軸突導(dǎo)向因子G1在肝細(xì)胞癌患者血清和組織中的表達(dá)及其臨床意義

高星 葉甲舟 樸雪岷 李永強(qiáng) 林燕 梁嶸

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1化療一科，2肝膽胰外科

肝細(xì)胞癌是全球第六大常見(jiàn)癌癥，也是導(dǎo)致癌癥患者死亡的第三大主要原因[1]。早期肝細(xì)胞癌經(jīng)過(guò)規(guī)范治療后，5年生存率可達(dá)60%～80%。然而肝細(xì)胞癌起病隱匿，約2/3的患者初診時(shí)已達(dá)臨床晚期，無(wú)法手術(shù)，生存期往往不足1年[2]。目前肝細(xì)胞癌篩查主要還是依賴血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）檢測(cè)，但臨床上有近1/3的患者AFP陰性；而且急性病毒肝炎活動(dòng)期及胃癌等疾病也常出現(xiàn)AFP升高。因此，尋找新的早期肝細(xì)胞癌標(biāo)志物尤為重要。

軸突導(dǎo)向因子G1（netrin-G1，NTNG1）位于1號(hào)染色體1p13.3區(qū)，編碼539個(gè)氨基酸，由10個(gè)外顯子組成，大小約為60.5 kDa，屬于神經(jīng)突起生長(zhǎng)導(dǎo)向因子Netrins家族的一員[3]。NTNG1最早于2000年在小鼠的中腦和后腦中被發(fā)現(xiàn)，屬于Netrin家族中的膜結(jié)合蛋白型，在其C末端具有糖基磷脂?；煎^（glycosylphosphatidylinositol，GPI），通過(guò)結(jié)合GPI實(shí)現(xiàn)與細(xì)胞膜結(jié)合[4]。生理狀態(tài)下，NTNG1主要在腦組織表達(dá)，在軸突導(dǎo)向具有重要作用，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也起重要的調(diào)控作用。目前NTNG1已被發(fā)現(xiàn)在胰腺、肺和乳腺等多臟器中表達(dá)，并調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程，如細(xì)胞介導(dǎo)、黏附、遷移和血管生成等[5-6]。HAO等[7]基于數(shù)據(jù)挖掘和深層生物學(xué)信息分析發(fā)現(xiàn)，NTNG1在肺腺癌低表達(dá)，而在肺鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，但均與較差的生存率呈正相關(guān)。FRANCESCONE等[8]也報(bào)道NTNG1在胰腺癌組織中高表達(dá)，而與生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)；在裸鼠體內(nèi)敲低NTNG1表達(dá)后成瘤能力削弱。然而，NTNG1與肝細(xì)胞癌的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)NTNG1在肝細(xì)胞癌患者血清及其組織中的表達(dá)，并分析其臨床意義，以期尋找新的肝細(xì)胞癌標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2019年7月至2019年10月本院收治的26例肝細(xì)胞癌患者，以及同期于本院門診就診的4例肝炎患者、19名健康受試者、41例其他腫瘤患者（結(jié)直腸癌14例，卵巢癌10例，胰腺癌10例，膀胱癌7例）血清，平均年齡（52.02±13.30）歲，男性63例，女性27例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴肝癌患者均經(jīng)術(shù)后病理診斷均為肝細(xì)胞癌，術(shù)前未經(jīng)化療、放療及靶向治療；⑵肝炎患者符合乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑶健康受試者肝功能生化指標(biāo)正常；⑷其他惡性腫瘤患者均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查明確診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：血清標(biāo)本溶血、脂血。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

收集2018年7月至2019年12月本院手術(shù)切除的63例肝細(xì)胞癌組織及其相應(yīng)鄰近癌旁組織（距離癌組織2 cm以上）。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴初治且接受肝切除術(shù)治療；⑵經(jīng)術(shù)后病理診斷為肝細(xì)胞癌，無(wú)其他惡性腫瘤疾病史；⑶術(shù)前均未接受化療、放療或靶向治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴因肝細(xì)胞癌破裂出血行急診手術(shù)者；⑵病歷資料不完整或圍手術(shù)期死亡者；⑶隨訪時(shí)間＜3個(gè)月者；⑷合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎、腦等疾病者。本研究方案經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理與研究委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得患者書(shū)面知情同意。

