食管鱗狀細胞癌KIF4A、NEK2和CDC20的表達及臨床意義

劉艷嬌

食管鱗狀細胞癌（食管鱗癌）是常見的上消化道惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率逐年升高，中國食管癌的防控形勢尤其嚴峻［1］。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，食管鱗癌的生物學發(fā)病機制取得了一定進展，越來越多研究報道與食管鱗癌進展相關的基因和蛋白質［2］。筆者團隊前期通過分析食管鱗癌的基因芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)驅動蛋白超家族成員4A（kinesin family member 4A，KIF4A）、絲/蘇氨酸激酶NIMA相關激酶2（never-in-mitosis A-related kinase2，NEK2）、細胞分裂周期蛋白20（cell division cyclin 20，CDC20）、拓撲異構酶2（topoisomerase 2，TOP2A）等基因在食管鱗癌中上調表達［3］。KIF4A可參與染色體的凝集與分離、紡錘體形成及細胞內大分子運輸?shù)冗^程，研究表明，KIF4A 在肺癌［4］、乳腺癌［5］、結直腸癌［6］等多種癌癥中表達異常，但缺少食管鱗癌中KIF4A 表達及與臨床病理特征的相關研究。NEK2 是中心體相蛋白，可參與有絲分裂的調節(jié)［7］。CDC20 是細胞周期蛋白，在細胞有絲分裂中發(fā)揮關鍵作用，可促進染色體DNA 完成分裂復制和后期復合體/周期體的形成［8］。本研究分析食管鱗癌組織中KIF4A、NEK2 和CDC20 表達及臨床意義，以期為食管鱗癌的臨床評估提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月至2018年5月于邯鄲市第一醫(yī)院進行根治性手術治療的91 例食管鱗癌患者，男性68 例，女性23 例，平均年齡（58.32±9.65）歲，臨床分期：Ⅰ期11 例、Ⅱ期41 例、Ⅲ期39 例，分化程度：高分化14 例、中分化67 例、低分化10 例，存在淋巴結轉移43 例。本研究符合赫爾辛基宣言，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

納入標準：病理檢查確診為食管鱗癌［9］；年齡18～80 歲；接受根治性手術治療。排除標準：術前接受放化療等治療；合并其他惡性腫瘤；合并心肝腎等重要器官功能障礙；存在自身免疫系統(tǒng)疾病或全身感染性疾病；處于妊娠或哺乳期；精神行為異常者；不愿意配合隨訪者。

1.2 實時熒光定量PCR 檢測組織中KIF4A、NEK2和CDC20 mRNA 水平

術中取患者癌組織和癌旁組織（距癌組織3 cm），添加Trizol 試劑提取RNA，選取合格樣本使用逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒（日本TaKaRa），合成cDNA 模板鏈，再通過SYBR Green PCR Mastermix 試劑（瑞士Roche）進行實時熒光定量PCR 擴增。反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，共40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法，計算KIF4A、NEK2、CDC20mRNA 的相對表達水平。

1.3 免疫組化法檢測組織中KIF4A、NEK2 和CDC20 的表達

術中取患者癌組織和癌旁組織（距癌組織3 cm），制備石蠟組織切片，添加二甲苯脫蠟，使用梯度酒精水化，置于檸檬酸鹽緩沖液中高溫修復抗原，滴加3%過氧化氫溶液滅活內源性過氧化物酶，再添加非免疫血清封閉非特異性位點，分別與一抗KIF4A、NEK2、CDC20（美國Abcam，1∶100 倍稀釋比）4℃下反應過夜，次日經(jīng)磷酸緩沖液切片后，滴加生物素標記的二抗（上海碧云天生物技術有限公司），DAB 法顯色，蘇木素復染，光鏡下觀察染色情況。結果判讀采用雙盲法，以出現(xiàn)棕黃色為陽性染色，染色強度評分與染色范圍評分乘積為最終得分，其中染色強度評分［10］：無染色為0 分，弱染色1 分，中度染色為2分，強染色為3 分；染色范圍評分［10］：無陽性細胞為0 分，陽性細胞比例1%～25%為1 分，陽性細胞比例26%～50%為2 分，陽性細胞比例51%～75%為3 分，陽性細胞比例＞75%為4 分。將最終得分0～1 記為陰性表達，2～12 分記為陽性表達。

