染色體異常15例(15/796,1.9%),其中羅伯遜易位5例,平衡易位6例,倒位3例,多一條標記染色體1例;常染色體正常多態(tài)性12例(12/796,1.5%);性染色體異常13例(13/796,1.6%),其中克氏綜合征8例(7例無精子癥及1例極嚴重少精子癥),超雄綜合征、46,XX男性綜合征、嵌合體、Y染色體雙著絲粒、Y染色體部分缺失各1例;性染色體正常多態(tài)性19例(19/796,2.4%);另外有3名男性為常染色體+性染色體正常多態(tài)性變化(3/796,0.4%)(表1)。
表1 男性不育癥患者及健康對照染色體核型分布(例)Tab.1 Chromosome karyotype of male infertile patients and normal people (n)
2.2 Y染色體微缺失情況 550例不育癥患者中,Y染色體微缺失者共38例(6.9%),其中無精子癥17例,極嚴重少精子癥18例,嚴重少精子癥2例,輕中度少精子癥1例;246例健康對照中未出現(xiàn)Y染色體微缺失;4例不育癥患者為染色體正常多態(tài)性+Y染色體微缺失,分別為46,XY,9qh+(1例)、46,XY,22ps+(1例)、46,XY,Yqh-(2例),其中前2例為無精子癥,后2例為極嚴重少精子癥;46,XY,9qh+為AZFb區(qū)缺失,其余為AZFc區(qū)缺失;1例不育癥患者為染色體異常+Y染色體微缺失,為46,XX、AZFabc區(qū)缺失(表2)。
表2 男性不育癥患者及健康對照Y染色體微缺失情況[例(%)]Tab.2 Y chromosome microdeletion in male infertile patients and normal people [n(%)]
2.3 性激素檢測結果
2.3.1 無精子癥、極嚴重少精子癥、嚴重少精子癥及健康對照的比較 四組的促黃體生成素(P=0.000)、卵泡刺激素(P=0.000)及睪酮(P=0.023)水平差異有統(tǒng)計學意義,但催乳素水平差異無統(tǒng)計學意義(表3)。
表3 男性不育癥患者及健康對照的性激素水平比較[M(Q1,Q3)]Tab.3 Comparison of sex hormone levels between male infertile patients and normal people [M(Q1, Q3)]
2.3.2 無精子癥、極嚴重少精子癥、嚴重少精子癥中有無Y染色體微缺失患者性激素水平比較 Y染色體微缺失組的卵泡刺激素水平明顯高于無Y染色體微缺失組(P=0.032),但兩組的促黃體生成素、催乳素、睪酮水平差異無統(tǒng)計學意義(表4)。
表4 男性不育癥有無Y染色體微缺失患者的性激素水平比較[M(Q1,Q3)]Tab.4 Sex hormone levels in male infertile patients with or without Y chromosome microdeletion [M(Q1, Q3)]
在眾多導致男性不育的因素中,染色體異常較為常見。既往研究顯示,無精子癥患者中染色體異常比例為14.30%~22.97%,在極嚴重及嚴重少精子癥患者中該比例為2.30%~3.87%[11-13]。本研究不育男性中染色體異常22例(22/550,4.0%)。其中無精子癥患者12例(12/187,6.4%),極嚴重少精子癥患者6例(6/90,6.7%),兩者染色體異常的發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.937)。與以往的研究相比,本研究人群染色體異常發(fā)生率偏低,可能為調查人群的選擇、種族、區(qū)域等原因導致。
導致男性不育癥的遺傳學因素包括克氏綜合征、Y染色體微缺失、先天性雙側輸精管缺失、低促性腺激素性性腺功能減退等[6]??耸暇C合征(47,XXY)在導致男性不育的遺傳學病因中占據(jù)重要地位,其主要表現(xiàn)包括性欲低下、小睪丸癥和不育癥等[6]。既往針對中國不育患者克氏綜合征的研究發(fā)現(xiàn),其在無精子癥中的發(fā)病率為6.56%~15.54%,重度少精子癥中為0.52%,少精子癥中為3.77%[11-12]。本研究中克氏綜合征共有8例(無精子癥7例,7/187,3.7%;極嚴重少精子癥1例,1/90,1.1%),發(fā)生率低于以往的研究數(shù)據(jù)。絕大部分的克氏綜合征患者表現(xiàn)為無精子癥[14],與本研究結果相符。本研究中8例克氏綜合征患者有7例(無精子癥6例、極嚴重少精子癥1例)選擇輔助生殖技術獲得后代,其中6例無精子癥患者因睪丸穿刺未見精子而選擇供精,極嚴重少精子癥患者通過卵泡漿內單精子顯微注射技術(ICSI)獲得后代。有研究結果顯示,部分因克氏綜合征導致無精子癥的患者可通過顯微取精方式獲得精子,繼而行ICSI獲得后代,但其胚胎染色體異常的發(fā)生率明顯增高[15-16]。因我中心診療手段有限,故本研究中的無精子癥患者僅行睪丸穿刺而未行顯微取精,但其有可能通過顯微取精方式獲得精子從而避免選擇供精獲得后代。
本研究中有一例男性核型為46,X,del(Y)(q11.23-qter),兩次精液檢測顯示精子密度分別為53.4×109/L、81×109/L,同時其Y染色體微缺失檢測結果未見異常,考慮缺失的Y染色體長臂片段可能易位于其他染色體上。
