農(nóng)藥代謝試驗(yàn)放射性同位素示蹤樣品處理技術(shù)

李 政 余志揚(yáng) 張素芬

（1浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，浙江杭州 310003；2浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310029）

農(nóng)藥是人類確保糧食安全不可或缺的生產(chǎn)資料，也是確?！爸袊?guó)飯碗裝中國(guó)糧”必不可少的技術(shù)措施[1]。2017年我國(guó)頒布實(shí)施了新的《農(nóng)藥登記資料要求》和《農(nóng)作物中農(nóng)藥代謝試驗(yàn)準(zhǔn)則》（NY/T 3096—2017）[2]，將基于放射性同位素示蹤技術(shù)的農(nóng)藥代謝安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)作為登記資料要求之一。放射性同位素示蹤技術(shù)是利用放射性同位素標(biāo)記的化合物研究物質(zhì)運(yùn)動(dòng)過程及其規(guī)律的一種研究方法，具有溯源追蹤、痕量精準(zhǔn)等特點(diǎn)，是目前國(guó)際公認(rèn)的研究農(nóng)藥代謝最有效的手段之一。在農(nóng)藥代謝放射性同位素示蹤試驗(yàn)中，科學(xué)選擇示蹤核素、規(guī)范引入示蹤劑、采取適宜方法凈化樣品等預(yù)處理技術(shù)，是準(zhǔn)確鑒別代謝產(chǎn)物和定量分析的重要前提。

1 農(nóng)藥代謝試驗(yàn)常用放射性核素

利用放射性同位素示蹤技術(shù)開展農(nóng)藥代謝研究，選擇適當(dāng)?shù)氖聚櫤怂厥潜Ｕ显囼?yàn)成功的關(guān)鍵。當(dāng)選擇放射性示蹤核素時(shí)，應(yīng)綜合考慮農(nóng)藥分子本身結(jié)構(gòu)、標(biāo)記化合物合成難易及成本高低、測(cè)量?jī)x器、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、試?yàn)周期、人員安全防護(hù)等因素。目前，14C是農(nóng)藥代謝試驗(yàn)最常用的放射性示蹤核素，3H、32P和35S次之。這幾種核素使用較多主要有以下原因：一是在標(biāo)記化合物合成過程中，絕大多數(shù)農(nóng)藥的14C中間體容易得到，14C屬低能β放射核素，試驗(yàn)放射性屏蔽、廢物處理和去污等方面要求簡(jiǎn)便；14C半衰期為5 730年，物理半衰期長(zhǎng)，無須作物理衰變校正。二是3H具有與14C相似的優(yōu)點(diǎn)，半衰期為12.32年，但能量較低，需要特殊的測(cè)定條件[3]。三是32P和35S僅適于含P和S元素的農(nóng)藥分子標(biāo)記，標(biāo)記化合物種類受限；32P、35S 半衰期分別為 14.26、87.48 d，試驗(yàn)一般需要做物理衰變校正；32P能量較高，防護(hù)較14C困難。為確保試驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量，對(duì)于一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的農(nóng)藥化合物，應(yīng)選擇多位置標(biāo)記和（或）雙（多）核素標(biāo)記[4]。農(nóng)藥標(biāo)記化合物的化學(xué)純度和放射化學(xué)純度均應(yīng)達(dá)到95%以上。

2 農(nóng)藥代謝試驗(yàn)供試作物選擇

據(jù)《農(nóng)作物中農(nóng)藥代謝試驗(yàn)準(zhǔn)則》（NY/T 3096—2017）要求，農(nóng)藥登記代謝試驗(yàn)供試作物分為5類，即根莖類作物、葉類作物、果實(shí)類作物、種子與油料類作物、谷類作物（表1）[2]，如登記作物不屬于此5類作物，可以向農(nóng)藥登記管理部門具體咨詢。供試作物選擇原則：為了推斷一種農(nóng)藥在所有作物種群中的代謝，應(yīng)在上述5類作物中選擇3類，每類應(yīng)至少選擇1種代表性作物進(jìn)行代謝研究；在使用劑量和方法近似的情況下，每類中1種作物上的代謝數(shù)據(jù)可適用于同類其他作物；供試作物必須包含登記作物。

