miR-7及SP-1與非小細(xì)胞肺癌患者放療敏感性的相關(guān)性研究

唐朝 李建民 潘嬋苑 譚文文 劉慧

作者單位：410000 長沙 湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院（湖南省人民醫(yī)院）呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

肺癌是目前人類因癌癥死亡的主要原因之一，在全球癌癥相關(guān)死亡中肺癌占20%以上，而非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的80%[1-2]。放療是不可手術(shù)切除NSCLC患者的主要治療方案，術(shù)后放療也可使患者獲益[3]，因此放療敏感性的預(yù)測生物標(biāo)志物成為臨床關(guān)注的焦點(diǎn)之一。微小核糖核酸（miRNAs）可通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)揮腫瘤抑制或促癌基因作用[4]。既往研究顯示，miR-7作為一種腫瘤抑制因子，主要通過激活表皮生長因子受體信號通路增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放射敏感性[5]。特異性蛋白 1（specific protein 1，SP-1）是腫瘤發(fā)生、DNA雙鏈斷裂修復(fù)和調(diào)節(jié)腫瘤放射敏感性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)報道SP-1表達(dá)受到上游miR-7調(diào)控[6]。然而miR-7及其下游靶分子SP-1對NSCLC放療敏感性的作用尚未明確。本研究旨在探討miR-7及SP-1與NSCLC患者術(shù)前放療敏感性的關(guān)系，以期尋找NSCLC放射增敏靶點(diǎn)和預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2018年7月—2020年9月于本院治療的116例原發(fā)性NSCLC患者癌組織及其匹配的癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞2 cm），所有組織切除后立即置于液氮中，-80℃冰箱保存。放療前，所有患者均抽取晨起空腹靜脈血5 mL，離心后留取上清樣本并保存于-80℃冰箱中。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴初診，接受放療進(jìn)行根治性切除術(shù)；⑵放療前未接受化療、手術(shù)、靶向治療等抗腫瘤治療；⑶ECOG狀態(tài)評分0～2分；⑷具有RECIST規(guī)定的可測量病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴同步放化療或放療期間接受其他抗腫瘤治療的患者；⑵既往有胸部放療史和重要器官功能障礙患者。所有患者在完成放療計劃后評估治療反應(yīng)。本研究遵循赫爾辛基宣言，研究方案獲得本院倫理委員會的批準(zhǔn)，患者或家屬簽署知情同意書允許使用其臨床資料。

1.2 放療方案及療效評估

采用3～7野共面三維適形或調(diào)強(qiáng)放射治療，處方劑量為 45.0～50.4 Gy，常規(guī)分割 25～28次，單次劑量1.6～1.8 Gy（6～18 MV X射線），每周5次，共5.0～6.5周。使用PET/CT和四維CT制定放射計劃，計劃靶體積（planning target volume，PTV）邊緣距離臨床靶體積0.5～1.5 cm。2～3周后進(jìn)行根治性切除術(shù)，根據(jù)Dowrak/Rodel標(biāo)準(zhǔn)評估腫瘤退縮程度（tumor regression grading，TRG），0級：完全退縮；1級：＜25%腫瘤區(qū)域纖維化；2級：26%～50%腫瘤區(qū)域纖維化；3級：＞50%腫瘤區(qū)域纖維化；4級：無活性退縮細(xì)胞（完全緩解）。將TRG 4級定義為放療敏感，其余定義為放療抵抗。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR法檢測miR-7的表達(dá)水平

取250 μL血清加入TRIzol試劑（TaKaRa，日本）750 μL，或者在進(jìn)行研究前取出凍存的組織研成粉，加入1 mL TRIzol試劑混勻。將溶液高速渦旋15 s，孵育5 min。用Qiagen miRNeasy Mini試劑盒或miRNA血清提取試劑盒（Qiagen，德國）提取組織勻漿和血清中總RNA。采用紫外分光光度計測定RNA的濃度，凝膠電泳檢測RNA的完整性。再使用miRNA First Strand cDNA合成試劑盒（TaKaRa，日本）合成cDNA。取1 μg cDNA模板，用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，日本）試劑盒配制PCR反應(yīng)體系20 μL，在ABI 7500型實(shí)時熒光定量熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，94℃預(yù)變性2 min，1個循環(huán)；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35次循環(huán)。miR-7正向引物：5′-GGCAGACTGTGATTTGTTGTCG-3′；miR-7反向引物：5′-GTTGGCCTAGTTCTGTGTGGA-3′。加入外源性celmiR-39作為小分子內(nèi)參，采用2-△△Ct計算miR-7表達(dá)水平。

1.4 免疫組化檢測SP-1蛋白表達(dá)水平

取福爾馬林固定、石蠟包埋的組織蠟塊，連續(xù)切片（4～5 μm），脫蠟水化。染色前用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液處理，雙重內(nèi)源封閉劑封閉切片的內(nèi)源蛋白結(jié)合和過氧化物酶活性10 min，然后用緩沖液洗滌。切片與SP-1特異性抗體孵育30 min，洗滌后再將切片與EnVision、雙連接試劑（與山羊抗小鼠免疫球蛋白和辣根過氧化物酶結(jié)合的聚合物）孵育30 mim。洗滌后，用二氨基聯(lián)苯胺和過氧化氫處理得到最終產(chǎn)物。加入顯色劑后觀察染色情況。

