細菌中脂肪酸β-氧化途徑與機理的研究進展

王智勇，宋 凱，郝祥蕊，張紅艷，何亞文*

（1.湖北民族大學生物科學與技術學院，生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，恩施 445000；2.上海交通大學生命科學技術學院，微生物代謝國家重點實驗室，代謝與發(fā)育科學國際合作聯(lián)合實驗室，上海交大-上海農樂生物農藥與生物肥料聯(lián)合研發(fā)中心，上海 200240；3.上海農樂生物制品股份有限公司，上海 201419）

生物體富含脂肪酸，它們以各種鏈長、化學構型和功能性存在于體內。脂肪酸按鏈長長短可分為長鏈脂肪酸、中鏈脂肪酸和短鏈脂肪酸；按結構可分為順式脂肪酸和反式脂肪酸、飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸、直鏈脂肪酸和支鏈脂肪酸［1］。脂肪酸是細胞膜結構中磷脂的主要組成部分，參與生物體合成代謝、能量代謝、信號傳導等重要的生理活動，是生命活動必不可少的成分［2］。

生物體能夠合成脂肪酸，也能通過不同氧化途徑分解和利用脂肪酸。脂肪酸氧化途徑大致分為α-氧化、β-氧化和ω-氧化，其中α-氧化和ω-氧化僅存在于真核生物中，β-氧化是真核生物和原核生物中的主要脂肪酸降解途徑［3-5］。由于脂肪酸合成是一個高度耗能的過程，故生物體還能吸收和利用外源脂肪酸參與自身的生理活動［6］。

脂肪酸β-氧化機理在大腸桿菌（Escherichia coli）中研究得最為廣泛和深入。隨著微生物全基因組序列數(shù)據(jù)庫的迅猛發(fā)展，大多數(shù)測序的細菌中都發(fā)現(xiàn)了脂肪酸β-氧化相關基因，初步研究結果表明，盡管細菌中β-氧化的機理相對保守，但β-氧化基因和β-氧化參與的生物學功能存在多樣性。本文首先總結了大腸桿菌和其他細菌中脂肪酸β-氧化相關研究的最新進展；然后以植物病原黃單胞菌（Xanthomonas）為例，特別介紹了DSF（diffusible signaling factor）-家族群體感信號分子降解的研究進展；在此基礎上，進一步預測了具有特殊結構脂肪酸的降解機理；最后探討了本領域有待回答的關鍵科學問題。

1 大腸桿菌中脂肪酸β-氧化途徑

野生型大腸桿菌可以鏈長為12個碳以上的脂肪酸作為唯一碳源生長，這些脂肪酸可以誘導脂肪酸降解調節(jié)子（fadregulon）的表達。脂肪酸降解調節(jié)子負責中鏈（C7—C11）、長鏈（C12—C18）和不飽和脂肪酸的轉運（fadL）、?；╢adD）及β-氧化（fadA，B，E，F(xiàn)，G，H）。fadR編碼一個GntR家族轉錄調控因子，負調控脂肪酸 β-氧化，其表達受長鏈脂肪酸誘導，但不受中鏈脂肪酸誘導［7］。短鏈脂肪酸的轉運和利用由atoDAEB操縱子完成，受AtoC調節(jié)［7-8］。

胞內脂肪酸由?；o酶A合成酶激活形成脂酰輔酶A，進入β-氧化循環(huán)。β-氧化循環(huán)包括脫氫、水合、脫氫和硫解四個步驟［9-10］，每個循環(huán)從脂肪酸鏈中以乙酰輔酶A的形式釋放出兩個碳原子（圖1）。產生的乙酰輔酶A與草酰乙酸一起由檸檬酸合成酶催化生成檸檬酸，進入三羧酸循環(huán)。

圖1 細菌脂肪酸β-氧化代謝途徑Fig.1 The β-oxidation pathway of fatty acid degradation in bacteria

脂酰輔酶A合成酶（FadD） FadD是催化大腸桿菌β-氧化的第一步，負責將脂肪酸附著到輔酶A上。大腸桿菌FadD的分子量約為62 kD，包含兩個高度保守的ATP/AMP特征結構域和一個參與脂肪酸底物結合和特異性識別的結構域［9］。FadD二聚體作用于鏈長為6～18個碳原子的脂肪酸，但對6～12個碳原子的脂肪酸其活性相對較低［14］。DNA蛋白凝膠阻滯試驗和DNase足跡分析證明了FadR可抑制fadD的表達［9］。Zhang等［15］發(fā)現(xiàn)，過量的中鏈酰基輔酶A與FadR結合，解除了FadR對脂肪酸β-氧化的抑制作用。