表1 用于農(nóng)作物中農(nóng)藥代謝試驗(yàn)的作物與作物種類

3 示蹤劑引入方法

根據(jù)農(nóng)藥代謝試驗(yàn)?zāi)康?、作物栽培方式、施藥方式等，?yīng)選擇易吸收、易操作的示蹤劑引入方法，引入劑量應(yīng)準(zhǔn)確，避免不必要的污染。常用示蹤劑引入方法有以下幾種。

3.1 示蹤劑莖葉引入方法

3.1.1 涂抹法。根據(jù)登記農(nóng)藥劑型選擇適宜的助劑，將示蹤劑配制成適宜濃度的溶液，定量吸取示蹤劑溶液反復(fù)均勻涂抹至葉片或莖部表面，并通過測(cè)定實(shí)際引入作物的總放射性活度確定引入量[5]。處理葉的葉齡要求基本一致，涂抹時(shí)應(yīng)防止葉面損傷和交叉污染。

3.1.2 噴霧法。用微型噴霧器將示蹤劑溶液均勻地噴灑在葉片表面，并通過測(cè)定實(shí)際引入作物的總放射性活度確定引入量。需要在氣密性良好的裝置中噴灑，以保證試驗(yàn)人員安全，防止交叉污染。

3.1.3 濾紙黏附法。將濾紙剪成一定面積的小片貼在葉片上，用膠帶固定，反復(fù)用微量滴定管定量地將示蹤液滴到濾紙上，葉片從濾紙上吸收放射性示蹤液。通過測(cè)定實(shí)際引入作物的總放射性活度確定引入量。

3.2 示蹤劑基質(zhì)引入方法

3.2.1 毒土法。用助劑將示蹤劑配制成適宜濃度的溶液，播種前均勻混入土壤，或播種后通過澆灌施入土壤。土壤引入主要適用于內(nèi)吸性較強(qiáng)的農(nóng)藥[6]。

3.2.2 砂培和水培法。用助劑將示蹤劑配制成適宜濃度的溶液，再將示蹤劑在預(yù)定時(shí)間（或作物生育期）加入培養(yǎng)液中。

3.3 示蹤劑種子引入方法

用助劑將示蹤劑配制成適宜濃度的溶液，按照農(nóng)藥登記推薦施藥方式進(jìn)行種子處理[7]。

4 農(nóng)藥代謝試驗(yàn)樣品制備技術(shù)

樣品制備是指將待測(cè)樣品處理成適合測(cè)定的檢測(cè)溶液的過程，主要包括提取、濃縮和凈化等3個(gè)部分內(nèi)容。農(nóng)藥登記代謝試驗(yàn)的目的主要是農(nóng)藥母體殘留分析、代謝產(chǎn)物溯源、組成甄別、分子結(jié)構(gòu)鑒定等。樣品測(cè)定分析時(shí)通常需要將放射性測(cè)量技術(shù)與高效液相色譜、高分辨質(zhì)譜聯(lián)用，因而選擇合適的樣品制備方法至關(guān)重要。

4.1 提取

4.1.1 提取劑選擇。根據(jù)“相似相溶”原理，提取劑應(yīng)選擇與殘留農(nóng)藥理化性質(zhì)相似的溶劑，沸點(diǎn)宜為45～80℃，要求其既能溶解待測(cè)農(nóng)藥，又不與待測(cè)農(nóng)藥反應(yīng)。當(dāng)樣本含水量較高時(shí)，通常選用能與水互溶的極性溶劑，如丙酮、乙腈等[8]；如果提取的是非極性農(nóng)藥，可在極性溶劑中加入適量的非極性溶劑。溶劑的極性強(qiáng)弱通常用其從氧化鋁吸附劑上洗脫一系列供試溶質(zhì)的能力（洗脫能力參數(shù)）來表示（表2），參數(shù)越大洗脫能力越強(qiáng)，說明溶劑的極性越強(qiáng)。