1.4 隨訪

術后對患者進行3年隨訪，時間截止至2021年5月31日，通過電話和門診的方式記錄患者生存狀況，術后第1年隨訪頻率為每個月1 次，第2年為每3 個月1 次，第3年為每半年1 次。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0 分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；采用卡普蘭-邁耶曲線（Kaplan-Meier）進行生存分析，生存期限比較采用Log-rankχ2法檢驗；采用Cox 回歸模型分析食管鱗癌患者預后的影響因素，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中KIF4A、NEK2和CDC20表達的比較

癌組織中KIF4A、NEK2和CDC20mRNA 水平及蛋白表達評分均高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 不同組織中KIF4A、NEK2 和CDC20 表達的比較（±s）Table 1 Comparison on the expressions of KIF4A，NEK2 and CDC20 in different tissues（±s）

表1 不同組織中KIF4A、NEK2 和CDC20 表達的比較（±s）Table 1 Comparison on the expressions of KIF4A，NEK2 and CDC20 in different tissues（±s）

組織癌組織癌旁組織t 值P 值n 91 91 KIF4A mRNA 1.83±0.21 1.00±0.13 32.058＜0.001蛋白評分（分）5.69±1.21 2.73±0.66 20.487＜0.001 NEK2 mRNA 1.62±0.18 1.00±0.11 28.037＜0.001蛋白評分（分）6.14±1.38 2.98±0.84 18.659＜0.001食管鱗癌組織mRNA 2.47±0.26 1.00±0.14 47.488＜0.001蛋白評分（分）6.83±1.57 3.25±0.72 19.772＜0.001

圖1 不同組織中KIF4A、NEK2 和CDC20 表達情況（SP，×200）Figure 1 Expressions of KIF4A，NEK2 and CDC20 in different tissues（SP，×200）

2.2 食管鱗癌組織中KIF4A、NEK2 和CDC20 表達與患者臨床病理特征的關系

不同年齡、性別和分化程度食管鱗癌組織中的KIF4A 表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而不同臨床分期和淋巴結轉移情況的KIF4A 表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同年齡、性別中的NEK2 和CDC20 表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而不同臨床分期、分化程度和淋巴結轉移情況的NEK2 和CDC20 表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 食管鱗癌組織中KIF4A、NEK2 和CDC20 表達與患者臨床病理特征的關系［n（%）］Table 2 The relationship between KIF4A，NEK2 and CDC20 in esophageal squamous cell carcinoma and clinicopathological characteristics of patients［n（%）］

2.3 食管鱗癌組織中KIF4A、NEK2 和CDC20 表達與患者預后的關系

截止隨訪時共獲取有明確生存狀況的患者91例，隨訪成功率為100%，其中存活58 例，死亡33例。Kaplan-Meier 生存曲線結果表明，KIF4A 陽性表達者3年生存率為54.90%、陰性表達者為75.00%，NEK2 陽性表達者3年生存率為55.36%、陰性表達者為77.14%，CDC20 陽性表達者3年生存率為56.92%、陰性表達者為80.77%。KIF4A、NEK2 和CDC20 陽性表達者生存時間分別短于KIF4A、NEK2 和CDC20 陰性表達者，差異有統(tǒng)計學意義（Log-rankχ2=4.601、4.942、4.587，P＜0.05）。見圖2。

圖2 食管鱗癌患者根據(jù)KIF4A、NEK2 和CDC20 表達分類的生存曲線Figure 2 Survival curves of patients with esophageal squamous cell carcinoma based on KIF4A，NEK2 and CDC20

