牛奶蛋白過(guò)敏癥患兒血清IgE及淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定及意義

黃婉文 邸曉華 郭淑雯 郭笑芳 袁慧珍★

牛奶蛋白過(guò)敏癥（cow's milk protein allergy，CMPA）為兒童常見(jiàn)的一種變態(tài)反應(yīng)性疾病，是指機(jī)體攝入牛奶蛋白質(zhì)后產(chǎn)生一系列的有害免疫［1］。其中，牛奶中蛋白質(zhì)以β 乳球蛋白、γ 球蛋白、乳白蛋白、酪蛋白四種為主，嬰幼兒致敏原又以β 乳球蛋白和酪蛋白多見(jiàn)。當(dāng)這些過(guò)敏原進(jìn)入患兒機(jī)體中，可通過(guò)IgE 介導(dǎo)激活肥大細(xì)胞致敏，且釋放大量的5-羥色胺、緩激肽等物質(zhì)，引起消化系統(tǒng)等臨床表現(xiàn)，譬如惡心、嘔吐、腹瀉等；另外，皮膚上可表現(xiàn)出濕疹、蕁麻疹、皮膚瘙癢及面部、唇部水腫等［2］。嚴(yán)重者可引起致敏喉水腫、窒息及過(guò)敏性休克。目前CMPA 病因相對(duì)復(fù)雜，T、B 淋巴細(xì)胞功能紊亂，尤其是以Th2 為主導(dǎo)的免疫應(yīng)答，參與了CMPA 的發(fā)生發(fā)展。本研究通過(guò)檢測(cè)血清IgE 及淋巴細(xì)胞亞群在CMPA 患兒中的表達(dá)，探討其在CMPA 發(fā)病中的作用，為臨床診治提供依據(jù)。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

分析2018年5月2020年5月東莞市人民醫(yī)院診治的64 例CMPA 患兒，其中男性30 例（46.88%）、女性34 例（53.13%）；年齡（3.25±1.26）歲。選取同期38 例健康體檢兒童的臨床資料。其中男性19 例（50.00%）、女性19 例（50.00%）；年齡（3.32±1.18）歲；兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有入組者監(jiān)護(hù)人均知情并簽署同意書(shū)。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合嬰幼兒牛奶蛋白過(guò)敏國(guó)內(nèi)外指南解讀［3］中關(guān)于CMPA 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)皮膚點(diǎn)穿刺試驗(yàn)、食物激發(fā)試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料完整；②年齡1～6 歲；③無(wú)藥物性過(guò)敏。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有感染性疾??；②伴檢測(cè)前1 周服用過(guò)抗組胺類(lèi)藥物；③接受本次研究前一周服用影響IgE、淋巴細(xì)胞亞群等生化指標(biāo)藥物。本研究符合《赫爾辛基宣言》的倫理審查。

1.2 檢測(cè)方法

于空腹?fàn)顟B(tài)下抽取受試者3 mL 靜脈血兩份置于EDTA-K2 抗凝管內(nèi)，1 份離心處理后取上清液待檢，1 份全血標(biāo)本分離淋巴細(xì)胞棄上清液待檢。其中，采用Beckman-coulter lmmage800 特種蛋白分析儀檢測(cè)血清免疫球蛋白（IgE、IgG、IgA、IgM）和補(bǔ)體（C3、C4），選擇免疫比濁法定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定，四川邁克生物科技股份有限公司提供。采用流式細(xì)胞儀BD FACSCalibur 及BD 配套試劑檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群，包括CD3+、CD3+CD8+、CD3+/CD19+、CD19+CD23+、CD19+。結(jié)果由MultiSET及CellQuest Pro 軟件分析獲得。

1.3 觀察指標(biāo)

①兩組IgE、IgG、IgA、IgM、C3、C4、CD3+、CD3+CD8+、CD3+/CD19+、CD19+CD23+表達(dá)。②血清IgE 與淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性。③評(píng)估IgE、CD3+、CD3+CD8+、CD3+/CD19+、CD19+CD23+診斷CMPA 的AUC值、敏感度、特異度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件分析本次數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（）表示，行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；分類(lèi)變量以例數(shù)和百分率用n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；血清IgE 與淋巴細(xì)胞亞群（CD3+、CD3+CD8+、CD3+/CD19+、CD19+CD23+、CD19+）相關(guān)性采用Pearson 法分析；IgE、CD3+、CD3+CD8+、CD3+/CD19+、CD19+CD23+、CD19+診斷CMPA價(jià)值采用ROC曲線分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組免疫球蛋白比較

過(guò)敏癥組的IgE、IgG 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組IgA、IgM、C3、C4 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組免疫球蛋白比較（±s）Table 1 Comparison of two groups of immunoglobulins（±s）