?；o酶A合成酶（FadK） FadK是一種受厭氧調節(jié)的短鏈酰基輔酶A合成酶，偏愛短鏈脂肪酸底物（＜10個碳原子）。FadK的分子量為62.77 kD，酶促機制與FadD類似，其表達在有氧生長過程中受到抑制，而在無氧條件下以延胡索酸為末端電子受體時大量表達［16］。

?；o酶A脫氫酶（FadE） FadE是一個電子轉移黃素蛋白，分子量為75 kD，含有FAD輔因子［7］。在飽和脂肪酸的β-氧化途徑中，F(xiàn)adE催化?；o酶A脫氫形成C=C雙鍵。大腸桿菌野生型菌株可在十二酸或油酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，而fadE缺失突變體則不能，但二者均在含醋酸的培養(yǎng)基上生長良好［17］，表明FadE具有鏈長特異性，且是大腸桿菌利用十二酸和油酸等脂肪酸所必須的關鍵酶。由于FadE底物是脂酰輔酶A，其難以通過化學合成，因此，F(xiàn)adE的酶功能驗證受阻［18］。

脂肪酸β-氧化多酶復合體（FadA與FadB）大腸桿菌脂肪酸β-氧化多酶復合體由fadA和fadB兩個基因編碼，形成fadBA操縱子。脂肪酸β-氧化多酶復合體是大腸桿菌在脂肪酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行有氧生長所必需的關鍵酶。FadB和FadA形成了一種四聚體復合物［19］，具有較寬的鏈長度特異性，幾乎參與所有鏈長底物的降解［7］。

FadA是大腸桿菌多酶復合體β亞基，具有3-酮脂酰輔酶A硫解酶（3-ketoacyl-CoA thiolase，EC 2.3.1.16）活性，含有387個氨基酸，分子量為40.9 kD。FadA又稱硫解酶I，底物鏈長特異性范圍較寬，在脂肪酸β-氧化循環(huán)中負責硫解反應，釋放兩個碳原子，生成乙酰輔酶A。

FadB是大腸桿菌多酶復合體α亞基，分子量為79.6 kD，具有2-烯酰輔酶A水合酶（2-enoyl-CoA hydratase，ECH）活性，催化2-烯酰輔酶A（2-enoyl-CoA）為3-羥酰輔酶A（3-hydroxyacyl-CoA），還具有3-羥酰輔酶A脫氫酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase）活性，催化3-羥酰輔酶A形成3-酮酯酰輔酶A（3-ketoacyl-CoA）。

Wu等［5］報道了FadB可催化2-烯酰輔酶A形成（S）-或（R）-3-羥酰輔酶A，其中催化合成（S）-3-羥酰輔酶A的水合酶包含一個ECH-1結構域，催化合成（R）-3-羥酰輔酶A的水合酶包含一個ECH-2結構域。ECH-1與ECH-2有類似的活性位點和幾何結構，并成鏡像對稱［5］。ECH-1具有水合酶活性，可逆催化反式-2-烯酰輔酶A合成（S）-3-羥酰輔酶A；ECH-2具有差向異構酶（epimerase）活性［7］（圖1），可將（R）-3-羥酰輔酶A（亦稱為D-3-羥酰輔酶A）中間體轉化為（S）-3-羥酰輔酶A（亦稱為L-3-羥酰輔酶A），參與不飽和脂肪酸β-氧化途徑。若缺少該差向異構過程，順式脂肪酸難以進入β-氧化途徑。

2，4-二烯酰輔酶A還原酶（FadH） 大腸桿菌中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nnicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴的FadH的分子量為72.55 kD，其N端包含F(xiàn)AD結合域，C端含有NADPH結合域［7］。FadH參與2，4-位不飽和雙鍵脂肪酸β-氧化，催化2，4-二烯酰輔酶A生成3-反式-烯酰輔酶A，再經FadB異構酶活性催化形成2-反式烯酰輔酶A。fadH的表達受FadR和ArcA的雙重調控：FadR強烈抑制fadH的表達；厭氧條件下ArcA失活使fadH轉錄增加3倍以上。長鏈脂肪酸可誘導fadH的表達［20］。

近代以來，霍布斯在將計算與心智結合的過程中扮演了重要的角色，而萊布尼茨為霍布斯的“革命性”嘗試搭建了機械化平臺?；舨妓故堑谝粋€清晰地把思維的句法表述為“計算”的人，他認為，思維就是以計算的形式，處理那些具有普遍性的詞，由此開始了通過數(shù)字的形式把握人類認知的研究。萊布尼茨設計了一種推理機器，即“機器推理者”，用它模擬人類思維的過程。根據(jù)萊布尼茨的解釋，這種推理機器能夠獨立執(zhí)行認知任務，推理沒有必要假借他人之力。盡管這樣的認知系統(tǒng)完全是機械的，跟現(xiàn)代電子計算機沒有可比性，但是它誕生的意義是非凡的，因為它被看作是體現(xiàn)經典計算主義思想萌芽的最早成果。