SP-1蛋白主要存在細(xì)胞核，根據(jù)著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例乘積判斷SP-1免疫組化結(jié)果，其中著色強(qiáng)度分為0分（陰性染色）、1分（淺黃色）、2分（棕黃色）、3分（褐色、黑色）；陽性細(xì)胞占比判定：1分（≤10%）、2分（11%～50%）、3分（51%～75%）、4分（＞75%）。SP-1陽性定義為染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)積分乘積≥3。組織化學(xué)染色和TRG評估結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立完成。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性，服從正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；但NSCLC患者腫瘤組織和癌旁組織miR-7表達(dá)水平比較采用配對樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析。偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；分類資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，但癌旁組織和腫瘤組織中SP-1陽性表達(dá)比較采用配對χ2檢驗(yàn)。采用Logistic回歸分析影響NSCLC患者放射敏感性的因素。Pearson相關(guān)分析檢驗(yàn)血清miR-7與腫瘤組織miR-7表達(dá)的關(guān)系，受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清miR-7 表達(dá)預(yù)測 NSCLC 放射敏感性的價值。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-7、SP-1在NSCLC患者中的表達(dá)情況

實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織中miR-7的相對表達(dá)量低于癌旁組織（0.596±0.242vs1.072±0.288，P＜0.001）。免疫組化檢測結(jié)果顯示，癌組織中SP-1陽性表達(dá)率高于癌旁組織（70.69%vs39.66%，P＜0.001），見圖1。Pearson相關(guān)分析顯示，血清中miR-7的表達(dá)水平與其在癌組織中表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.492，P＜0.001），見圖2。SP-1表達(dá)陽性患者血清中的miR-7相對表達(dá)量低于陰性表達(dá)患者（0.18±0.10vs0.24±0.11，P=0.005）。

圖1 免疫組化檢測NSCLC癌組織及其癌旁組織中SP-1蛋白的表達(dá)（×200）Fig.1 SP-1 protein expression in NSCLC tumor tissues and adjacent tissues detected by immunohistochemical staining(×200)

圖2 血清miR-7表達(dá)與腫瘤組織miR-7表達(dá)的相關(guān)性Fig.2 Correlation between serum miR-7 expression and tumor tissue miR-7 expression

2.2 miR-7及SP-1表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

miR-7及SP-1表達(dá)與T分期、TNM分期、吸煙、放射性肺損傷均有關(guān)（P＜0.05），其中T3～4分期、TNM分期ⅢA～B期、有吸煙史、發(fā)生放射性肺損傷的NSCLC患者血清和癌組織中miR-7表達(dá)降低（均P＜0.05），癌組織中SP-1陽性表達(dá)率升高（均P＜0.05）。見表1。

表1 血清miR-7、組織miR-7及SP-1表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between the expression of serum miR-7,tumor tissue miR-7,tumor tissue SP-1 and clinicopathological characteristics in NSCLC patients

2.3 血清中miR-7預(yù)測NSCLC患者放療敏感性的效能

與放射抵抗組比較，放射敏感組患者血清（0.15±0.08vs0.27±0.10，t=7.063，P＜0.001）和癌組織中miR-7表達(dá)水平（0.45±0.17vs0.83±0.15，t=12.285，P＜0.001）明顯升高，而SP-1陽性表達(dá)率降低（87.32%vs46.67%，χ2=22.370，P＜0.001）。

ROC曲線顯示，血清中miR-7預(yù)測NSCLC患者發(fā)生放射抵抗的曲線下面積（AUC）為0.822（95%CI：0.746～0.897，P＜0.001），截斷值為0.17，靈敏度和特異度分別為0.844、0.662，約登指數(shù)為0.506。見圖3。

圖3 血清miR-7對NSCLC患者放療敏感性的ROC曲線Fig.3 ROC curve of serum miR-7 to radiotherapy sensitivity of NSCLC patients

2.4 NSCLC患者放療敏感性的單因素和多因素分析

采用Logistic模型分析影響NSCLC患者放療敏感性的因素，血清miR-7以ROC曲線的截斷值作為分界值進(jìn)行賦值，單因素Logistic回歸分析顯示，腫瘤T分期、TNM分期、吸煙史、放射性肺損傷、血清miR-7水平與放療敏感性有關(guān)（均P＜0.05）；將上述變量納入多因素Logistic模型，結(jié)果顯示腫瘤T分期、TNM分期以及血清miR-7水平是影響放療敏感性的獨(dú)立因素（均P＜0.05）。見表2。

表2 Logistic模型分析影響NSCLC患者放療敏感性的因素Tab.2 Logistic model analysis of clinical factors affecting radiotherapy sensitivity of NSCLC patients