表1 兩組免疫球蛋白比較（±s）Table 1 Comparison of two groups of immunoglobulins（±s）

組別過(guò)敏癥組對(duì)照組t 值P 值n 64 38 IgE（g/L）165.02±46.32 48.52±15.25 15.003＜0.001 IgG（g/L）9.05±2.12 8.25±1.85 2.026 0.045 IgA（g/L）0.78±0.15 0.83±0.18 1.509 0.134 IgM（g/L）1.31±0.41 1.24±0.23 0.965 0.337 C3（g/L）0.99±0.15 1.02±0.21 0.839 0.404 C4（g/L）0.23±0.07 0.21±0.05 1.542 0.126

2.2 兩組淋巴細(xì)胞亞群比較

過(guò)敏癥組的CD3+、CD3+CD8+低于對(duì)照組，而CD3+/CD19+、CD19+CD23+、CD19+高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組淋巴細(xì)胞亞群比較（±s）Table 2 Comparison of lymphocyte subsets between the two groups（±s）

表2 兩組淋巴細(xì)胞亞群比較（±s）Table 2 Comparison of lymphocyte subsets between the two groups（±s）

組別過(guò)敏癥組對(duì)照組t 值P 值n 64 38 CD3+（%）49.23±12.02 64.28±17.32 5.17＜0.001 CD3+CD8+（%）18.92±6.25 29.55±8.65 7.178＜0.001 CD3+/CD19+（%）19.71±8.02 12.25±4.32 5.289＜0.001 CD19+CD23+（%）12.32±4.10 3.55±1.46 12.695＜0.001 CD19+（%）15.23±2.05 10.39±1.11 13.415＜0.001

2.3 相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析顯示，CD3+、CD3+CD8+與IgE呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001），CD3+/CD19+、CD19+、CD19+CD23+與IgE 呈正相關(guān)（P＜0.001）。見(jiàn)表3。

指標(biāo)CD3+CD3+CD8+CD3+/CD19+CD19+CD23+CD19+IgE r 值-0.303-0.389 0.588 0.759 0.785 P 值0.008＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 診斷效能分析

ROC 曲線分析顯示，IgE、CD3+、CD3+CD8+、CD3+/CD19+、CD19+CD23+、CD19+診斷CMPA 的AUC值分別為（0.997、0.741、0.752、0.805、0.998、0.960，P＜0.05）。依據(jù)AUC 及標(biāo)準(zhǔn)誤，采用Z檢驗(yàn)AUC差異，結(jié)果顯示，IgE 與CD3+AUC 比較，Z=4.618、P＜0.001；IgE 與CD3+CD8+AUC 比較，Z=4.53、P＜0.001；IgE 與CD3+/CD19+AUC 比較，Z=4.346、P＜0.001；IgE 與CD19+CD23+AUC 比較，Z=-0.277、P=1.218；IgE 與CD19+AUC 比較，Z=6.541、P＜0.001；敏感度分別為0.984、1.000、0.500、0.734、0.969、0.906；特異度分別為1.000、0.500、1.000、0.844、1.000、1.000。見(jiàn)表4、圖1～2。

圖1 CD3+/CD19+、CD19+CD23+及IgE 的ROC 曲線分析Figure 1 ROC curve analysis of CD3+/CD19+，CD19+CD23+and IgE

圖2 CD3+、CD3+CD8+的ROC 曲線分析Figure 2 ROC curve analysis of CD3+，CD3+CD8+

表4 血清IgE 與淋巴細(xì)胞亞群的診斷效能分析Table 4 Analysis of diagnostic efficacy of serum IgE and lymphocyte subsets

3 討論

經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)［4］，目前國(guó)內(nèi)嬰幼兒牛奶蛋白過(guò)敏患病率約為2.00%～7.50%。據(jù)報(bào)道［5］，CMPA 主要集中于2 歲以下兒童。且有研究指出［6］，CMPA 是影響嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素之一，若是得不到正常診治，約有二分之一的CMPA 患兒可發(fā)展至食物過(guò)敏。因此早期診治意義重大。目前臨床上對(duì)于牛奶蛋白等食物造成的過(guò)敏機(jī)制尚未完全闡明，僅認(rèn)為它的發(fā)生與機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)。譬如存在Th1/Th2 型免疫反應(yīng)失衡，當(dāng)Th2 反應(yīng)過(guò)強(qiáng)則會(huì)影響Th1，即導(dǎo)致其反應(yīng)受抑制。為了進(jìn)一步證實(shí)上述說(shuō)法的可靠性，本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CMPA 患兒與健康體檢兒的淋巴細(xì)胞亞群，結(jié)果顯示，過(guò)敏癥組的CD3+CD8+低于對(duì)照組，由此說(shuō)明過(guò)敏癥組患兒存在CD3+CD8+淋巴細(xì)胞抑制現(xiàn)象。經(jīng)分析可能與腸道內(nèi)可溶性抗原有關(guān)，能選擇性激活CD8+T 細(xì)胞抑制功能［7］。另外，在CD19+CD23+淋巴細(xì)胞百分比中，發(fā)現(xiàn)其在過(guò)敏癥組患兒中呈高表達(dá)。而CD19+CD23+為B 細(xì)胞表面標(biāo)志物，由此推測(cè)，B 細(xì)胞參與了機(jī)體分泌食物過(guò)敏原特異性抗體，繼而導(dǎo)致CMPA的發(fā)生［8］。