本研究的550例不育癥患者及246名健康男性中常染色體異常的發(fā)生率為1.9%,與性染色體異常的發(fā)生率(1.6%)比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.703)。在不育男性及正常對照人群中均出現(xiàn)羅伯遜易位及平衡易位,猜測此兩種核型可能與男性精子的產(chǎn)生無關。常染色體異常中有一例罕見的核型為47,XY,+mar的患者,表現(xiàn)為嚴重少精子癥,目前尚不清楚該異常(多一條標記染色體)是否會對生育力產(chǎn)生影響,對于此類核型尚需要收集更多臨床數(shù)據(jù)進行進一步研究。
1976年,Tiepolo等[17]第一次證實Y染色體長臂缺失與男性不育有關。隨后的研究發(fā)現(xiàn),Y染色體上存在AZFa、AZFb、AZFc 3個與精子產(chǎn)生有關的區(qū)域,每個區(qū)域在精子產(chǎn)生的不同時期均起著重要作用,不同的區(qū)域缺失呈現(xiàn)出不同的臨床表現(xiàn)和發(fā)生頻率[6,18-22]。Y染色體微缺失是導致男性不育的另一重要遺傳學因素[6]。既往在中國人群中的調查發(fā)現(xiàn),無精子癥和重度少精子癥(精子濃度<5×109/L)患者的Y染色體微缺失發(fā)生率分別為11.75%和8.51%[12]。本研究中Y染色體微缺失在無精子癥、極嚴重少精子癥及嚴重少精子癥患者中的發(fā)生率分別為9.1%、20.0%及2.0%,再次證實Y染色體微缺失與男性不育癥密切相關。
在本研究550例不育男性中,AZFc區(qū)缺失最為常見(6.2%,34/550),但AZFa、AZFb、AZFbc、AZFabc區(qū)缺失發(fā)生率無明顯差異,且這4種類型均表現(xiàn)為無精子癥,推測可能的原因為本研究是單中心研究且受研究人群的限制,使不同類型缺失的發(fā)生率未表現(xiàn)出明顯的差異。部分AZFc區(qū)缺失的患者可通過顯微取精的方式獲得精子,然后行ICSI以產(chǎn)生后代[23-24]。在本研究中已確診為Y染色體微缺失的患者中,有9例無精子癥患者因診療手段受限未行顯微取精,而是直接通過供精獲得后代(AZFa區(qū) 1例,AZFb區(qū) 1例,AZFc區(qū) 7例);有14例極嚴重少精子癥患者(AZFc區(qū))選擇ICSI方式獲得后代,但另有1例嚴重少精子癥患者(AZFc區(qū))選擇供精。
有研究表明,AZFc區(qū)缺失的患者其精液質量隨著年齡的增長逐漸變差[25],但本研究AZFc區(qū)缺失患者中表現(xiàn)為無精子癥的年齡為23~36歲,表現(xiàn)為極嚴重少精子癥或嚴重少精子癥的年齡為24~45歲,未表現(xiàn)出明顯的精液質量隨年齡增長而下降的趨勢,這可能是由于本研究中Y染色體微缺失患者較少,缺乏充足數(shù)據(jù)導致的。本研究發(fā)現(xiàn)有1例30歲的輕中度少精子癥(3次精液常規(guī)顯示精子濃度分別為10.2×109/L、12.4×109/L、14.4×109/L)患者表現(xiàn)為AZFc區(qū)缺失。根據(jù)既往對Y染色體微缺失患者精液質量與年齡之間的相關性研究結果,同時結合本研究中Y染色體微缺失患者所行的輔助生殖方法,臨床上應重視對輕中度少精子癥患者Y染色體微缺失的檢測,以便盡早發(fā)現(xiàn)陽性患者,從而選擇合適的治療方法。
目前的研究表明,克氏綜合征及Y染色體微缺失是導致男性出現(xiàn)嚴重少精子癥、極嚴重少精子癥甚至無精子癥的常見遺傳學病因[6]。本研究中的部分無精子癥、少精子癥患者染色體核型及Y染色體微缺失檢測均未見異常,但這并不能說明此類患者無其他遺傳學方面的病因。通過高通量測序及表觀遺傳學等方法,已有研究發(fā)現(xiàn)其他與男性不育相關的遺傳學因素如CFTR、ADGRG2、TEX11、SPINK2、TEX15、PKD1基因等[26]。故針對此類患者需要進行進一步的基因檢測以明確病因。
男性體內存在下丘腦-垂體-性腺軸調節(jié)性激素的水平及精子的生成。卵泡刺激素為男性體內一種重要的激素,可與曲細精管的支持細胞膜受體結合,促進性激素結合球蛋白及抑制素B的生成,影響精子的產(chǎn)生,同時抑制素B也對FSH水平起反饋作用[27]。既往針對Y染色體微缺失患者性激素水平的研究發(fā)現(xiàn),Y染色體上AZF位點的缺失可對精子的產(chǎn)生造成影響,從而導致抑制素B水平降低,而抑制素B則通過負反饋作用導致卵泡刺激素水平升高;對于無Y染色體微缺失的不育癥患者,也會出現(xiàn)因精子產(chǎn)生障礙而導致的抑制素B水平降低、卵泡刺激素水平升高現(xiàn)象;但與無Y染色體微缺失的患者相比,Y染色體微缺失患者的抑制素B水平更低[28-29]。本研究中Y染色體微缺失患者的卵泡刺激素水平明顯高于無Y染色體微缺失的患者,與既往研究結果一致。但因本院未對男性不育患者常規(guī)開展抑制素B的檢測,故本研究人群的抑制素B與卵泡刺激素水平之間的關系無法驗證。
綜上所述,在行輔助生殖助孕的男性不育患者中進行遺傳學篩查,有助于發(fā)現(xiàn)潛在的不育原因,從而明確診斷,且對后續(xù)治療方法的選擇具有重要意義。