酰基輔酶A硫酯酶（FadM） FadM是一種長鏈?；o酶A硫酯酶，由132個氨基酸殘基組成，分子量接近15 kD。fadM又名ybaW，屬于脂肪酸降解調節(jié)子的新成員，F(xiàn)adR和全局性調控因子CRP均負調控fadM的表達［21-22］。當大腸桿菌以不飽和脂肪酸油酸為唯一碳源生長時，大部分油酸通過β-氧化途徑完全降解，大約10%的油酸降解為3，5-順式-十四碳二烯酰輔酶A，該中間產物是脂肪酸β-氧化抑制物。FadM可切割3，5-順式-十四碳二烯酰輔酶A的硫酯鍵，生成 3，5-順式-十四二烯酸，并釋放到生長培養(yǎng)基中，在不飽和脂肪酸β-氧化過程中起解毒功能［23-24］。

2 其他細菌中脂肪酸β-氧化研究

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） 枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的脂肪酸β-氧化途徑相似，可產生相同類型的中間代謝產物，且終產物均為乙酰輔酶A［25-27］。二者的主要區(qū)別在于前者具有分解支鏈脂肪酸的能力［26］。枯草芽孢桿菌中全局性轉錄調控因子FadR抑制所有參與脂肪酸降解關鍵酶的編碼基因，其活性可被長鏈脂酰輔酶A抑制［27］。與大腸桿菌的FadD（內膜蛋白）不同，枯草芽孢桿菌脂酰輔酶A合成酶LcfA和LcfB是可溶性蛋白［26］?？莶菅挎邨U菌有多個參與脂肪酸β-氧化的基因，如lcfA、lcfB（yhfL）、fadB（ysiB）、fadN（yusL）、fadA（yusK）和fadE（yusJ）等［27］。敲除fadE、fadN、fadA、etfA、etfB或fadG可顯著影響其對脂肪酸的利用［27］。

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis） 副豬嗜血桿菌是一種常見的豬上呼吸道致病菌和格拉瑟氏病（Gl?sser disease）的病原體，感染可導致纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎，是造成豬高死亡率的主要原因［28］。副豬嗜血桿菌SC096中包含兩個FadD的同源蛋白HAPS_0217和 HAPS_1695（分別稱為FadD1和FadD2），都包含ATP/AMP和FACS（fatty acid-CoA ligases）保守結構域，與大腸桿菌FadD的氨基酸序列相似性很高。FadD對副豬嗜血桿菌的生存至關重要，單敲除fadD1或fadD2的突變菌株易于構建，但雙敲除菌株難以獲得，雙敲除fadD1和fadD2基因能夠有效抑制其群體數(shù)量［28］。研究表明，F(xiàn)adD與副豬嗜血桿菌的致病性密切相關［28-30］。

分枝桿菌（Mycobacterium） 結核分枝桿菌（M.tuberculosis）是結核病的病原體，是全球第九大死亡原因［31］。恥垢分枝桿菌（M.smegmatis）具有快速生長、無致病性、與結核分枝桿菌基因高度同源、細胞結構相似等特點，是分枝桿菌感染及相關免疫學研究的模式菌株。分枝桿菌的一個重要特征是細胞壁含有大量脂質分枝菌酸。結核分枝桿菌基因組中編碼了一百多個與脂肪酸β-氧化相關的基因［32］。Venkatesan等［32］鑒定并解析了其脂肪酸β-氧化多酶復合體（trifunctional enzyme，TFE）的晶體結構。TFE是一種由兩分子FadA和兩分子FadB組成的復合體，能催化脂肪酸β-氧化中水合、脫氫及硫解三種反應［32］。另外，Cox等［31］報道了FadB2無配體晶體的結構。FadB2結晶為二聚體，每個不對稱的結構基元有三個獨特的二聚體拷貝，根據(jù)STRING蛋白網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org）的查詢可知，F(xiàn)adB2可能在功能上（或物理上）與烯酰輔酶A水合酶FadB8和硫解酶FadA2、FadA3、FadA4或FadA6結合。轉錄因子KstR和KstR2調控結核分枝桿菌胞內膽固醇的跨膜轉運和β-氧化過程［33-34］。

