CHB 并EBV 感染患者外周血單個核細胞中TLR4、TLR9表達及臨床意義

楊學文 張莉 高峰 嚴士海

慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）是由乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）慢性感染導致的常見消化系統(tǒng)疾病，HBV 在肝細胞內復制導致進步進展，調查表明全球CHB 患者超過2 億人，是肝硬化和肝細胞癌的重要誘因之一［1］。機體被HBV感染后產生慢性炎癥反應，能夠促進細胞增殖導致腫瘤的發(fā)生，同時增加機體被EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染的風險［2］。EBV 是一種皰疹病毒，以侵犯人體皮膚及淋巴組織為主，研究發(fā)現(xiàn)EBV 還能夠加重肝臟損傷，促進腫瘤生長和形成［3］。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLRs）在機體固有免疫中發(fā)揮重要作用，其中TLR4、TLR9 等分子以多種方式調控調節(jié)性T 細胞（Regulatory T cells，Treg）的功能，維持機體免疫耐受，阻止排異反應的發(fā)生［4］，與感染、自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)生相關［5］，研究發(fā)現(xiàn)Treg 細胞中TLRs 表達水平明更高。當前的研究對TLR4、TLR9 在CHB 合并EBV感染患者外周血單個核細胞中的表達及作用尚不完全明確，本研究TLR4、TLR9 對CHB 合并EBV 感染患者肝功能相關指標及患者預后的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年3月至2020年3月江蘇省中醫(yī)院收治的54 例CHB 合并EBV 感染患者作為研究對象，CHB 診斷依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［6］、EBV 感染診斷依據(jù)《EB 病毒感染實驗室診斷及臨床應用專家共識》［7］。納入標準：①患者經檢查確診為CHB 合并EBV 感染，且持續(xù)時間≥6 個月；②初診患者，未接受抗病毒及免疫抑制劑治療；③患者狀況良好，依從性好，未合并惡性腫瘤、自身免疫疾病及精神神經疾??；④患者臨床資料完整。排除標準：①患者經診斷為甲型肝炎、丙型肝炎等其他疾?。虎诨颊吆喜盒阅[瘤、重要臟器功能損傷；③患者入院前6 個月接受過免疫抑制劑治療。另選取本院同期收治的25 例CHB 未合并EBV 感染患者作為對照組1，25 例僅感染EVB 患者作為對照組2。其中，研究組中男性37 例、女性17 例，平均年齡（48.29±10.12）歲；對照組1 男性16 例、女性9 例，平均年齡（49.25±8.13）歲；對照組2 男性17 例、女性8 例，平均年齡（50.34±9.24）歲。三組患者一般資料均衡可比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究所有患者及家屬均簽署對研究知情同意書，研究經院倫理委員會審核并通過。

1.2 方法

1.2.1 HBV 與EBV 感染的檢測方法

患者入院后進行血清學檢測，檢測指標包括乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）、乙肝病毒表面抗體（Hepatitis B virus surface antibody，HBsAb）、乙肝病毒E 抗原（HBeAg）、乙肝病毒E 抗體（Hepatitis B virus E antigen，HBe-Ab）、乙肝病毒核心抗體（HBV core antibody，HBcAb）。HBsAg 陽性患者即可診斷為HBV 患者。通過血常規(guī)檢查確認患者感染EB 病毒的情況。當異型淋巴細胞超過10%、嗜異凝集試驗為陽性、抗EB 病毒載體VCA-IgM 為陽性時，即可確診為EB 病毒感染。

1.2.2 肝功能相關指標檢測

采用AU5800 全自動生化分析儀系統(tǒng)（美國BECKMAN COULTER 公司）檢測患者血肝功能相關指標水平，包括丙氨酸轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（Total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（Direct bilirubin，DBIL）、間接膽紅素（Indirect bilirubin，IBIL）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）。

1.2.3 流式細胞術檢測外周血單個核細胞TLR4、TLR9 表達情況

患者入組后次日清晨空腹采集靜脈血5 mL于肝素抗凝管中，進行計數(shù)后加入紅細胞裂解液（R1010 紅細胞裂解液，北京Solarbio 科技有限公司）避光靜置，1 200 g 離心10 min 收集沉淀，離心半徑10 cm，加入磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer salin，PBS，北京中杉金橋生物公司）洗滌兩次，加入TLR4-PE 抗體和TLR9-FITC 抗體（英國Abcam 公司），充分混勻，避光孵育30 min，PBS洗滌后采用Attune NxT 流式細胞儀（美國Thermo Fisher 公司）檢測單個核細胞TLR4、TLR9 陽性表達情況。