有研究表示［9］，T 淋巴細(xì)胞不僅參與了細(xì)胞免疫，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞參與多種免疫反應(yīng)。在研究中，過(guò)敏癥組的CD3+低于對(duì)照組，而CD3+/CD19+高于對(duì)照組。其中，CD3+含量代表著T 淋巴細(xì)胞水平。故本文認(rèn)為CD3+含量的下調(diào)與T 淋巴細(xì)胞免疫功能降低有關(guān)。而免疫功能的下降又會(huì)減弱B 細(xì)胞抑制作用，且使其大量產(chǎn)生IgE 抗體，成為CMPA 發(fā)病的關(guān)鍵［10］。而CD3+/CD19+為真正的B 淋巴細(xì)胞，其水平的升高表明B 細(xì)胞在機(jī)體分泌食物過(guò)敏原特異性抗體方面具有重要作用。血清過(guò)敏原特異性IgE 為臨床診斷變態(tài)反應(yīng)的特異指標(biāo)。在正常情況下，血清中IgE 含量較低，但當(dāng)IgE 抗體介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)時(shí)，則會(huì)引起高表達(dá)。在研究結(jié)果中可見(jiàn)，過(guò)敏癥組的IgE 高于對(duì)照組。經(jīng)分析可能是患兒在接觸過(guò)敏原后，會(huì)激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，形成一系列臨床表現(xiàn)，并且在機(jī)體免疫系統(tǒng)被激活后生成IgE 抗體，而該抗體又附著于肥大細(xì)胞上，能使機(jī)體更加敏感化，當(dāng)再次接觸類(lèi)似或相同過(guò)敏原后，則會(huì)從肥大細(xì)胞內(nèi)釋放大量的炎癥介質(zhì)，最終形成過(guò)敏反應(yīng)，導(dǎo)致血清IgE 上升，而IgE 的合成又與T 淋巴細(xì)胞密切相關(guān)，可能因細(xì)胞免疫是啟動(dòng)病理學(xué)過(guò)敏反應(yīng)的重要原因。也有學(xué)者指出，血清IgG 可作為評(píng)估食物過(guò)敏性疾病的有效指標(biāo)［11］。研究結(jié)果顯示，過(guò)敏癥組的IgG 表達(dá)量高于對(duì)照組，針對(duì)過(guò)敏癥組的IgG 表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)其波動(dòng)水平較小可能與IgG 介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)多屬遲發(fā)型有關(guān)，故早期測(cè)定IgG 水平，并沒(méi)有出現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)［12］。

基于血清IgE 及淋巴細(xì)胞亞群研究，本文發(fā)現(xiàn)兩者之間具有密切聯(lián)系。在Pearson 相關(guān)分析中顯示，CD3+、CD3+CD8+與IgE 呈負(fù)相關(guān)，CD3+/CD19+、CD19+CD23+、CD19+與IgE 呈正相關(guān)。提示過(guò)敏原致敏時(shí)能對(duì)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的比例及其功能造成不利影響［13］。針對(duì)其作用機(jī)制分析，可能是IgE抗體的生成和血清IgE 表達(dá)量的上調(diào)，會(huì)在一定程度上破壞T 淋巴細(xì)胞亞群的平衡，引起細(xì)胞免疫功能紊亂。同時(shí)CMPA 患兒多項(xiàng)免疫指標(biāo)的改變，也間接表示了嬰幼兒胃腸道免疫功能尚未發(fā)育成熟，故導(dǎo)致CMPA 多見(jiàn)于嬰幼兒及兒童［14-15］。因此本文認(rèn)為測(cè)定IgE、淋巴細(xì)胞亞群意義重大，有利于及時(shí)了解患兒免疫功能變化和特異性IgE抗體應(yīng)答情況。在ROC 曲線模型中可見(jiàn)，IgE、CD3+、CD3+CD8+、CD3+/CD19+、CD19+CD23+、CD19+的AUC 值分別為0.997、0.741、0.752、0.805、0.998、0.960，說(shuō)明上述指標(biāo)能為CMPA 診斷及治療提供依據(jù)。另外，針對(duì)CMPA，本文認(rèn)為除達(dá)到食物回避效果及保證營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)外，可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫是否能達(dá)到防治CMPA 的作用。但目前對(duì)于該說(shuō)法還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，血清IgE 在CMPA 患兒中呈高表達(dá)，其水平的上調(diào)會(huì)影響患兒機(jī)體免疫功能，因此檢測(cè)血清IgE 及淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)對(duì)掌握病情變化和指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。本研究不足：本研究為回顧性研究，且樣本量相對(duì)較少，可能存在一定偏差，尚需大樣本進(jìn)一步研究。