最近，Xu等［35］在恥垢分枝桿菌中鑒定出一個TetR-型轉錄因子MmbR，其參與調控脂肪酸β-氧化及生物膜的形成，對維持恥垢分枝桿菌的脂質穩(wěn)態(tài)至關重要。敲除mmbR會導致細胞內脂肪酸含量顯著降低，生物膜的相對脂質組成減少。MmbR負調控脂肪酸β-氧化的一組核心基因（如脂酰輔酶A合成酶編碼基因MSMEG_2231、?；o酶A脫氫酶編碼基因MSMEG_0714、烯酰輔酶A水合酶/異構酶編碼基因MSMEG_2223、3-羥酰輔酶A脫氫酶編碼基因MSMEG_2279、硫酯酶編碼基因MSMEG_2236等約60個基因）的表達。另外，長鏈脂酰輔酶A和脂肪酸對MmbR與DNA的特異性結合具有抑制作用［35］。

黃色黏球菌（Myxococcus xanthus） 黃色黏球菌細胞在子實體發(fā)育過程中產生含有三酰甘油酯的脂質體，是研究脂質代謝對細胞生理與發(fā)育影響的模式生物［36-37］。黃色黏球菌基因組中實際有兩套脂肪酸β-氧化基因，即同源性分析發(fā)現(xiàn)基因組中包含兩組與fadA和fadB同源的基因，MXAN_5371（標注為脫氫酶編碼基因fadJ）和MXAN_5372（標注為硫解酶編碼基因fadI）以及MXAN_6987（標注為fadJ）和MXAN_6998（標注為fadI）。其中，MXAN_5371和MXAN_5372在黃色黏球菌生長至脂質體積累的高峰期（18 h）表達量上調，而MXAN_6987和MXAN_6998的表達量無變化［38-39］。敲除fadJ（MXAN_5371和MXAN_6987）和fadI（MXAN_5372）基因會嚴重影響黃色黏球菌的多細胞形態(tài)發(fā)生和孢子形成［36］。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 銅綠假單胞菌是常見的環(huán)境微生物，也是重要的條件致病菌，可通過降解肺表面活性物質的重要成分磷脂酰膽堿引起肺纖維化。磷脂酰膽堿的主要成分之一是長鏈脂肪酸，其降解主要通過β-氧化途徑進行。銅綠假單胞菌PAO1菌株包含兩個脂酰輔酶A合成酶基因，分別命名為fadD1和fadD2，兩個FadD都包含ATP/AMP和脂肪酸結合的結構域，與大腸桿菌FadD高度同源。FadD1（PA3299）具有長鏈脂肪酸底物的特異性，而FadD2（PA3300）偏愛短鏈脂肪酸。fadD2突變株的脂肪酶、蛋白酶、鼠梨糖脂和磷脂酶分泌量下降，游動性和群集效應減弱，而fadD1突變株僅表現(xiàn)出群集效應能力增強。此外，參與脂肪酸降解的基因還包括fadAB1（PA1737& PA1736）、fadAB4（PA4786 & PA4785）以及fadBA5（PA3014 & PA3013）三個操縱子［40］。PsrA（PA3006）是銅綠假單胞菌中一個調控因子，結合并響應長鏈脂肪酸信號，調控fadBA5的表達。在囊性纖維化患者肺部感染期患者體內，降解長鏈脂肪酸的β-氧化酶會高效表達，這與銅綠假單胞菌的營養(yǎng)獲取和致病機制相關［41］。

Zhang等［42］發(fā)現(xiàn)，添加十八烷酸到銅綠假單胞培養(yǎng)體系后，鼠李糖脂生物合成基因rhlA和rhlB的表達量提高了200～600倍，fadA的表達量提高了3～4倍，鼠李糖脂的產量顯著增加。鼠李糖脂作為“綠色”表面活性劑，在工業(yè)、修復和醫(yī)藥領域有多種潛在應用。

羅爾斯通氏菌（Ralstonia eutropha） 羅爾斯通氏菌為革蘭氏陰性β-變形菌，是生物技術中常用的微生物，能夠利用脂肪酸代謝產生的乙酰輔酶A生產大量胞內聚羥基烷酸（polyhydroxyalkanoate，PHA）生物聚合物，亦可利用脂肪酸代謝中間產物合成不同的PHA前體。PHA具有熱塑性和可生物降解特性，可作為塑料的替代品。通過改變羅爾斯通氏菌的脂質和脂肪酸的代謝通路，還可將碳轉化為其他有附加值的化合物，如生物燃料［43］。通過基因組學和轉錄組學測序分析發(fā)現(xiàn)，羅爾斯通氏菌H16有兩個操縱子與脂肪酸β-氧化相關［25,44］。烯酰輔酶A水合酶FadB（H16_A0461）和FadB1（H16_A1526）分別存在于兩個操縱子中。單個缺失這兩個操縱子對其在脂肪酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長沒有顯著影響，而兩個操縱子同時敲除的菌株不能在脂肪酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長［45-46］。

