TGF-β、BMP-2及miR-672-5p與激素性股骨頭壞死的關(guān)系分析

徐丹 楊靜華 朱世華 徐紹勇 張萍

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femeral head，ONFH）作為一類常見骨關(guān)節(jié)疾患，亦屬于股骨頭負(fù)重區(qū)病理演變過程，患者在應(yīng)力狀態(tài)下可持續(xù)發(fā)生壞死骨骨小梁的結(jié)構(gòu)損傷及不完善修復(fù)，并引發(fā)其他病理改變［1-2］。ONFH 主要可分為創(chuàng)傷與非創(chuàng)傷性兩類，其中非創(chuàng)傷類以激素性股骨頭壞死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）較為常見，SANFH 發(fā)病主要與患者長期應(yīng)用激素造成脂肪栓塞、骨微細(xì)血管阻塞風(fēng)險(xiǎn)明顯上升有關(guān)［3-4］。SANFH 早期及時治療可取得良好效果，因該階段股骨頭壞死范圍較小，患者功能障礙程度較輕，確診后及時停止激素應(yīng)用并配合功能鍛煉可有效阻止病情惡化［5-6］，故及時診斷SANFH、評估病情極為必要。近年來相關(guān)研究指出，在SANFH 患者或模型大鼠中可見轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）及miR-672-5p 表達(dá)水平的異常改變［7］，本次研究將進(jìn)一步探究上述指標(biāo)與SANFH 的關(guān)系，現(xiàn)將所得成果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

分析2018年6月至2021年1月期間于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院行各項(xiàng)檢查的77 例疑似SANFH受檢者臨床資料，根據(jù)臨床診斷結(jié)果分為確診組52 例與未確診組25 例，根據(jù)SANFH 患者國際骨循環(huán)學(xué)會（association research circulation osseous，ARCO）股骨頭壞死程度分期［8］分為輕中度組（ARCO 分期屬0～Ⅱ期者）32 例與重度組（ARCO分期屬Ⅲ～Ⅳ期者）20 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①存在激素近期2 周以上激素應(yīng)用史，且于本院接受本次研究相關(guān)檢查；②受檢者年齡在18～75 歲之間；③確診患者均符合《成人股骨頭壞死臨床診療指南（2016）》中SANFH 相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在長期酗酒史；②存在惡性腫瘤者；③臨床資料保存不完整者。受檢者一般資料：男64 例，女13 例，平均年齡（51.68±8.63）歲。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過，受試者或家屬已簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

收集受檢者空腹外周靜脈血8 mL，3 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，分離血清。采用上海研生實(shí)業(yè)有限公司的TGF-β ELISA 檢測試劑盒測定TGF-β 水平，采用泉州市睿信生物科技有限公司的人BMP-2 ELISA 試劑盒測定BMP-2 水平。采用蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司的NEST 耐思RNA 提取試劑盒提取血清總RNA，采用上?？道噬锟萍加邢薰镜哪孓D(zhuǎn)錄熒光定量PCR 試劑盒實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄及PCR 擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATT TGCGT-3′，擴(kuò)增引物序列為：正向5′-TGAGGTTGGTGT ACTGTGTGGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，反向5′-GTGCAOGGTOOGAGGTCTCGCTTOGGCAGCACA-3′，反應(yīng)過程中以Gapdh 作為內(nèi)參，在95℃下初始變性10 min，在95℃下變性10 s，在55℃下退火30 s，行30 個循環(huán)，在72℃下擴(kuò)增35 s，行30 個循環(huán)，隨后采用2-△△Ct相對定量法確定miR-672-5p 表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，計(jì)量資料與等級資料的相關(guān)性評估采用Spearman相關(guān)性模型，預(yù)測效能采用ROC 曲線分析評估。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 確診組與未確診組TGF-β、BMP-2、miR-672-5p 表達(dá)水平比較

確診組TGF-β、BMP-2 水平低于未確診組，miR-672-5p 水平高于未確診組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 確診組與未確診組TGF-β、BMP-2、miR-672-5p 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of expression levels of TGF-β，BMP-2 and miR-672-5p between confirmed group and undiagnosed group（±s）

表1 確診組與未確診組TGF-β、BMP-2、miR-672-5p 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of expression levels of TGF-β，BMP-2 and miR-672-5p between confirmed group and undiagnosed group（±s）

組別確診組未確診組t 值P 值n 52 25 TGF-β（ng/mL）43.65±9.25 60.52±12.36 6.699＜0.001 BMP-2（pg/mL）116.05±17.26 145.26±13.29 7.456＜0.001 miR-672-5p 2.62±1.03 1.41±0.43 5.627＜0.001

2.2 TGF-β、BMP-2、miR-672-5p 診斷SANFH 的效能分析

TGF-β、BMP-2、miR-672-5p 診斷SANFH 的曲線AUC 分別為0.858、0.918、0.904，診斷效能良好（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 ROC 曲線參數(shù)Table 2 ROC curve parameters

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curves

2.3 輕中度組與重度組TGF-β、BMP-2、miR-672-5p 表達(dá)水平比較

重度組TGF-β、BMP-2 水平低于輕中度組，miR-672-5p 水平高于輕中度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 輕中度組與重度組TGF-β、BMP-2、miR-672-5p 表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Comparison of expression levels of TGF-β，BMP-2 and miR-672-5p between mild-to-moderate group and severe group（±s）

表3 輕中度組與重度組TGF-β、BMP-2、miR-672-5p 表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Comparison of expression levels of TGF-β，BMP-2 and miR-672-5p between mild-to-moderate group and severe group（±s）