1.2.4 患者預后情況

將研究組所有患者根據(jù)TLR4、TLR9 陽性表達率中位數(shù)分為高表達組和低表達組，采用電話、微信、門診等方式進行隨訪，隨訪間隔三個月，截至2021年6月，隨訪時間共15 個月，將CHB 發(fā)展為肝硬化及肝細胞癌定義為疾病進展，研究CHB合并EBV 感染患者外周血單個核細胞TLR4、TLR9 表達情況與疾病進展的關系。將54 例研究組患者按照TLR4、TLR9 陽性表達率中位數(shù)（47.25%）、（44.82%）分別分為高表達組和低表達組，TLR4 高表達患者發(fā)生疾病進展16 例，低表達患者發(fā)生疾病進展7 例。

1.3 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析；符合正態(tài)分布的計量資料采用（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，用χ2檢驗；采用Spearman 分析數(shù)據(jù)間相關性；Kaplan-Meier 生存曲線對比兩組患者生存情況；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3 組患者外周血單個核細胞TLR4、TLR9 表達情況

研究組患者外周血單個核細胞TLR4、TLR9陽性表達情況明顯高于兩組對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組患者外周血單個核細胞TLR4、TLR9表達情況（±s）Table 1 TLR4 and TLR9 in peripheral blood mononuclear cells of the three groups of patients（±s）

表1 3組患者外周血單個核細胞TLR4、TLR9表達情況（±s）Table 1 TLR4 and TLR9 in peripheral blood mononuclear cells of the three groups of patients（±s）

注：與對照組1 比較，aP＜0.05；與對照組2 比較，bP＜0.05。

組別研究組對照組1對照組2 F 值P 值n 54 25 25 TLR4（%）58.29±8.77ab 50.34±7.53 23.13±3.47 12.325＜0.001 TLR9（%）52.94±5.49ab 44.16±5.13 18.27±2.05 18.723＜0.001

2.2 3 組患者肝功能指標比較

研究組患者血ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL、ALP 水平均明顯高于兩組對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3 組患者肝功能相關指標比較（±s）Table 2 Comparison of related indexes of liver function among three groups（±s）

表2 3 組患者肝功能相關指標比較（±s）Table 2 Comparison of related indexes of liver function among three groups（±s）

注：與對照組1 比較，aP＜0.05）；與對照組2 比較，bP＜0.05。

組別研究組對照組1對照組2 F 值P 值n 54 25 25 ALT（U/L）196.47±40.26ab 117.32±29.74 65.78±14.32 14.077＜0.001 AST（U/L）198.26±41.33ab 108.69±34.16 59.29±12.73 19.728＜0.001 TBIL（μmol/L）60.39±15.88ab 32.52±10.87 18.24±4.12 14.775＜0.001 DBIL（μmol/L）40.53±9.17ab 24.28±7.02 25.34±6.75 16.539＜0.001 IBIL（μmol/L）25.16±5.22ab 13.64±4.03 7.26±1.45 12.199＜0.001 ALP（U/L）106.53±20.46ab 73.54±16.78 69.81±15.62 12.594＜0.001

2.3 單個核細胞TLR4、TLR9 水平與肝功能指標的相關性

相關性分析結果顯示患者外周血單個核細胞TLR4 陽性表達與血TBIL、IBIL 水平無相關性（P＞0.05），但和血ALT、AST、DBIL 及ALP 水平呈正相關（P＜0.05）；單個核細胞TLR9 陽性表達與血TBIL、DBIL 水平無相關性（P＞0.05），但和血ALT、AST、IBIL 及ALP 水平呈正相關（P＜0.05）。見表3。

表3 單個核細胞TLR4、TLR9 水平與肝功能指標的相關性Table 3 Correlation between TLR4 and TLR9 levels of mononuclear cells and liver function indicators

2.4 TLR4、TLR9 表達與患者疾病進展的關系

TLR4、TLR9 高表達患者疾病進展率高于低表達患者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.135、5.684，P＜0.05）。見表4。