腸道沙門氏菌（Salmonella enterica） 長期以來，人們一直認為大腸桿菌和沙門氏菌具有相同的脂肪酸降解途徑。最近研究表明，二者的β-氧化系統(tǒng)在功能上存在差異［47］。腸道沙門氏菌能在癸酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，而野生型大腸桿菌菌株則不能。辛酸等中鏈脂肪酸可被腸道沙門氏菌完全降解為乙酰輔酶A，大腸桿菌則不能完全降解這些中鏈脂肪酸，這些功能上的差異很可能源于兩個菌株中FadE和FadBA酶活性的不同［47］。沙門氏菌fadD突變體中的重要調控基因hilA的表達量顯著下降，突變體對HEp-2細胞系的侵染能力降低［48］。PhoP/PhoQ雙組分調節(jié)系統(tǒng)對于鼠傷寒沙門氏菌致病性極為重要。Lesley等［49］指出，脂肪酸β-氧化產生的乙酰輔酶A對PhoQ的自激酶活性有抑制作用，因此脂肪酸β-氧化與沙門氏菌的致病性相關。另外，Viarengo等［50］發(fā)現(xiàn)，游離不飽和長鏈游離脂肪酸能特異性抑制PhoP/PhoQ系統(tǒng)，通過敲除脂肪酸代謝相關基因fadL、fadD或fadBA進一步發(fā)現(xiàn)長鏈不飽和脂肪酸對PhoP/PhoQ系統(tǒng)的抑制作用亦可獨立于脂肪酸β-氧化代謝途徑。

天藍鏈霉菌（Streptomyces coelicolor） 天藍鏈霉菌常用于生產臨床使用的抗生素，是一種能夠積累甘油三酯（triacylglycerol，TAG）作為碳和能量儲備的油脂原核生物。由于脂?；歉叨冗€原性的化合物，因此催化TAG降解能產生較高的能量［51］。天藍鏈霉菌能以C4—C18的外源脂肪酸作為唯一的碳源和能量來源，并分別以簡單擴散和主動運輸機制吸收短鏈和長鏈脂肪酸［52］。該菌不僅能利用脂肪酸合成膜的磷脂，還可以利用其合成中性脂質儲能化合物（如TAG）［53-54］。Menendez-Bravo等［55］發(fā)現(xiàn)，天藍鏈霉菌基因組中有9個FadA的同源基因、3個FadB的同源基因以及14個FadE的同源基因。每個假定的fadB基因（SCO6026，SCO6732，SCO6789）都毗鄰對應的fadA（SCO6027，SCO6731，SCO6788），表明可能存在共轉錄；且只有SCO6027-SCO6026（SCOfadAB_1）、SCO6731-SCO6732（SCOfadAB_2）和SCO6788-SCO6789（SCOfadAB_3）這三個基因簇與其他已測序鏈霉菌（如卡特利鏈霉菌、瘡茄病鏈霉菌和灰黃鏈霉菌等）相應基因簇具有同源性和類似明顯的線性關系。所有fadAB基因簇的單敲除和雙敲除菌株（如SCOfadAB_1-SCOfadAB_2-雙敲除）均能在以不同鏈長的脂肪酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，且其生長速率、菌落形態(tài)和抗生素產量與野生菌株無差異，但是，與野生型菌株相比，所有突變菌株的TAG積累量均顯著增加。結果表明，3個SCOfadAB基因簇均參與天藍鏈霉菌的脂肪酸β-氧化［55］?；诿赴被嵝蛄械南到y(tǒng)進化樹分析可知：SCO6732和SCO6789與結核分枝桿菌和馬紅球菌中FadB序列相似性最高（61%～64%）；SCO6026與大腸桿菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌和鼠傷寒沙門菌中的FadB序列更接近。另外在早期的研究中，Zhang等［56］發(fā)現(xiàn)來自天藍鏈霉菌的?；o酶A脫氫酶FadE（AF142581）能夠體外催化短鏈支鏈?；o酶A（如異丁酰輔酶A、異戊酰輔酶A）及直鏈酰基輔酶A（如n-丁酰輔酶A和n-戊酰輔酶A）的氧化反應。

弧菌（Vibrio） 霍亂弧菌（Vibrio cholerae）是一種可引起流行性腹瀉疾病霍亂的革蘭氏陰性菌，脂肪酸代謝與霍亂弧菌的致病性密切相關［57］。霍亂弧菌基因組中與脂肪酸β-氧化相關的基因簇有psrA-fadE1（vc1741-vc1740）、fadE（vc2231）、fadBfadA（vc2758-2759）、fadD（vc1985）、fadH（vc1993）、fadI-fadJ（vc1046-1047）。fadI-fadJ是fadA-fadB的同源基因。FadR和TetR家族轉錄因子VC1741共同調節(jié)脂肪酸的降解。VC1741在體外直接與vc1741-fadE1、fadBA和fadIJ三個基因簇啟動子結合，但不能與fadE基因的啟動子結合［58］。敲除fadD顯著降低了霍亂弧菌中主要毒力基因toxT、ctxAB和tcpA的表達，從而顯著降低霍亂弧菌的致病性［59-60］。