表2 氧化鋁吸附柱中溶劑的洗脫能力

4.1.2 常用提取方法。提取試劑選擇后，根據(jù)樣品的形態(tài)特點(diǎn)常選擇以下方法進(jìn)行提取。

（1）液-固提取法（liquid-solid extraction，LSE）。液-固提取法主要包括2個(gè)同時(shí)進(jìn)行的過程，即固體樣品中的欲測(cè)定組分分子在溶劑中溶解過程和欲測(cè)定組分分子與溶劑分子相互擴(kuò)散的過程。將固體樣品研磨后放入提取試劑中，選擇合適的轉(zhuǎn)速振蕩提取，必要時(shí)可以加熱，然后利用離心、過濾的方法使液與固分離，農(nóng)藥母體及代謝產(chǎn)物組分進(jìn)入溶劑。2017年張金娥等[9]利用LSE法分析了水果、蔬菜中20種有機(jī)氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量。

（2）加速溶劑萃取法（accelerated solvent extraction，ASE）。采用常規(guī)溶劑，在較高的溫度（50～200 ℃）和壓力（10.3～20.6 MPa）條件下對(duì)固體或半固體樣品進(jìn)行萃取。此法需要使用加速溶劑萃取儀，提取時(shí)應(yīng)選擇合適容積的萃取池，底部加纖維濾紙膜，然后將樣品裝入萃取池中，裝好的萃取池放到萃取池托架上，下方對(duì)應(yīng)放一個(gè)收集瓶。儀器啟動(dòng)后，自動(dòng)將萃取池送入加熱爐、向萃取池加注溶劑至指定壓力并加熱至設(shè)定溫度。樣品在高溫高壓條件下靜態(tài)萃取一定時(shí)間后，將萃取池中的提取液釋放到收集瓶中，再向萃取池內(nèi)注入新溶劑，進(jìn)行下一個(gè)靜態(tài)萃取循環(huán)，直到完成設(shè)定的循環(huán)次數(shù)。之后用一定體積的新溶劑沖洗萃取池，最后用氮?dú)鈱⑹Ｓ嗟娜軇┐等胧占?，以保證萃取液被全部收集。加速溶劑每提取10 g樣品約需溶劑15 mL，每個(gè)樣品的提取時(shí)間一般少于20 min。2019年焦慧澤等[10]用加速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留，添加回收率為68.7%～103.8%，RSD為0.8%～13.2%。

（3）微波輔助萃取法（micro-wave-assisted extraction，MAE）。提取時(shí)使用微波進(jìn)行加熱，極性溶劑分子可以迅速吸收微波能量使萃取罐內(nèi)處于高溫高壓的狀態(tài)，有利于快速將殘留農(nóng)藥從樣品中提取出來。此方法具有高效、安全、試劑用量小和易于自動(dòng)化等特點(diǎn)，是美國(guó)EPA推薦的樣品預(yù)處理方法之一。2019年劉培勇等[11]用微波輔助提取-分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析了果蔬中20種農(nóng)藥的殘留，該方法添加回收率為64.5%～121.0%。

