采收期對寧夏六盤山冷涼地區(qū)黃芩質(zhì)量的影響

趙建軍 石悄然 毛福英 ，3 林麗珍 王建寰 ，4 趙云生 ，4，5*

（1寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏銀川 750004；2寧夏特色中醫(yī)藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川 750004；3河北中醫(yī)學(xué)院實驗中心，河北石家莊 050091；4寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，寧夏銀川 750004；5河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北石家莊 050091）

黃芩是我國常用大宗藥材，為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效[1]，市場需求量巨大。寧夏六盤山地區(qū)氣候冷涼，近年來黃芩栽培發(fā)展迅速，該地區(qū)冷涼的地理環(huán)境為黃芩栽培提供了特有的生境條件。采收期是影響六盤山黃芩質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一，然而產(chǎn)區(qū)部分群眾在利益驅(qū)動下根據(jù)需要隨時采挖，導(dǎo)致黃芩質(zhì)量下降，確定黃芩合理采收期是解決上述問題的有效途徑。黃芩含有多種藥效物質(zhì)，其中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A等黃酮及其苷類成分是其主要有效成分，具有保肝、利膽、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗抑郁、抗氧化、心血管保護、神經(jīng)保護、改善記憶障礙、降血糖、殺蟲等多種藥理活性[2-5]。云南曲靖栽培的黃芩其黃芩苷含量隨采收時間而變化，6—7月采收的黃芩樣品中黃芩苷含量最高，為最佳采收時間[6]。內(nèi)蒙古赤峰栽培的黃芩春季采收的樣品中千層紙素A、白楊素、黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷與漢黃芩苷整體含量高于同年份秋季采收的樣品[7]。山西石樓5月采收的黃芩樣品中黃芩素等黃酮苷元類成分含量較高，7—8月采收的黃芩樣品中黃芩苷等黃酮苷類成分含量較高[8]。以黃芩苷為目標，陜西商洛黃芩最佳采收期在第3年11月[9]。河北省承德市栽培的黃芩其黃芩苷和漢黃芩苷含量以5月中旬至6月中旬采收最高，黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A含量以6月中旬至7月中旬采收的樣品最高[10]。河北省隆化縣栽培的黃芩以6月10日采收的樣品黃芩苷含量最高[11]。寧夏栽培的黃芩其黃芩苷含量以10月采收最高[12]?？梢姡煌a(chǎn)地的藥材，其合理采收期并不一致，明確不同采收期黃芩藥效成分的含量變化規(guī)律，是黃芩質(zhì)量控制的重中之重。然而，目前關(guān)于寧夏六盤山黃芩質(zhì)量評價與合理采收期的研究較少，本文選擇六盤山地區(qū)黃芩的典型生產(chǎn)基地寧夏隆德縣為藥材采集地，采用指紋圖譜與黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A含量評價不同采收期黃芩藥材的質(zhì)量差異，以確定采收期對寧夏六盤山冷涼地區(qū)黃芩質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

供試儀器為日本島津LC-20A高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器（DAD）、十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）、數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，250 W，40 kHZ）。

1.2 試驗試劑

對照樣品為黃芩苷（批號B20570）、漢黃芩苷（批號 B20488）、黃芩素（批號 B20571）、漢黃芩素（批號B20489）、千層紙素A（批號B20958），均購自上海原葉生物科技有限公司。

甲醇、甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

黃芩藥材均于2018年采自寧夏隆德縣沙塘鎮(zhèn)與陳靳鄉(xiāng)，由寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院教授趙建軍采集并鑒定為黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi），藥材采集時間信息見表1。

表1 黃芩藥材采集時間

1.3 指紋圖譜色譜條件

色譜柱：Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）。流動相：A為1%甲酸水溶液，B為甲醇，梯度洗脫條件見表2。DAD檢測器，檢測波長274 nm，流速 1 mL/min，柱溫 30 ℃，進樣量 10 μL[13-15]。

表2 黃芩藥材HPLC梯度洗脫條件

1.4 對照樣品溶液的制備

分別精密量取黃芩苷8.7 mg、漢黃芩苷10.0 mg、黃芩素2.6 mg、漢黃芩素1.4 mg、千層紙素A 2.0 mg對照樣品，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度線，配制成含黃芩苷1.74 mg/mL、漢黃芩苷2.0mg/mL、黃芩素 0.52 mg/mL、漢黃芩素0.28 mg/mL、千層紙素A 0.4 mg/mL的混合對照樣品溶液，備用。

1.5 供試樣品溶液的制備

將黃芩藥材去除雜質(zhì)，粉碎研磨后過50目篩，60℃烘干至恒重，精密稱定0.4 g，加入70%甲醇40 mL，超聲提取30 min，過濾，再取殘渣加入70%甲醇40 mL，超聲提取30 min，過濾，合并2次濾液，旋蒸后用甲醇定容于25 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得樣品溶液。

1.6 標準曲線的建立

分別精密吸取1.4項混合對照樣品溶液1、4、8、12、16 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，記錄峰面積，以進樣量為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，分別建立黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準回歸方程的建立

建立黃芩中5種待測成分回歸方程，結(jié)果見表3，各回歸方程R2均大于0.999，說明各方程回歸良好，可用于黃芩藥材中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A的含量測定。

表3 黃芩中5種待測成分標準曲線回歸方程

2.2 精密度試驗

取批號為S1的黃芩藥材，按1.5的方法制備6份供試樣品溶液，依據(jù)1.3的色譜條件，連續(xù)進樣6次，進樣10 μL，分別測定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A的含量，考察儀器的精密度。測得各被測成分含量RSD值均小于2.4%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗

