CDC20基因的表達(dá)對前列腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的影響

石峰，孫文功，劉增振，王曉輝，孟慶澤*

1聯(lián)勤保障部隊(duì)第988醫(yī)院泌尿外科，鄭州 450000；2河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南洛陽 471000

前列腺癌(prostate cancer，PC)是男性最常見的惡性腫瘤，也是全球男性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，在我國的發(fā)病率僅次于膀胱癌和腎癌，排名第三[1-2]。PC為年齡相關(guān)性疾病[3-4]，隨著我國人口老齡化的加劇，其發(fā)病率有所增高[5]。目前PC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍不清楚[6]，在PC發(fā)生過程中細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的改變可能是促進(jìn)癌癥形成的重要標(biāo)志[7]。作為細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)節(jié)劑，細(xì)胞分裂周期20(cell division cycle 20，CDC20)是細(xì)胞周期后期促進(jìn)復(fù)合物/環(huán)體相互作用的調(diào)節(jié)蛋白，與啟動有絲分裂有關(guān)[8]。CDC20可在有絲分裂的中期至后期，通過破壞關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)控因子發(fā)揮致癌作用[9]。CDC20水平異?；蚬δ苷系K可消除有絲分裂停滯，促進(jìn)活化蛋白早熟，導(dǎo)致子代細(xì)胞發(fā)生非整倍性變化[10]。多項(xiàng)研究顯示，CDC20表達(dá)增加與多種人類癌癥的不良病理特征及預(yù)后有關(guān)[11-13]。目前有研究顯示，CDC20在PC中表達(dá)失調(diào)，參與了PC的進(jìn)展[14-15]，但其對預(yù)后的影響報(bào)道較少。本研究分析CDC20在PC中的表達(dá)及對PC患者臨床病理特征和預(yù)后的影響，以期為PC的預(yù)后判斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為前瞻性研究。納入2016年1月-2018年12月在聯(lián)勤保障部隊(duì)第988醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的134例PC患者(年齡48~72歲)及134例良性前列腺增生患者(年齡45~74歲)。PC患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理確診為PC；(2)首次確診，術(shù)前未經(jīng)放化療治療；(3)接受前列腺癌根治術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并嚴(yán)重肝腎功能障礙；(3)合并凝血功能異常。良性前列腺增生患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診為前列腺增生；(2)接受前列腺切除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能障礙、凝血功能異常。收集手術(shù)切除的PC組織及良性前列腺增生組織，于-80 ℃冰箱備存?；颊咝g(shù)后定期電話隨訪，隨訪時(shí)間8~36個(gè)月，隨訪截止日期為2020年12月1日，根據(jù)隨訪結(jié)果計(jì)算術(shù)后3年生存率。本研究經(jīng)過聯(lián)勤保障部隊(duì)第988醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(201501005)，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測CDC20 mRNA表達(dá)水平 利用TRizol試劑提取PC組織和良性前列腺增生組織的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測樣品的濃度及純度，合格后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒說明書步驟操作，總反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。CDC20引物：上游5‘-GTAGCTCCTGAGTGACGTGT-3‘，下游5‘-TGGTGCCAGCGCTCTAAGCT-3‘；GAPDH引物：上游5‘-CGTACTTGCTAAGCTTTCGTTTCGAT-3‘，下游5‘-CCGTATGCTGTAACTGTTCCGTGT-3‘。以管家基因U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算CDC20 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.2 Western blotting檢測CDC20蛋白表達(dá)水平利用蛋白提取試劑盒提取PC組織和良性前列腺增生組織的總蛋白，BCA蛋白定量，取30 μg蛋白行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用1% BSA室溫封閉2 h，加入抗CDC20鼠單克隆抗體、抗β-actin鼠單克隆抗體(1:1000，英國Abcam公司)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次；加入羊抗鼠抗體(1:4000，英國Abcam公司)室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加入化學(xué)發(fā)光顯色液顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.3 免疫組化檢測CDC20的表達(dá) 制備PC組織和良性前列腺增生組織切片，脫蠟、梯度乙醇水化，采用PV6000法染色，3% H2O2滅活內(nèi)源性酶；置于檸檬酸鹽修復(fù)液中，加熱修復(fù)抗原，然后自然冷卻、水洗；封閉后，滴加抗CDC20鼠單克隆抗體(1:200，英國Acbam公司)4 ℃孵育過夜；PBS沖洗，滴加羊抗鼠抗體(1:400，英國Abcam公司)室溫孵育1 h，PBS沖洗3次；滴加顯色液，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。