1.2 資料收集與隨訪

查閱病歷收集患者性別、年齡、飲酒史、吸煙史以及乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染情況、BCLC分期、TNM分期、HBsAg、AFP、病理性微衛(wèi)星灶、微血管侵犯、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、是否合并肝硬化、有無(wú)癌栓等臨床資料。出院后2年內(nèi)每3個(gè)月電話隨訪1次，之后每6個(gè)月隨訪1次，隨訪截至2021年7月2日。研究終點(diǎn)為總生存期（overall survival，OS），OS定義為手術(shù)日至患者死亡或末次隨訪的時(shí)間。失訪或末次隨訪仍未死亡的病例作為截尾事件。

1.3 ELISA法檢測(cè)血清中NTNG1的表達(dá)

抽取患者清晨空腹靜脈血10 mL，室溫凝集30 min，4 000× g離心20 min后，所得血清置于-80℃冰箱保存、備用。將試劑DLCN20（美國(guó)R&D公司）復(fù)溫，每孔中加入100 μL稀釋液后，分別放入等量的標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)驗(yàn)血清樣品，4℃孵育2 h，加入200 μL偶聯(lián)試劑，4℃孵育2 h，用洗滌液清洗后加入200 μL底物溶液，室溫孵育30 min后加入終止液，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的吸光度（OD）值。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品計(jì)算血清中NTNG1的濃度。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組織中NTNG1的表達(dá)

分別取100 mg新鮮肝細(xì)胞癌及癌旁組織，加入RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司）提取組織蛋白，嚴(yán)格按照BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)蛋白濃度。每孔加入30～50 μg標(biāo)準(zhǔn)化蛋白樣品，在加滿Tris-Glycine電泳液的垂直電泳槽內(nèi)，濃縮膠在80 V恒壓下電泳至分離膠界面時(shí)，調(diào)至120 V繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)分離膠底部。轉(zhuǎn)移至聚PVDF膜，加入一抗NTNG1（ab153834，1∶1 500）4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后，加入二抗（ab205719，1∶10 000）室溫孵育1 h；取出PVDF膜，洗膜后滴加ECL工作液反應(yīng) 2～5 min；于暗室內(nèi)壓片、顯像。以Image J軟件檢測(cè)條帶灰度值，以目標(biāo)條帶灰度值與β-actin（ab179467，1∶5 000）條帶灰度值的比值代表各組織中NTNG1蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用GraphPad Prism 8.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形處理。計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，則采用獨(dú)立樣本t檢檢，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；若不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)（上、下四分位數(shù)）表示。采用配對(duì)設(shè)計(jì)的Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)比較肝細(xì)胞癌組織及其癌旁正常組織中NTNG1蛋白表達(dá)水平的差異，并采用χ2檢驗(yàn)NTNG1蛋白與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。用Kaplan-Meier法計(jì)算總生存率并繪制生存曲線，組間差異比較采用Log-rank檢驗(yàn)。采用單因素Cox回歸分析影響患者OS的相關(guān)因素，將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入多因素Cox回歸模型。血清中NTNG1表達(dá)水平不符合正態(tài)分布，首先采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，繼而進(jìn)行Bonferroni檢驗(yàn)。診斷試驗(yàn)的評(píng)價(jià)采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并根據(jù)約登指數(shù)的最大值確定最佳臨界值。以雙側(cè)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NTNG1在肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，NTNG1蛋白在肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織中均有不同程度表達(dá)，見(jiàn)圖1A。NTNG1蛋白在肝細(xì)胞癌組織的平均表達(dá)量為1.0164，在癌旁組織中為0.6088，肝細(xì)胞癌組織中NTNG1蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.374，P=0.001），見(jiàn)圖1B。結(jié)果說(shuō)明NTNG1蛋白在肝細(xì)胞癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。