（4）基質(zhì)固相分散萃取法（matrix solid phase dispersion，MSPD）?；|(zhì)固相分散萃取技術(shù)是由Barker等在1989年首次提出，其原理是將涂有C18色譜柱等多種聚合物的單體固相萃取材料與樣品一起研磨，得到半干狀態(tài)的混合物并將其作為填料裝柱，然后選用不同的溶劑淋洗柱子，將相應(yīng)待測(cè)物洗脫下來。該方法融合了傳統(tǒng)的樣品提取、凈化等過程，適用于不同極性農(nóng)藥殘留的提取凈化，具有快速、價(jià)廉和試劑用量少等優(yōu)點(diǎn)。2017年秦偉瀚等[12]利用該方法同時(shí)檢測(cè)13種不同產(chǎn)地昆明山海棠中有機(jī)磷和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留情況。結(jié)果表明，與藥典方法和文獻(xiàn)方法相比，該方法具有簡(jiǎn)單快速、節(jié)本高效等優(yōu)點(diǎn)。

（5）QuEChERS法。2003年，美國(guó)農(nóng)業(yè)部開發(fā)出一種新的樣品前處理方法，即QuEChERS法。該方法具有快速、簡(jiǎn)便、低廉、高效、穩(wěn)定和安全等優(yōu)點(diǎn)。常規(guī)QuEChERS法具體步驟：稱取10 g樣品于塑料離心管中，加入10 mL乙腈振蕩1 min后，再加入4 g無水硫酸鎂和1 g醋酸鈉，將離心管密封、振蕩、離心，取上層清液1 mL于小離心管中，加入150 mg無水硫酸鎂和25 mg PSA（N-丙基乙二胺）振蕩、離心，用一次性注射器取上層清液過有機(jī)濾膜后待檢[13]。在上述方法中，對(duì)于成分復(fù)雜、干擾物質(zhì)多的植物性樣品，還需酌情加入石墨化炭黑GCB（graphitised carbon black，GCB）和C18。其中，無水硫酸鎂去除有機(jī)相中的水分；PSA吸附基質(zhì)中碳水化合物、酚類、各種極性有機(jī)酸、少量色素、糖類和脂肪酸；GCB去除基質(zhì)中的色素、甾醇類和非極性干擾物；C18去除脂肪酸、脂類等非極性干擾物[14]。該方法同時(shí)融合了提取、凈化等過程，操作簡(jiǎn)單，回收率較高。2020年楊志敏等[15]采用改良QuEChERS法建立了同時(shí)檢測(cè)枸杞干果中118種農(nóng)藥殘留的氣相色譜-質(zhì)譜分析方法。

4.2 濃縮

基質(zhì)固相分散萃取法、QuEChERS法等方法樣品和試劑用量較少，濃縮過程可以酌情處理。但是，常規(guī)溶劑提取法所用溶劑量相對(duì)較大，樣品中農(nóng)藥殘留量一般較低，在凈化和檢測(cè)前必須對(duì)提取溶液進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法和氮?dú)獯蹈煞ǖ取?/p>

4.2.1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀來完成濃縮，通過減壓降低溶劑沸點(diǎn)，并利用旋轉(zhuǎn)濃縮瓶對(duì)濃縮液進(jìn)行攪拌，在瓶壁上形成液膜、擴(kuò)大蒸發(fā)面積，從而達(dá)到濃縮效果。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法具有濃縮速度快、農(nóng)藥損失小、溶劑可回收等優(yōu)點(diǎn)，特別適合大體積樣品提取液的濃縮，但需要二次轉(zhuǎn)移，不宜用于高度濃縮。

4.2.2 氮?dú)獯蹈煞?。利用氮?dú)饬鬏p緩吹拂提取液，以加速溶劑的蒸發(fā)。為了加速溶劑的濃縮，常常在吹氣的同時(shí)用水浴適當(dāng)加熱。該方法為實(shí)驗(yàn)室常用的濃縮方法之一，一般適用于少量溶劑的濃縮，蒸氣壓高的農(nóng)藥因容易損失而不宜采用。

4.3 凈化

當(dāng)用有機(jī)試劑提取樣品中的殘留農(nóng)藥時(shí)，會(huì)同時(shí)帶入脂肪、色素、蠟質(zhì)等雜質(zhì)，影響定性定量測(cè)量和儀器使用壽命。凈化主要利用殘留農(nóng)藥與干擾雜質(zhì)理化性質(zhì)的差異，將干擾物數(shù)量減少到不影響正常檢測(cè)的水平。

