姜味草中齊敦果酸和熊果酸的含量測定

田樹興 丁艷譜 周崇富 劉紅光 李軍山2,

1.云南神威施普瑞藥業(yè)有限公司，云南 楚雄 675000；2.楚雄神威施普瑞藥物研究有限公司，云南 楚雄 675000；3.神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430

姜味草為唇形科植物姜味草MicromeriabifloraBenth.的干燥全草，別名地生姜、小姜草、小香草，味苦，辛，性溫，具有溫中散寒、理氣止痛的功效[1-3]，分布于貴州、云南、西藏等地[4]，是云南常用草藥。已有報道通過水蒸氣蒸餾法和超臨界CO2提取姜味草中的揮發(fā)油，并采用CG-MS聯(lián)用法對其化學(xué)成分進行分析[5]；采用氣相色譜法對姜味草揮發(fā)油中橙花醛與香葉醛的含量進行測定[6]；采用薄層色譜掃描法對云南不同產(chǎn)地姜味草中齊敦果酸的含量進行測定[7]；采用高效液相色譜法對姜味草中非揮發(fā)性成分齊敦果酸和熊果酸的含量進行測定[8]。齊墩果酸和熊果酸具有抗氧化、抗癌、降血脂、降血糖和保肝等功效[9-12]。通過實驗建立高效液相色譜法測定姜味草中齊墩果酸和熊果酸含量的方法，為姜味草的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-2030 Plus高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；SK250LH超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；MS105DU 電子天平(d=0.00001 g)(瑞士梅特勒公司)。

1.2 藥品與試劑 姜味草購自云南祿豐縣勤豐鎮(zhèn)恒康中藥經(jīng)營部(產(chǎn)地為云南祿豐及云南華寧)、四川南部縣旭豐中藥材農(nóng)民專業(yè)合作社(產(chǎn)地為四川都江堰)，經(jīng)河北省藥品檢驗研究院孫寶惠主任中藥師鑒定為唇形科姜味草屬植物姜味草MicromeriabifloraBenth.的干燥全草。齊敦果酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110709-20188，純度91.1 %)；熊果酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110742-201823，純度99.9 %)；甲醇(色譜純，德國 Merck 公司)；乙醇(分析純)；冰醋酸(分析純)；三乙胺(分析純)；實驗室用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取齊敦果酸對照品10.80 mg和熊果酸對照品24.64 mg，置100 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為混合對照品溶液(其濃度分別為 98.39 μg·mL-1和246.15 μg·mL-1)。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取姜味草粉末(過三號篩)約1.0 g，置150 mL的量瓶中，加入90 %乙醇25 mL超聲(功率250 W，頻率40 kHz)處理30 min，取出放至室溫，用90 %乙醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱為Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85∶15∶0.3∶0.5)；柱溫為 15 ℃；檢測波長為210 nm；流速為 0.8 mL·min-1；進樣量為10 μL。在色譜條件下齊敦果酸和熊果酸可達到基線分離，齊敦果酸和熊果酸的分離度大于1.5。如圖1所示。

1.齊敦果酸；2.熊果酸圖1 齊敦果酸和熊果酸對照品(A)和樣品(B)的HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，分別注入液相色譜儀中，按上述“2.3”項下的色譜條件測定峰面積，以測定峰面積為為縱坐標(biāo)(Y)，對照品進樣量為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得齊敦果酸回歸方程Y=62036.97X+2180.27，R=0.9997表明齊敦果酸進樣量在0.20～2.46 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。得熊果酸回歸方程Y=146338.20X-1848.62，R=0.9999表明熊果酸進樣量在0.49～6.15 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗 精密吸取混合對照品溶液 10 μL，分別注入液相色譜儀中，按上述“2.3”項下的色譜條件連續(xù)測定6次，結(jié)果，齊敦果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為0.17 %和0.09 %。表明本方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗 取同一批樣品(云南-祿豐)6份，按“2.2”項下的方法制備并進行測定。結(jié)果表明齊敦果酸和熊果酸含量的RSD分別為1.57 %和1.63 %。表明本方法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性實驗 取“2.6”項下同批的樣品在0、4、8、12、16、20 h分別進行測定，結(jié)果20 h內(nèi)齊敦果酸和熊果酸峰面積無明顯變化，RSD分別為1.33 %和1.31 %，表明被測樣品在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實驗 取已知含量的樣品(云南-祿豐)，齊敦果酸和熊果酸的含量分別為：2.08 mg·g-1和5.58 mg·g-1適量，約1 g，共6分，精密稱定，分別加入0.488 mg/mL齊敦果酸和0.912 mg/mL熊果酸的混合對照品溶液1.5、2.5和5.0 mL，揮干溶劑，按“2.2”項下方法制備供試品溶液。按上述色譜條件進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果

2.8 樣品含量測定 分別取不同產(chǎn)地的姜味草，按供試品溶液制備方法制備，并進行進樣測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 提取方式的選擇 本實驗結(jié)合李坤平等[13]用體積分?jǐn)?shù)90%乙醇作為溶劑超聲提取，對提取溶劑、提取方法、提取時間三方面進行優(yōu)化。①提取溶劑：對50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、無水乙醇和甲醇5種溶劑的提取效進行比較，結(jié)果95%乙醇、無水乙醇和甲醇3種溶劑的提取率相近，50%乙醇和70%乙醇提取率較低；由于95%乙醇的毒性低且實驗室較為常用，且無需提前對提取溶劑進行配置。同時對齊敦果酸和熊果酸的測定無干擾，基線平穩(wěn)，故選用95%乙醇作提取溶劑;②提取方法：對加熱回流和超聲2種方法提取，提取率相近，考慮實驗提取的快捷方便，故采用超聲提取作為提取方法;③提取時間：對供試品超聲時間20、30、45和60 min進行考察，結(jié)果超聲20 min的提取率較低，30、45和60 min的提取率相近，故選擇30 min為提取時間。

3.2 檢測條件的選擇 齊敦果酸和熊果酸屬于五環(huán)三萜類化合物，極性相似，較難分離。選用甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85∶15∶0.03∶0.06)，柱溫箱溫度25 ℃，流速1 mL·min-1時，齊敦果酸和熊果酸的保留時間較為接近，無法有效分離。繼而考察柱溫箱溫度15 ℃，流速0.8 mL·min-1；柱溫箱溫度15 ℃，流速0.5 mL·min-1時。結(jié)果兩種方法均能使齊敦果酸和熊果酸達到良好分離，分離度大于1.5。由于柱溫箱溫度15 ℃，流速 0.8 mL·min-1保留時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于柱溫箱溫度 15 ℃，流速0.5 mL·min-1。故選擇甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85∶15∶0.03∶0.06)，柱溫箱溫度 15 ℃，流速0.8 mL·min-1為檢測條件。

由表2可知3個不同產(chǎn)地的姜味草中均含有齊敦果酸和熊果酸，但不同產(chǎn)地的姜味草中齊敦果酸和熊果酸含量的差別較大，其原因有待進一步探討。

本研究建立了同時測定姜味草中齊敦果酸和熊果酸含量的方法，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且具有分離度好、靈敏度高、準(zhǔn)確性高、供試品制備簡單等優(yōu)點，為姜味草質(zhì)量評價及標(biāo)準(zhǔn)提升提供了良好的方法和依據(jù)。