圖1 63例肝細(xì)胞癌患者癌組織及其癌旁組織中NTNG1蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of NTNG1 protein in carcinoma and adjacent tissues of 63 patients with hepatocellular carcinoma

2.2 NTNG1蛋白表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系

肝細(xì)胞癌組織中NTNG1表達(dá)與患者年齡、門脈高壓、腹水、AFP、白細(xì)胞水平、總膽紅素水平、包膜侵犯及微血管密度相關(guān)（均P＜0.05）；與性別、BCLC分期、分化程度等無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 NTNG1表達(dá)與63例肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的相關(guān)性Tab.1 Correlation between NTNG1 protein expression and the clinicopathological characteristics in 63 hepatocellular carcinoma patients

2.3 NTNG1表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者OS的關(guān)系

63例患者隨訪截至2021年7月，中位隨訪22個(gè)月（范圍：2～27個(gè)月），其中死亡17例。Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，NTNG1低表達(dá)組的總生存率高于NTNG1高表達(dá)組（χ2=6.715，P=0.010）。見(jiàn)圖2。

圖2 NTNG1高表達(dá)與低表達(dá)肝細(xì)胞癌患者的生存曲線Fig.2 Survival curves of hepatocellular carcinoma patients with high and low expression of NTNG1

2.4 影響肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的單因素和多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，性別、BCLC分期、TNM分期、腫瘤大小、NTNG1表達(dá)水平與預(yù)后相關(guān)（均P＜0.05）。

多因素分析結(jié)果顯示，NTNG1高表達(dá)是肝細(xì)胞癌患者術(shù)后預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=3.715，95%CI=1.207～11.439，P=0.022），男性是肝細(xì)胞癌患者術(shù)后預(yù)后不良的獨(dú)立保護(hù)因素（HR=0.180，95%CI=0.057～0.563，P=0.003）。見(jiàn)表2。

表2 Cox回歸分析影響肝細(xì)胞癌患者術(shù)后總生存期的因素Tab.2 Cox analysis of factors affecting postoperative overall survival in hepatocellular carcinoma patients

2.5 肝細(xì)胞癌患者及各對(duì)照組患者血清中NTNG1表達(dá)水平

ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌患者血清中NTNG1的表達(dá)水平高于健康受試者（P＜0.0001），也明顯高于其他腫瘤患者（P＜0.0001），見(jiàn)圖3。

圖3 NTNG1在肝細(xì)胞癌患者及各對(duì)照組患者血清中的表達(dá)情況Fig.3 Expression levels of NTNG1 in serum of patients with hepatocellular carcinoma and each control group

2.6 血清NTNG1在肝細(xì)胞癌中的診斷價(jià)值

采用ROC曲線評(píng)估肝細(xì)胞癌患者以及對(duì)照組（包括肝炎患者、健康受試者、其他腫瘤患者）共90例受試者血清NTNG1的診斷價(jià)值，繪制肝細(xì)胞癌區(qū)別于非肝細(xì)胞癌患者的ROC曲線，當(dāng)NTNG1以69.50 pg/mL為臨界值時(shí)，診斷肝細(xì)胞癌的靈敏度和特異度達(dá)到最佳，分別為84.62%和76.56%，ROC曲線下面積（area under curve，AUC）為 0.8251（95%CI：0.7298～0.9205，P＜0.0001），見(jiàn)圖4。

圖4 肝細(xì)胞癌患者血清NTNG1的ROC曲線Fig.4 The ROC curve of NTNG1 in serum of patients with hepatocellular carcinoma