精密稱取S1樣品，按1.5的方法制備6份供試樣品溶液，依據(jù)1.3的色譜條件，進樣10 μL，分別測定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A的含量，考察試驗方法的穩(wěn)定性。測得各被測成分含量RSD值均小于3.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取批號為S1的黃芩藥材，按1.5的方法制備供試樣品溶液，依據(jù)1.3的色譜條件，分別在 0、2、4、8、12、24 h各進樣10 μL，分別測定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A的含量，考察供試樣品溶液的穩(wěn)定性。測得各被測成分含量RSD值均小于2.6%，表明供試樣品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率試驗

取已知含量S1樣品粉末0.2 g，精密稱定，分別精密加入一定質(zhì)量的黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素與千層紙素A對照樣品溶液，按1.5的方法制備供試樣品溶液，再按1.3的色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表4。各樣品加樣回收率在96.48%～107.14%之間，RSD值均小于3.19%，表明各待測成分加樣回收率良好。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果（n=3）

2.6 指紋圖譜的建立

將15批不同采收時間黃芩藥材按1.5的方法制備供試樣品溶液，精密吸取10 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”進行數(shù)據(jù)分析處理，設(shè)定S1為參照圖譜，將其他樣品的色譜峰與參照圖譜進行自動匹配，生成對照圖譜（R），建立黃芩藥材指紋圖譜色譜圖，結(jié)果見圖1。15批不同采收時間黃芩藥材指紋圖譜中各色譜峰形態(tài)相似，化合物種類相似，有13個共有色譜峰，共有峰圖譜見圖2，其中7號峰為黃芩苷，8號峰為漢黃芩苷，9號峰為黃芩素，11號峰為漢黃芩素，12號峰為千層紙素A。

采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，對15批不同采收時間黃芩藥材HPLC指紋圖譜進行相似度評價，結(jié)果見表5。15批不同采收時期黃芩藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜相比，相似度均高于0.987，說明不同采收時間黃芩藥材相似度高度一致，結(jié)合圖1指紋圖譜測定結(jié)果可知，不同采收時間，黃芩藥材藥效成分的種類相似，采收時間對黃芩藥效成分種類影響不大。

表5 不同采收時間黃芩藥材指紋圖譜與對照圖譜的相似度

不同采收時間黃芩共有峰總峰面積差異較大，由表6可知，2018年8月20日至9月20日采收的黃芩指紋圖譜共有峰總峰面積較大，高于其他12個采收時間的黃芩，因而在上述時間采收的黃芩化學(xué)成分總含量較高。

表6 不同采收時間黃芩指紋圖譜共有峰總峰面積

2.7 含量測定

取15批不同采收時間黃芩藥材，按照1.5的方法制備供試樣品溶液，分別測定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A含量，測定結(jié)果如表7所示。

表7 不同采收時間黃芩中5種成分含量

在15批不同采收時間的黃芩樣品中，黃芩苷含量為 11.82%～18.55%， 以樣品 S11、S12、S13、S14 與S15（9月20日至翌年4月20日采收的樣品）含量較高，均高于15.70%，以樣品S6（7月20日）含量最低。各樣品中漢黃芩苷含量為4.36%～6.62%，以樣品 S11（9月20日采收）與樣品 S13（10月20日采收）含量較高，以樣品S6含量最低。黃芩素含量為3.91‰～10.90‰， 以樣品S2、S3、S9含量較高， 樣品S11、S12、S13（9 月 20 日以后采收的樣品）較低。 漢黃芩素含量為0.59%～1.63‰，以樣品S2、S7、S9較高，以樣品S1、S13含量較低。不同采收時間千層紙素A含量為0.21%～1.69‰，以樣品S3與S5含量較高，以樣品 S10、S11、S12、S13（9 月 10 日以后采收）含量較低，均不高于0.43‰?？梢?，供試黃芩樣品中，黃芩苷與漢黃芩苷含量較高，二者均以9月20日與10月20日左右采收含量較高；黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A的含量較低，以10月20日采收含量較低，在7—8月的炎熱季節(jié)采收含量較高。

3 結(jié)論與討論

黃芩中黃芩苷是2020年版《中國藥典》要求檢測的指標成分[1]，在9月20日以后采收的黃芩其黃芩苷含量較高，漢黃芩苷含量亦較高。指紋圖譜共有峰總峰面積以9月20日采收的黃芩最大，因而寧夏六盤山冷涼地區(qū)栽培的黃芩宜在9月20日左右采收。此時黃芩藥效物質(zhì)含量高、品質(zhì)優(yōu)良，是黃芩的適宜采收期。

近年來，黃芩栽培在寧夏發(fā)展迅速。然而，寧夏分布和曾長期使用的是甘肅黃芩（S.rehderiana Diels），近年來，市場上供應(yīng)的甘肅黃芩很少見到，對于在寧夏冷涼地區(qū)生產(chǎn)的黃芩質(zhì)量與采收時間研究并不深入。本研究結(jié)果表明，黃芩在寧夏隆德縣等六盤山冷涼地區(qū)種植，質(zhì)量可靠，其合理采收期應(yīng)安排在9月20日左右。本研究共檢測了5種待測成分，這5種成分并不是在9月20日左右采收的黃芩樣品中含量均是最高的，但此時采收的黃芩樣品中，黃芩苷與漢黃芩苷含量較高，指紋圖譜共有峰總峰面積亦較高，說明其藥典指標成分與化學(xué)物質(zhì)的總含量高，此時采收，黃芩質(zhì)量較高。