表4 TLR4、TLR9 表達與患者疾病進展之間的關系Table 4 Correlation between TLR4 and TLR9 levels and the development of disease

2.5 TLR4、TLR9 表達與患者預后的關系

采用Kaplan-Meier 生存曲線分析患者15 個月內進展情況，54 例患者存活40 例，死亡13 例，失訪1例，TLR4、TLR9 高表達患者15 個月生存率較低表達患者比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 TLR4、TLR9 水平與患者預后的關系Figure 1 The relationship between TLR4，TLR9 levels and patient prognosis

3 討論

EBV 是常見的皰疹病毒之一，在人群中的傳播感染率超過90%，主要存在與唾液腺組織中可長達數(shù)年之久，目前臨床尚無治療EBV 感染的有效方法［8］。EBV 不僅能夠感染人體內上皮細胞，同時對T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、NK 細胞等免疫相關細胞具有感染能力，可導致宿主免疫功能異常的發(fā)生，抑制細胞凋亡的同時促進細胞惡性轉化，是重要的促癌因素之一［9］。相關研究表明EBV 對肝細胞并無直接損傷作用，其介導的免疫反應是導致肝損傷的重要因素之一，合并EBV 感染的CHB 患者外周血T 細胞亞群分布情況改變［10］，但其機制尚不完全明確。ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL、ALP 是實驗室檢查中反應肝功能的重要指標，其中ALT、AST 水平上升反映肝細胞損傷，而TBIL、DBIL、IBIL 水平上升反映肝臟膽紅素代謝障礙，本研究中結果顯示合并EBV 感染的CHB 患者血ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL、ALP 水平均明顯高于未合并EBV 感染的CHB 患者，提示EBV 能夠導致肝功能損傷加重。

TLRs 是一種I 型跨膜蛋白，主要表達于巨噬細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞表面，是連接天然免疫和獲得性免疫的重要分子，通過調節(jié)Treg 細胞活動發(fā)揮其作用［11］。其中TLR4 能夠通過直接調控Treg 細胞的生長及增殖調節(jié)其免疫抑制功能［12］，而TLR9 的作用尚不完全明確，有研究指出其通過抑制Treg 細胞活性促進機體免疫的發(fā)生［13］。本研究發(fā)現(xiàn)合并EBV 感染的CHB 患者外周血單個核細胞中TLR4、TLR9 陽性表達率均升高，提示TLR4、TLR9 均促進炎癥反應的發(fā)生，這與國內學者張釗等人［14］的研究結果相符合。崔海霞等人［15］的研究發(fā)現(xiàn)Toll 樣受體在免疫性肝炎患兒外周血單個核細胞中表達明顯上升，調控免疫性肝炎的發(fā)生并與患者預后相關，本研究結果提示TLR4、TLR9 可能通過促進機體炎癥反應介導了肝細胞損傷，導致肝功能損傷和相關指標水平的上升。

本研究還發(fā)現(xiàn)單個核細胞中TLR4、TLR9 表達情況與患者疾病進展情況相關，TLR4、TLR9 高表達患者進展成為肝硬化及肝細胞癌的人數(shù)多于低表達患者。炎癥反應是促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，TLRs 通路激活后能夠介導干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）水平升高，促進T 淋巴細胞增殖增強機體炎癥反應，其中TLR4 能夠進一步促進IFN-γ 的合成和釋放［16］，而TLR9 能夠增強膠原蛋白的合成，促進肝臟纖維化過程的進展［17］，二者還能夠作用于腫瘤微環(huán)境，使炎癥因子水平上調，發(fā)揮抑制細胞凋亡作用的同時促進細胞增殖和生長，最終導致肝硬化的形成和腫瘤的進展［18］。最后本研究發(fā)現(xiàn)TLR4、TLR9 高表達患者15 個月生存率較低表達患者相比差異無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，合并EBV 感染的CHB 患者外周血單個核細胞中TLR4、TLR9 水平陽性表達率較高，其與患者血ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL、ALP 等肝功能指標水平相關，且能夠促進CHB 患者病情進展，可能為臨床CHB 的治療提供相關依據(jù)。本研究的不足之處在于樣本量較少，且隨訪時間過短，需要在后續(xù)的研究中進一步擴充樣本量并延長隨訪時間，以減少結果存在的偏倚。