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）能引起嚴重的傷口感染和致命的敗血癥。Brown等［61］在研究創(chuàng)傷弧菌時首次提出FadR在病原體感染動物宿主的能力中所起的作用，其機制與脂肪酸的代謝密切相關。FadR缺失不僅導致其生長速度下降，膜內不飽和脂肪酸水平也同時降低，對小鼠的感染能力缺失。有趣的是，在體外和體內補充不飽和脂肪酸又可以恢復生長和感染能力。fadR缺失突變導致創(chuàng)傷弧菌對淺藍菌素更加敏感，fab相關基因表達明顯下降，飽和脂肪酸的量升高約12%［61］。

3 DSF-家族群體感應信號分子的β-氧化機制

黃單胞菌是一類革蘭氏陰性植物病原細菌，可以侵染400多種主糧和經濟作物，包括水稻、小麥、柑橘、番茄、胡椒、木薯、香蕉、大豆和十字花科蔬菜等［62］。所有黃單胞菌均可合成和分泌一類DSF-家族群體感應信號分子作為語言來相互交流、感應群體密度、調控致病因子表達［63-65］。野油菜黃單胞菌（X.campestrispv.campestris，Xcc）中鑒定的主要DSF-家族群體感應信號分子都屬于一類順式不飽和中鏈脂肪酸，包括順-11-甲基-2-十二碳烯酸（cis-11-methyl-2-dodecenoic acid，DSF），順式-2-十二碳烯酸（cis-2-dodecenoic acid，BDSF），順式，順式-11-甲基十二烷基-2，5-二烯酸（cis，cis-11-methyldodeca-2，5-dienoic acid，CDSF）和順式-10-甲基-2-十二碳烯酸（cis-10-methyl-2-dodecenoic acid，IDSF）［66-70］。Barber等［71］和Slater等［72］發(fā)現(xiàn)，在野油菜黃單胞菌培養(yǎng)過程中，DSF活性在靜止生長早期水平較高，隨后則快速降低；Wang等［67］鑒定了DSF的化學結構后，進一步證實了DSF信號分子濃度在野油菜黃單胞菌生長早期至對數(shù)期較低，隨后迅速升高，在后期又迅速降低；在水稻白葉枯病菌（X.oryzaepv.oryzae，Xoo）KACC10331培養(yǎng)過程中，He等［73］發(fā)現(xiàn)BDSF水平在靜止生長早期達到高峰，隨后降低。這些現(xiàn)象都表明黃單胞菌中存在天然的群體感應信號反轉（turnover）現(xiàn)象。

Bi等［74］詳細分析了野油菜黃單胞菌中的rpfB基因的生化和遺傳學功能，發(fā)現(xiàn)rpfB可以替代大腸桿菌β-氧化途徑中的脂酰輔酶A合成酶基因fadD的功能；野油菜黃單胞菌rpfB缺失突變體不能在以脂肪酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，因此，RpfB具有脂酰輔酶A合成酶活性。在體外反應條件下，純化的RpfB能夠將不同鏈長的脂肪酸轉變?yōu)槠漭o酶A酯，因此Bi等［74］認為經RpfB激活的脂酰輔酶A酯在體內可能被菌株用于膜脂合成，也可能經脂肪酸β-氧化途徑被進一步代謝。為了進一步研究RpfB的酶活性，Zhou等［70］建立了基于液相色譜-質譜聯(lián)用方法定量檢測DSF。利用該檢測方法，Wang等［67］、Zhou等［75］發(fā)現(xiàn)：敲除野油菜黃單胞菌或水稻白葉枯病菌中的rpfB能夠顯著增加DSF和BDSF的生物合成，在野油菜黃單胞菌中過表達rpfB或fadD則顯著降低這兩種信號分子的生物合成；rpfB過表達菌株能快速降解外源添加的DSF和BDSF，而敲除株則無降解能力。點突變脂酰輔酶A連接酶RpfB的必需氨基酸殘基E365能顯著影響其降解DSF信號分子的活性，因此，在野油菜黃單胞菌和水稻白葉枯病菌中RpfB參與DSF和BDSF信號分子的降解。此外，野油菜黃單胞菌基因組上也包含參與大腸桿菌脂肪酸β-氧化所需其他基因的同源基因，如fadA（Xcc1978）、fadB（Xcc1979，Xcc0810）、fadJ（Xcc1266）、fadE（Xcc2870）和fadH（Xcc0933）。初步研究結果證實Xcc1979和Xcc1978參與DSF降解，雖然其他基因的功能尚待驗證，但DSF家族群體感應信號分子降解途徑之一應該通過脂肪酸β-氧化途徑。