染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：陰性(0分)、弱陽性(1分)、中等陽性(2分)、強(qiáng)陽性(3分)。陽性細(xì)胞數(shù)評分：少于5%(0分)、5%~25%(1分)、26%~50%(2分)、51%~75%(3分)、76%~100%(4分)。總分=染色強(qiáng)度評分×陽性細(xì)胞數(shù)評分，其中0~7分設(shè)為CDC20低表達(dá)組，8~12分設(shè)為CDC20高表達(dá)組。比較兩組年齡、血清總前列腺特異性抗原(tPSA)、Gleason評分、cT分期、T分期和骨轉(zhuǎn)移等一般資料。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布和方差齊性的計(jì)量資料以表示，組間比較采用成組或配對t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制疾病無進(jìn)展生存和總生存曲線，Logrank法比較不同組間的生存率，Cox回歸分析患者術(shù)后生存的危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PC組織與良性前列腺增生組織中CDC20 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 PC組織中CDC20 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平高于良性前列腺增生組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(mRNA：1.96±0.34vs.0.37±0.12，t=3.254，P=0.003；蛋白：1.02±0.08vs.0.15±0.06，t=7.526，P＜0.001，圖1)。

圖1 PC組織和良性前列腺增生組織中CDC20 mRNA (A)和蛋白(B)相對表達(dá)水平(僅示18例患者的檢測結(jié)果)Fig.1 CDC20 mRNA (A) and protein (B) expression levels in PC tissues and benign prostate hyperplasia tissues (only the results of 18 patients were shown)

2.2 PC組織和良性前列腺增生組織中CDC20表達(dá)情況 免疫組化檢測結(jié)果顯示，PC組織中CDC20陽性表達(dá)率和高表達(dá)率高于良性前列腺增生組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[CDC20陽性表達(dá)率：80.6%(108/134)vs.8.9%(12/134)，χ2=139.070，P＜0.001；CDC20高表達(dá)率：51.5%(69/134)vs.0.0%(0/134)，χ2=92.925，P＜0.001，圖2]。

圖2 CDC20在PC組織和良性前列腺增生組織中的表達(dá)(免疫組化×200)Fig.2 CDC20 expression in PC tissues and benign prostate hyperplasia tissues (Immunohistochemistry ×200)

2.3 CDC20表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 依據(jù)免疫組化評分，將134例PC患者分為CDC20低表達(dá)組(n=65)與CDC20高表達(dá)組(n=69)。CDC20表達(dá)與PC患者年齡無關(guān)(P＞0.05)，而與血清tPSA、Gleason評分、cT分期、T分期和骨轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05，表1)。

表1 CDC20表達(dá)與PC患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]Tab.1 Relationship of CDC20 expression to the clinicopathological characteristics of PC patients [n(%)]

2.4 CDC20表達(dá)對術(shù)后3年存活率的影響 CDC20高表達(dá)組術(shù)后3年總生存率、疾病無進(jìn)展生存率低于CDC20低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[3年總生存率：69.6%(48/69)vs.87.7%(57/65)，χ2=6.366，P=0.012；3年疾病無進(jìn)展生存率：62.3%(43/69)vs.80.0%(52/65)，χ2=5.448，P=0.020，圖3]。

圖3 CDC20表達(dá)對PC患者術(shù)后3年存活率的影響Fig.3 Effect of CDC20 expression on the 3-year survival rate of PC patients after surgery

2.5 影響術(shù)后生存的危險(xiǎn)因素分析 Cox單因素分析結(jié)果顯示，血清tPSA、Gleason評分、cT分期、T分期和CDC20表達(dá)是影響PC患者術(shù)后生存的危險(xiǎn)因素(P＜0.05)。將以上因素納入Cox多因素回歸模型，結(jié)果顯示，Gleason評分＞7分、cT分期＞cT2c期、T分期＞T2期和CDC20免疫組化評分≥8分是影響PC患者術(shù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05，表2)。

表2 影響PC患者術(shù)后生存的危險(xiǎn)因素分析Tab.2 Analysis of the risk factors affecting survival of PC patients after surgery