2.4 食管鱗癌患者預后的影響因素分析

Cox 回歸分析顯示，低分化程度、存在淋巴結轉移及CDC20 陽性表達是影響食管鱗癌患者預后存活的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 Cox 分析食管鱗癌患者預后的影響因素Table 3 Influencing factors of prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma by Cox analysis

3 討論

食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展受多因素、多步驟、多階段及多基因的綜合影響，而細胞周期調控異常、細胞惡性增殖是腫瘤形成、進展的基礎前提。驅動蛋白超家族可為有絲分裂、減數(shù)分裂及細胞內組分運輸提供動力，KIF4A 作為其成員，其表達異?？梢鹩薪z分裂紊亂和非整倍性細胞的生成，這將誘使腫瘤的形成。Jin 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，沉默KIF4A 表達可抑制卵巢癌細胞活力、菌落形成和遷移能力，并顯著誘導細胞凋亡。Yoshiko 等［12］檢測KIF4A 在結直腸癌患者中的表達水平，發(fā)現(xiàn)KIF4A 在腫瘤組織中的表達水平高于非腫瘤組織，其表達與淋巴結轉移有關；體外細胞實驗也發(fā)現(xiàn)，敲低KIF4A 表達后結直腸癌細胞增殖能力降低。Zhang 等［13］通過生物信息學工具發(fā)現(xiàn)，KIF4A 在膽管癌組織中表達異常升高，并與患者總生存率顯著相關，還可預測患者對靶向免疫治療的反應。本研究結果顯示，KIF4A 在食管鱗癌組織中表達明顯高于癌旁組織，提示KIF4A 可能參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展。進一步分析其表達與患者臨床病理特征的關系，發(fā)現(xiàn)高臨床分期、發(fā)生淋巴結轉移患者KIF4A 表達分別高于低臨床分期、無淋巴結轉移者，說明KIF4A表達與食管鱗癌的侵襲轉移密切相關。Kaplan-Meier 生存分析顯示，KIF4A 陽性表達患者術后3年總生存率顯著低于KIF4A 陰性表達者。上述結果表明KIF4A 高表達可能在食管鱗癌的惡性進展中有重要作用，KIF4A 可作為食管鱗癌潛在的生物治療靶點，這與Li 等［14］研究結果基本相符。

中心體是動物細胞重要的細胞器，是有絲分裂時內部活動的中心，其功能異常將引起染色體分離不均，這也是誘發(fā)惡性腫瘤的因素之一。NEK2 主要分布于中心體，在有絲分裂過程中調節(jié)雙極紡錘體的形成和促進中心體的分離，異常的NEK2 表達將引起染色體的不穩(wěn)定性，導致腫瘤的發(fā)生。Xing 等［15］研究顯示，沉默NEK2 可在體外抑制乳腺癌細胞的增殖，并促進細胞凋亡。CDC20 對于維持細胞有絲分裂的正常進行有關鍵作用，主要在有絲分裂檢查點復合體中協(xié)助其催化整合。據(jù)報道，下調CDC20 表達可抑制骨肉瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡，并阻滯細胞周期［16］。本研究中發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織內NEK2 和CDC20均呈高表達，且不同臨床分期、分化程度和淋巴結轉移情況患者的NEK2 和CDC20 表達比較差異有統(tǒng)計學意義，表明NEK2 和CDC20 表達和食管鱗癌患者病理進展與轉移有明顯關聯(lián)，與既往研究結果［17］基本相符。預后分析中，NEK2 和CDC20陽性表達患者預后情況更差，且CDC20 陽性表達是食管鱗癌患者預后存活的獨立危險因素，說明NEK2 和CDC20 異常表達可運用于食管鱗癌患者臨床分期、分化程度、淋巴結轉移及預后等情況的輔助性參考評估，以提升食管鱗癌的臨床診療效率。

綜上所述，食管鱗癌患者癌組織中KIF4A、NEK2 和CDC20 陽性表達率異常升高，可為食管鱗癌病理狀態(tài)和預后判定提供參考。