與大腸桿菌脂肪酸β-氧化途徑與機理相比，黃單胞菌中DSF信號分子β-氧化至少存在以下兩點獨特現(xiàn)象：1）需要一個差向異構酶將2位順式雙鍵形成的（R）-3-羥酰輔酶A中間體轉化為（S）-3-羥酰輔酶A才能繼續(xù)氧化，這個差向異構酶可能來自FadB（Xcc1979）；2）黃單胞菌中缺少大腸桿菌中調控蛋白FadR的同源基因，rpfB的表達直接受一個全局性轉錄因子Clp調控［70,76］。

非黃單胞菌也合成DSF-家族群體感應信號。銅綠假單胞菌合成順式-2-癸烯酸 （cis-2-decenoic acid）誘導生物膜分散［77］；苛養(yǎng)木桿菌（Xylella fastidiosa）產生順式-2-十四碳烯酸（cis-2-tetradecenoic acid,XfDSF1）和順式-2-十六碳烯酸（cis-2-hexadecenoic acid,XfDSF2）［78-79］；革蘭氏陽性菌變形鏈球菌（Streptococcus mutans）可產生反式-2-癸烯酸SDSF（trans-2-docanoic acid），抑制白色念珠菌從酵母菌形態(tài)向菌絲形態(tài)的轉變［80］。

rpfB、rpfF、rpfC、rpfG基因存在于所有已測序的黃單胞菌屬細菌中。同源的基因簇也存在于苛養(yǎng)木桿菌（Xylella fastidiosa）、寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、溶桿菌（Lysobacter dokdonensis）DS-58、褐色假黃單胞菌（Pseudoxanthomonas spadix）BDA-59、鞭毛甲基小桿菌（Methylobacillus flagellatus）和脫氮硫桿菌（Thiobacillus denitrificans）中。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和伯克霍爾德菌（Burkholderia cenocepacia）也合成BDSF或類似結構的信號分子，兩種菌株中也存在RpfB的同源蛋白［76］。最近，Li等［81］在產酶溶桿菌中鑒定出的兩個RpfB同源蛋白均參與脂肪酸代謝，影響代謝產物HSAF的生物合成。因此，RpfB依賴的脂肪酸β-氧化機制可能是細菌中一類比較保守的氧化機制。

4 特殊結構脂肪酸的β-氧化途徑與機理

常見的偶數(shù)碳飽和脂肪酸通過圖1所示的β-氧化途徑就可以完成代謝，但是，在生物體內還存在帶有特殊結構的脂肪酸，如超長鏈脂肪酸（22個碳原子以上）、不飽和脂肪酸和支鏈脂肪酸等。基于目前的研究結果，這些特殊結構脂肪酸的基本氧化途徑應該與常見的偶數(shù)碳飽和脂肪酸的β-氧化代謝途徑類似，只不過針對其特殊的結構或基團需要相應的特殊酶參與修飾，修飾后的酯酰輔酶A再進入偶數(shù)碳飽和脂肪酸的β-氧化途徑［1］。

超長鏈脂肪酸的α-氧化和β-氧化 細菌能夠通過β-氧化降解?；滈L度超過20的脂肪酸，且針對不同底物的β-氧化，至少有三種不同的氧化策略，包括獲得異構體、利用適應性活性位點和非同系酶的功能整合［1］。而真核生物細胞內超長鏈脂肪酸（C18—C26）的氧化會先在過氧化物酶體結構中完成，其α-氧化途徑過程基本與線粒體中的β-氧化途徑相似，但催化的酶卻有所不同。最明顯差別是第一步催化酶不是脫氫酶而是氧化酶（acyl-CoA oxidase），催化形成trans-Δ2-enoyl-CoA和過氧化氫。Trans-Δ2-enoyl-CoA遵循β-氧化途徑，經過多輪循環(huán)得到鏈縮短的β-keto-acyl-CoA，然后轉運到線粒體中通過β-氧化途徑完全氧化。細菌中超長鏈脂肪酸的降解是否遵循同樣機制有待進一步驗證。