4.3.1 柱層析法（column chromatography）。柱層析法又稱吸附色譜法，是普遍應(yīng)用的傳統(tǒng)凈化方法之一。該方法將提取液中的農(nóng)藥與雜質(zhì)一起通過一根裝有適宜填料的柱子，使它們吸附在柱子上，然后用適當(dāng)極性的溶劑淋洗，農(nóng)藥一般先被洗脫下來，而色素、蠟質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)留在吸附柱上，從而達(dá)到純化的目的。根據(jù)雜質(zhì)種類和性質(zhì)的不同，常用的柱填料有硅鎂吸附劑/弗羅里硅土、氧化鋁、活性炭和硅膠等。2020年童紅梅等[16]研究表明，柱層析法工藝流程更簡(jiǎn)單，去除色素類雜質(zhì)效果較好。

4.3.2 固相萃取法（solid phase extraction，SPE）。固相萃取是由液固萃取和柱層析技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的一種預(yù)處理技術(shù)，固相萃取過程實(shí)質(zhì)上就是一個(gè)柱色譜分離過程。SPE利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜法分離原理，對(duì)樣品進(jìn)行富集、分離、凈化，克服了傳統(tǒng)液液萃取技術(shù)難以處理大體積樣品和萃取過程容易乳化等缺點(diǎn)。SFE與柱層析相似，但因萃取柱商品化，萃取效果較柱層析好。2021年王燕等[17]用固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定環(huán)境水體中79種半揮發(fā)性有機(jī)污染物，平均回收率為60.6%～137.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 0.8%～8.8%。

4.3.3 固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME）。SPME裝置主要由萃取手柄、萃取頭和專用萃取平臺(tái)等3個(gè)部分組成。萃取頭是一根長(zhǎng)1 cm、表面涂有吸附聚合物的熔融石英纖維絲，固定在不銹鋼活塞上，活塞安裝在萃取手柄上。萃取樣品時(shí)，先將萃取頭從手柄內(nèi)推出，然后將其浸漬在樣品溶液中或置于樣品上空，有機(jī)物會(huì)吸附在萃取頭上。吸附一段時(shí)間后，把萃取頭收縮至鞘內(nèi)，抽出萃取頭，即可與檢測(cè)儀器聯(lián)機(jī)進(jìn)行分析。2021年Lee等[18]通過頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜法鑒定出了某種植物的66種揮發(fā)性成分。2021年Belinato等[19]采用基質(zhì)兼容纖維全自動(dòng)固相微萃取法測(cè)定蜂蜜中擬除蟲菊酯類殺蟲劑，較好地克服了基質(zhì)影響。

5 結(jié)語

在研究農(nóng)藥代謝的放射性同位素示蹤試驗(yàn)過程中，采用液體閃爍計(jì)數(shù)法進(jìn)行放射性同位素測(cè)量時(shí)難免存在淬滅效應(yīng)，影響測(cè)量精度，而樣品提取過程中的色素、蠟質(zhì)、脂肪、碳?xì)浠衔锏入s質(zhì)是引起顏色淬滅、化學(xué)淬滅的主要原因。同時(shí)，在放射性同位素樣品分析測(cè)試過程中不可避免地產(chǎn)生廢氣、廢液和固體廢物等放射性廢物，試劑和樣品用量越少越有利于放射性廢物的處理。在實(shí)際工作中，需要根據(jù)農(nóng)藥本身性質(zhì)、樣品種類、基質(zhì)組分和檢測(cè)方法等不同特點(diǎn)，科學(xué)選擇標(biāo)記核素、示蹤劑引入方式，合理選擇樣品前處理方法，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，降低放射性廢物處理成本。