3 討 論

隨著人口老齡化的加劇，PC發(fā)病率呈逐漸增高趨勢。大多數(shù)PC患者可接受根治性前列腺切除術(shù)，然而術(shù)后約30%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，其中大部分會發(fā)生遠(yuǎn)處或局部轉(zhuǎn)移[16]，要準(zhǔn)確預(yù)測其預(yù)后仍存在一定困難，亟需尋找新的生物標(biāo)志物以預(yù)測PC的預(yù)后并揭示PC的治療目標(biāo)。腫瘤組織中的生物標(biāo)志物在PC患者的臨床管理中，尤其是在監(jiān)測疾病預(yù)后和治療靶標(biāo)選擇方面具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。1973

年，CDC20在酵母中首次被發(fā)現(xiàn)，最初認(rèn)為其作用主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程[17]。已鑒定的CDC20底物包括細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白A、Securin、Geminin和p21等參與有絲分裂過程的因子[18]。有研究顯示，CDC20具有致癌作用，可能成為抗腫瘤治療的靶點(diǎn)[19]。但目前CDC20在PC中的表達(dá)情況及對患者預(yù)后的影響尚未明確。

癌癥基因組圖譜和病理分析結(jié)果顯示，CDC20異常上調(diào)與各種類型的癌癥密切相關(guān)，與癌癥患者標(biāo)本中的正常上皮細(xì)胞和鄰近正常組織相比，乳腺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中CDC20呈過表達(dá)[20-22]。本研究收集了134例PC組織和134例良性前列腺增生組織，免疫組化染色結(jié)果顯示，PC組織中CDC20陽性表達(dá)率為80.6%，高表達(dá)率為51.5%，明顯高于良性前列腺增生組織；qRT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，PC組織中CDC20 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平高于良性前列腺增生組織，與免疫組化檢測結(jié)果一致，提示CDC20高表達(dá)可能參與了PC的發(fā)生和發(fā)展。CDC20高表達(dá)在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，如Tang等[22]發(fā)現(xiàn)，CDC20在細(xì)胞周期途徑、DNA復(fù)制途徑、同源重組途徑和P53信號傳導(dǎo)途徑中較為活躍，其高表達(dá)與乳腺癌晚期腫瘤等級和預(yù)后不良相關(guān)。CDC20表達(dá)上調(diào)與胃癌的侵襲性[22]和原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌[23]的進(jìn)展及預(yù)后不良有關(guān)。此外，在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的肝組織中檢測到CDC20表達(dá)增加[24]。本研究結(jié)果顯示，PC組織中CDC20表達(dá)與血清tPSA、Gleason評分、cT分期、T分期和骨轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明在tPSA≥20 μg/L、Gleason評分＞7分、cT分期＞cT2c、T分期T3~T4期和骨轉(zhuǎn)移患者中CDC20表達(dá)水平較高，提示CDC20與PC進(jìn)展有關(guān)。CDC20高表達(dá)患者術(shù)后3年總生存率和疾病無進(jìn)展生存率均較低，且CDC20高表達(dá)是影響患者術(shù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示CDC20可能是評價(jià)PC預(yù)后的有效標(biāo)志物。有研究顯示，CDC20與PC的惡性進(jìn)展相關(guān)，CDC20高表達(dá)患者更具有侵襲性的臨床病理特征且預(yù)后不良[15]，本研究結(jié)果與之一致。

阻斷有絲分裂進(jìn)程是誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的有效方法之一，抑制有絲分裂過程中的有絲分裂檢查點(diǎn)、微管聚合、染色單體分離、胞質(zhì)分裂和有絲分裂退出等步驟，已被認(rèn)為是研發(fā)抗有絲分裂藥物的重要方向[25]。CDC20-APC/C在控制染色單體分離和有絲分裂退出方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，應(yīng)用有效的CDC20-APC/C抑制劑或研發(fā)針對CDC20的抑制劑，通過抑制有絲分裂治療癌癥為目前的研究提供了新思路。對于CDC20高表達(dá)的PC患者接受CDC20抑制劑是否可改善預(yù)后仍需深入研究。本研究僅描述了CDC20在PC組織中的表達(dá)及對患者臨床病理特征和預(yù)后的影響，其在PC中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，CDC20在PC組織中表達(dá)增加，可能參與了腫瘤的進(jìn)展。CDC20免疫組化評分≥8分提示患者預(yù)后不良，有望成為判斷PC預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。