不飽和脂肪酸的β-氧化 由于偶數(shù)碳飽和脂肪酸的β-氧化途徑中專門有FadE-介導的脫氫形成雙鍵反應，因此，不飽和脂肪酸中每個雙鍵要少一次脂酰輔酶A脫氫過程，減少一個FADH2的產生。除了雙鍵導致的能量差異之外，雙鍵的位置和構型也會影響β-氧化的進行。雙鍵在脂酰輔酶A的3位時也不能被脂酰輔酶A脫氫酶催化，需要額外的異構酶異構到2位才行；此反應由Δ3-烯脂酰輔酶A異構酶1（cis-Δ3-enoyl CoA isomerase，ECI1）催化，不論順式和反式，均生成2位的反式雙鍵。例如油酸在9位有一個順式雙鍵，三個循環(huán)后形成Δ3-順烯脂酰輔酶A，經異構生成Δ2-反烯脂酰輔酶A，即可繼續(xù)氧化。雙鍵在脂酰輔酶A的2位時，該2位雙鍵不論順式還是反式都可以被水化為β-羥脂酰輔酶A，但順式2位雙鍵水化生成的是D-型產物，該D-型產物還需要在β-羥脂酰輔酶A差向異構酶（epimerase）作用下轉變?yōu)長-型，才能繼續(xù)被氧化。含有多個不飽和雙鍵的脂肪酸氧化與單個雙鍵脂肪酸類似，兩個雙鍵位置分別位于2位和4位時構成2，4-位的共軛雙鍵，還需要消耗一個NADPH，由2，4-二烯酰輔酶A還原酶（2，4-Dienoyl CoA reductase，DECR1）將其還原生成帶3位反式雙鍵的Δ3-反烯脂酰輔酶A（trans-Δ3-enoyl CoA），再由Δ3-烯脂酰輔酶A異構酶異構到2位形成Δ2-反烯脂酰輔酶A后進入正常β-氧化途徑。

β位有甲基側鏈脂肪酸的β-氧化 具有甲基結構的脂肪酸可與某些代謝途徑耦聯(lián)（如α-氧化途徑）再進一步發(fā)生β-氧化，或者利用活性位點的多樣性、引入輔助酶和利用異源酶進一步完成脂肪酸氧化［1］。α-氧化途徑主要用于降解一些特殊的脂肪酸，如3位（β位）帶有側鏈結構的脂肪酸。α-氧化先由酯酰輔酶A羥化酶（hydroxylase）在α-位（C2位）羥化形成2-羥基酯酰輔酶A，然后由2-羥基酯酰輔酶A裂解酶（lyase）在1、2位之間裂解，放出一個甲酰輔酶A，得到截短一個碳的脂肪醛，通過脫氫酶（dehydrogenase）轉化為脂肪酸，再進行正常氧化、活化和β-氧化降解。

脂肪酸的ω-氧化 ω-氧化可以在脂肪酸的末位碳上引入羥基，再依次氧化為醛基和羧基，形成二羧酸。參與的酶依次為ω-羥化酶、醇脫氫酶和醛脫氫酶。ω-羥化酶屬于細胞色素P450家族，羥化反應需要分子氧和NADPH。也有報道稱ω-氧化可以降解α-氯化脂肪酸［82］。有些微生物可以通過ω-氧化將烷烴轉化為脂肪酸，可用于環(huán)保方面，如清除泄漏的石油之類。ω-氧化通常是次要脂肪酸氧化途徑。在某些病理狀態(tài)下，如糖尿病，長期飲酒和饑餓時，或者肉堿穿梭缺陷導致β-氧化被阻斷時，相關中間體會積聚，此時ω-氧化就會作為一種補償而上調［83］。

5 總結與展望

目前大腸桿菌中偶數(shù)碳飽和脂肪酸降解途徑中的關鍵酶的功能、多酶復合體、代謝途徑和調控機理已基本闡明，是初級代謝中研究得最為透徹的代謝途徑之一，其他細菌中脂肪酸的氧化途徑和機理也正逐步展開。作者認為以下幾個方面有待深入探究：1）脂肪酸降解途徑中的多個步驟通過FadBA復合體完成，其底物的選擇性和酶活性及其分子機理有待進一步闡明；2）參與細菌中許多特殊結構的脂肪酸降解的基因及其作用機理還有待深入研究；3）細菌中脂肪酸β-氧化過程中關鍵酶的多態(tài)性及其生物學功能值得研究；4）細菌中脂肪酸β-氧化途徑與其他代謝途徑的關聯(lián)和交叉值得深入研究；5）利用合成生物學原理改造β-氧化途徑，合成有應用價值的產品應該是未來的一個重要方向；6）在動植物與微生物互作條件下，脂肪酸降解途徑介導的信號傳導及免疫應答分子機制值得深入探究。上述問題的闡明將有助于深入了解細菌生存及環(huán)境適應性機理，為利用、改造和防控細菌提供了豐富的新靶點和新思路。