3 討論

放療是NSCLC治療體系中的重要手段，但是部分患者會產(chǎn)生放射抵抗，導(dǎo)致治療失敗，從而影響患者生存預(yù)后[7-8]。放射線可以同時損傷DNA和核外靶點(diǎn)，通過激活多種信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。miRNAs是信號傳導(dǎo)途徑中重要的調(diào)節(jié)因子，也是反映放射敏感性的有效指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清miR-7水平與放療療效有關(guān)，其表達(dá)水平降低是影響放射敏感性的獨(dú)立危險因素，且miR-7表達(dá)水平與其下游靶基因SP-1表達(dá)密切相關(guān)，因此檢測血清miR-7水平是預(yù)測NSCLC患者放療敏感性的有效途徑，miR-7/SP-1可能是放療增敏的潛在靶點(diǎn)。

既往研究顯示，miR-7在多種腫瘤中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。如ZHU等[10]在人卵巢癌細(xì)胞A2780中發(fā)現(xiàn)，ALKBH5異位表達(dá)增加了細(xì)胞中EGFR的表達(dá)，而miR-7表達(dá)上調(diào)后，這種調(diào)節(jié)機(jī)制被抑制。也有研究在NSCLC組織中發(fā)現(xiàn)miR-7-5p表達(dá)下調(diào)，且上調(diào)miR-7-5p能抑制A549、SPCA-1細(xì)胞增殖、遷移能力[11]。本研究檢測收集的NSCLC患者癌組織也發(fā)現(xiàn)miR-7表達(dá)水平較癌旁組織明顯降低，且隨著腫瘤進(jìn)展，血清和癌組織中miR-7的表達(dá)水平進(jìn)一步降低，說明在NSCLC中miR-7也扮演著抑癌基因角色。此外，miR-7與放療敏感性的關(guān)系也有較多報道。如在乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)miR-7表達(dá)下調(diào)，且過表達(dá)miR-7可通過逆轉(zhuǎn)沉默的致癌環(huán)狀miRNA CDR1as增強(qiáng)細(xì)胞放療敏感性[12]。GUO 等[13]在肺腺癌細(xì)胞（A549）和肺鱗癌細(xì)胞（SK-MES-1）中也發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-7表達(dá)可通過抑制下游SP-1蛋白表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞輻射效應(yīng)，并降低放射后的細(xì)胞存活率。此外，miR-7還能通過激活EGFR信號通路增強(qiáng)多種腫瘤細(xì)胞包括肺癌細(xì)胞放射敏感性[14]，外泌體miR-7通過調(diào)控Bcl-2參與腦照射后未接受照射細(xì)胞的自噬[15]。以上研究說明miR-7可能參與放射抵抗的發(fā)生，本研究也得出類似結(jié)果，即相比放射敏感組，放射抵抗組中血清和癌組織的miR-7水平均降低，且Logistic模型分析顯示血清miR-7水平降低是影響NSCLC患者放療敏感性的獨(dú)立危險因素。

本研究還發(fā)現(xiàn)miR-7表達(dá)水平與其下游靶分子SP-1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。既往研究報道SP-1基因沉默可增加細(xì)胞對DNA損傷的敏感性[16]，也可導(dǎo)致染色體異常積累，進(jìn)而影響DNA修復(fù)。此外，SP-1蛋白還能調(diào)控參與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化及腫瘤發(fā)生等相關(guān)基因。如KINOUCHI等[17]證明敲除SP-1基因可以降低人肺癌細(xì)胞株A549的惡性化潛能，并影響糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。ZHANG等[18]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能以濃度依賴性的方式下調(diào)SP-1表達(dá)水平，進(jìn)而增加肝癌SMMC-7721細(xì)胞的放射敏感性。在肺癌細(xì)胞中，SP-1過表達(dá)通過上調(diào)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族G2的表達(dá)而影響化療耐藥性[19]。SP-1也能通過減少G2/M期宮頸癌細(xì)胞停滯增加放射抗性[20]。關(guān)于miR-7與SP-1的關(guān)系，有研究報道m(xù)iR-7可直接靶向SP-1基因?qū)е缕湎掠畏肿颖磉_(dá)的改變[7，13]。劉文莉等[21]亦通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-7對SP-1有負(fù)性調(diào)控作用。本研究也發(fā)現(xiàn)miR-7水平降低與腫瘤組織中SP-1蛋白表達(dá)升高有關(guān)，說明miR-7可能通過靶向調(diào)控SP-1基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，從而影響腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)放療敏感性，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，NSCLC患者癌組織及外周血清中miR-7表達(dá)水平降低，且血清miR-7低表達(dá)是放療敏感性的獨(dú)立危險因素，檢測血清miR-7水平在預(yù)測放療抵抗中具有良好的效能。而miR-7與其下游靶基因SP-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-7/SP-1軸可能是NSCLC放療增敏的潛在靶通路，為探索NSCLC患者放療抵抗的分子機(jī)制提供了新的思路。