3 討論

肝細(xì)胞癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多因素的過(guò)程，包含一系列抑癌基因失活和癌基因異常激活[9]。肝細(xì)胞癌發(fā)展過(guò)程中，多種與細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子信號(hào)發(fā)生異常表達(dá)或激活，這決定了肝細(xì)胞癌高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特點(diǎn)，進(jìn)一步導(dǎo)致患者預(yù)后不良。因此，深入探索肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因，對(duì)開(kāi)發(fā)肝細(xì)胞癌新的診斷、藥物標(biāo)靶和預(yù)后標(biāo)志物具有重要意義。

Netrins作為一類自分泌蛋白或膜結(jié)合蛋白，可以通過(guò)結(jié)合不同類型受體發(fā)揮不同作用。最初Netrins在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展中起重要作用，包括調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的遷移、分化和凋亡，并穩(wěn)定血腦屏障，限制免疫細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[10]。此外，Netrins也參與一些非神經(jīng)組織的黏附、遷移和分化等生理過(guò)程，如血管生成、淋巴管形成和炎癥等[11]?，F(xiàn)有研究也顯示，Netrins參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，在不同類型腫瘤中發(fā)揮抑制或促進(jìn)作用[12]。如有研究報(bào)道NTN1在膀胱癌[13]、胃癌[14]、非小細(xì)胞肺癌[15]等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常升高。然而，在早期胰腺癌組織中NTN1呈低表達(dá)，并通過(guò)下調(diào)MEK/ERK通路和抑制整合素β4（ITGB4）表達(dá)而抑制早期胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[16]。NTNG1作為Netrins家族的新興角色，同樣發(fā)揮類似功能[7]。有研究報(bào)道在結(jié)腸癌中，NTNG1高表達(dá)患者發(fā)生DNA甲基化的頻率增加，且與患者預(yù)后不良相關(guān)[17]。而在無(wú)蒂鋸齒狀腺瘤/息肉（SSA/P）和鋸齒狀腺瘤標(biāo)本中，ANDREW等[18]研究發(fā)現(xiàn)NTNG1的甲基化區(qū)域存在差異性，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)其甲基化狀態(tài)，有助于描述SSA/P的生物學(xué)特性，成為患者鑒定和監(jiān)測(cè)指標(biāo)。本研究檢測(cè)NTNG1蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，NTNG1在肝細(xì)胞癌組織中顯著高表達(dá)，且與患者年齡、門脈高壓、腹水、AFP、白細(xì)胞水平、總膽紅素水平、腫瘤包膜及微血管密度等不良特征相關(guān)，生存分析也顯示NTNG1高表達(dá)患者預(yù)后不良，進(jìn)一步行Cox回歸分析證實(shí)NTNG1高表達(dá)是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明NTNG1可能參與肝細(xì)胞癌發(fā)生并在其中發(fā)揮促癌作用。

相對(duì)于肝組織標(biāo)本，血清檢測(cè)具有創(chuàng)傷性小、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，也更利于臨床推廣。為此，本研究采集了門診就診的肝細(xì)胞癌患者以及對(duì)照患者包括肝炎患者、健康受試者、其他腫瘤患者等共90例受試者血清，結(jié)果所有受試者均能檢測(cè)到NTNG1表達(dá)，且肝細(xì)胞癌患者血清中NTNG1的表達(dá)水平明顯高于健康受試者及其他腫瘤患者，與其在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)類似；此外ROC曲線分析顯示，NTNG1診斷肝細(xì)胞癌的AUC為0.8251，靈敏度和特異度分別為84.62%和76.56%，說(shuō)明NTNG1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)具有一定特異性，且診斷效能良好，可能是潛在的肝細(xì)胞癌早期診斷標(biāo)志物。

綜上所述，NTNG1在肝細(xì)胞癌患者組織及血清中呈高表達(dá)，且NTNG1高表達(dá)是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，血清NTNG1對(duì)肝細(xì)胞癌患者也具有良好的診斷效能，因此NTNG1可能是肝細(xì)胞癌患者潛在的早期診斷及預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。但本研究為單中心小樣本分析，NTNG1在肝細(xì)胞癌中的作用仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。