組別重度組輕中度組t 值P 值n 20 32 TGF-β（ng/mL）36.39±6.26 48.19±7.25 6.007＜0.001 BMP-2（pg/mL）102.34±14.26 124.63±12.03 6.051＜0.001 miR-672-5p 3.40±1.01 2.14±0.71 5.864＜0.001

2.4 TGF-β、BMP-2、miR-672-5p 與SANFH 患者股骨頭壞死程度的相關(guān)性分析

Spearman 分析顯示，TGF-β、BMP-2 表達(dá)水平與SANFH 患者股骨頭壞死程度呈顯著負(fù)相關(guān)（r值=-0.685、-0.662，P＜0.05），miR-672-5p 表達(dá)水平與SANFH 患者股骨頭壞死程度呈顯著正相關(guān)（r值=0.739，P＜0.05）。

2.5 TGF-β、BMP-2、miR-672-5p 評估SANFH 患者股骨頭壞死程度的效能分析

TGF-β、BMP-2、miR-672-5p 評估SANFH 患者股骨頭壞死程度的ROC 曲線AUC 分別為0.769、0.826、0.775，診斷效能良好（P＜0.05）。見表4、圖2。

表4 ROC 曲線參數(shù)Table 4 ROC curve parameters

圖2 ROC 曲線Figure 2 ROC curves

3 討論

TGF-β 在骨組織、軟骨基質(zhì)及血小板中均含量豐富，參與細(xì)胞生長、分化的調(diào)節(jié)，亦可促進(jìn)骨生長及創(chuàng)傷修復(fù)［10-11］。TGF-β 在骨組織創(chuàng)傷后其局部表達(dá)水平上升，通過對成骨細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)促進(jìn)骨痂生長，同時抑制破骨細(xì)胞成熟，屬于骨組織重要調(diào)節(jié)因子；慢性股骨頭壞死過程患者骨組織自我修復(fù)能力不足，TGF-β 表達(dá)水平明顯降低［12］。BMP-2 作為一組高度保守的功能蛋白，其亦屬于TGF-β 家族，可通過對DNA 合成、細(xì)胞復(fù)制的刺激促使間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，屬于誘導(dǎo)機(jī)體骨形成的重要因子。賀鵬等［13］研究指出，在機(jī)體發(fā)生骨組織損傷后，BMP-2 表達(dá)水平可反映機(jī)體骨組織再生成能力。本次結(jié)果提示SANFH 患者自身骨生成能力較為低下，且隨著病變程度的加重其骨生成能力愈發(fā)低下。ROC 曲線證實(shí)，TGF-β、BMP-2 診斷SANFH 的曲線AUC 分別為0.858、0.918，評估患者股骨頭壞死程度的曲線AUC 分別為0.769、0.826，提示TGF-β、BMP-2對SANFH 診斷、程度評估表現(xiàn)出良好效能。分析其原因在于SANFH 患者因長期使用激素導(dǎo)致血液粘度異常改變，從而引起血液循環(huán)狀態(tài)變差，末梢循環(huán)狀態(tài)改變尤為明顯，使骨組織再生修復(fù)能力下降，而隨著患者關(guān)節(jié)功能的持續(xù)變差，其肌肉萎縮、骨質(zhì)脫鈣現(xiàn)象可進(jìn)一步加重，導(dǎo)致TGF-β、BMP-2 表達(dá)受到抑制，使SANFH 患者血管、骨組織再生修復(fù)能力進(jìn)一步下降。

激素應(yīng)用可引發(fā)股骨頭壞死的觀點(diǎn)自上世紀(jì)五十年代已提出，但SANFH 詳細(xì)發(fā)病機(jī)制目前仍未有定論。Meng 等學(xué)者［14］認(rèn)為SANFH 與局部微血栓形成、自身免疫紊亂、脂肪代謝異常、骨內(nèi)局部高壓、骨細(xì)胞凋亡等諸多原因有關(guān)，其中細(xì)胞凋亡屬于機(jī)體細(xì)胞終末結(jié)局重要表現(xiàn)形式，凋亡過程可經(jīng)外在或內(nèi)源性信號激活啟動，并在部分基因的調(diào)控作用下引發(fā)細(xì)胞程序性死亡。miRNA 作為機(jī)體中內(nèi)生小RNA，可參與多種細(xì)胞增殖、分化及凋亡過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能，在機(jī)體生長發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展中表現(xiàn)出重要調(diào)控作用。研究顯示，在接受激素干預(yù)的SANFH 大鼠模型中可見miR-672-5p 表達(dá)水平的異常上升，認(rèn)為miR-672-5p 表達(dá)情況與SANFH 模型激素用 量有關(guān)［15］。ROC 曲線分析證實(shí)，miR-672-5p 診斷SANFH 的曲線AUC 為0.872，評估股骨頭壞死程度的AUC 為0.775，提示miR-672-5p 在SANFH 診斷及病變程度評估中均可表現(xiàn)出良好效能。分析其原因在于SANFH 患者疾病形成過程中存在激素長時間過量應(yīng)用，機(jī)體骨細(xì)胞凋亡程序啟動頻繁，造成骨組織活性成分減少，miR-672-5p 表達(dá)水平上升；而激素用量直接關(guān)系血液循環(huán)狀態(tài)改變及骨細(xì)胞凋亡程序啟動，可上調(diào)miR-672-5p 表達(dá)，同時加劇SANFH 病變程度。

綜上所述，SANFH 患者病情程度與TGF-β、BMP-2、miR-672-5p 表達(dá)水平密切相關(guān)，后者可協(xié)助臨床SANFH 診斷、病情評估，具有較高臨床參考價(jià)值。