分化型甲狀腺癌原發(fā)灶與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶不同受體表達(dá)差異的研究

王 琪，尹中波，佘麗麗，孫梓程，陳海軍，劉 巖

甲狀腺癌是頭頸部最常見(jiàn)惡性腫瘤，近年其發(fā)病率在全世界處于上升趨勢(shì)，我國(guó)甲狀腺癌已上升至女性惡性腫瘤第5位，發(fā)病率為11.7/10萬(wàn)［1］。甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展受多種因素影響，基因、環(huán)境、生活方式、激素分泌等均會(huì)影響甲狀腺癌的發(fā)生［2］。女性和男性的甲狀腺癌發(fā)病率均從青春期開(kāi)始快速升高，女性在45～54歲達(dá)到高峰，男性在60～64歲達(dá)到高峰，女性患者在絕經(jīng)期后發(fā)病率會(huì)顯著降低［1］。推測(cè)甲狀腺癌的發(fā)生可能與激素水平有關(guān)。

甲狀腺癌的治療方式包括手術(shù)、放療、化療等，目前根治術(shù)是主要治療方法，雖然手術(shù)入路不斷改善，在頸部美容方面取得較好效果，但術(shù)中喉返神經(jīng)及甲狀旁腺的損傷仍時(shí)有發(fā)生［3］。馬蕓等［4］統(tǒng)計(jì)了不同手術(shù)方式術(shù)后喉返神經(jīng)損傷及低鈣血癥的發(fā)生情況，甲狀腺全切術(shù)加頸部淋巴結(jié)清掃、患側(cè)腺體葉及峽部加對(duì)側(cè)大部切除術(shù)后均會(huì)發(fā)生喉返神經(jīng)損傷，兩種術(shù)式術(shù)后均出現(xiàn)了低鈣血癥。如果能結(jié)合內(nèi)分泌治療及靶向治療，將為甲狀腺癌的治療提供新的思路。

目前，臨床已將雌激素受體（Estrogen receptor，ER）、孕激素受體（Progesterone Receptor，PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（Human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）作為乳腺癌患者靶向及內(nèi)分泌治療的依據(jù)，且有多篇文章報(bào)道了乳腺原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶在ER、PR和HER-2表達(dá)上不一致，從而調(diào)整治療方案［5-7］。已有文獻(xiàn)報(bào)道ER、PR拮抗劑可應(yīng)用于甲狀腺癌綜合治療［8］。與乳腺癌一樣，甲狀腺癌內(nèi)分泌治療也需根據(jù)原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶表達(dá)調(diào)整治療方案。甲狀腺癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶在ER、PR等生物學(xué)表達(dá)上是否也存在不一致性，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道?；诖?，本研究選擇臨床最常見(jiàn)的分化型甲狀腺癌患者，觀察患者原發(fā)灶與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶ER、PR及HER-2的表達(dá)情況。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 研究方案經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。前瞻性選取2017年1月～2021年3月于南通市第六人民醫(yī)院行甲狀腺癌根治術(shù)的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理證實(shí)為分化型甲狀腺癌；（2）行單側(cè)甲狀腺癌根治術(shù)及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃；（3）于本院初診，術(shù)前未行其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）甲狀腺癌復(fù)發(fā)；（2）除淋巴結(jié)外伴有其他部位轉(zhuǎn)移；（3）合并其他惡性腫瘤；（4）孕婦。共183例患者符合標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法 切片脫蠟：將切片依次浸入二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ-無(wú)水乙醇Ⅰ和Ⅱ-95%酒精-80%酒精-70%酒精-去離子水沖洗，重復(fù)2次。組織抗原修復(fù)：切片放入修復(fù)盒，加入修復(fù)液浸沒(méi)組織。微波中檔修復(fù)10 min。取出后自然冷卻至室溫后取出玻片，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次。滴加一抗：滴加3%過(guò)氧化氫以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育后PBS沖洗3次。吸干PBS后滴加5%血清，37℃封閉。滴加稀釋好的一抗，每片滴加50 μL，于4°C保濕盒孵育過(guò)夜。滴加二抗：PBS洗片3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min。顯色：PBS洗片4次，滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯色劑覆蓋整個(gè)組織，觀察到顯色后沖洗切片終止顯色。蘇木素復(fù)染：切皮置于蘇木素內(nèi)染色，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用自來(lái)水沖洗。封片：切片水洗后依次放入：70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-無(wú)水乙醇Ⅰ-無(wú)水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脫水透明，最后在通風(fēng)櫥中風(fēng)干。滴加中性樹(shù)膠，蓋上蓋玻片。平放于通風(fēng)櫥中晾干。

1.3 結(jié)果判讀 由2位對(duì)研究不知情的病理科主治以上醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行判讀。ER、PR細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，每張片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞比例，取5個(gè)視野的平均值作為該片的陽(yáng)性值。陽(yáng)性比例＜1%為陰性，記為（-）；≥1%為陽(yáng)性，記為（+）。

Her-2主要為細(xì)胞膜著色，染色呈棕黃或棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)，同樣取5個(gè)視野進(jìn)行判讀。細(xì)胞膜不染色為陰性（-）；＜10%細(xì)胞膜呈較弱棕黃染色，染色間斷分布（+）；＞10%細(xì)胞膜呈完整的較弱到中等強(qiáng)度棕黃染色，形成環(huán)繞（++）；＞10%細(xì)胞膜全層呈高強(qiáng)度棕黃染色，形成環(huán)繞（+++）；（-）和（+）判讀為陰性，（+++）判讀為陽(yáng)性，（++）進(jìn)一步行FISH檢測(cè)，經(jīng)FISH檢測(cè)提示擴(kuò)增的患者判定為HER-2陽(yáng)性，無(wú)擴(kuò)增患者判定為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，如呈正態(tài)分布則以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，如呈非正態(tài)分布以中位數(shù)和四分位間距進(jìn)行描述，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；免疫組織化學(xué)陽(yáng)性率等以（%）表示，先進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，非等級(jí)資料同組或組間數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況183例患者中73例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。73例中男15例，女58例，年齡29～63歲，平均（42.63±13.28）歲。

2.2 原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶ER、PR、HER-2表達(dá)原發(fā)灶中ER陽(yáng)性表達(dá)率56.16%（41/73），41例中在淋巴結(jié)表達(dá)仍為陽(yáng)性的31例，占比75.61%（31/41），10例轉(zhuǎn)陰，32例在原發(fā)灶ER為陰性患者中8例轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，占比25.00%（8/32），共18例在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶表達(dá)不一致，不一致率24.65%（18/73）。原發(fā)灶和淋巴結(jié)表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.313，P=0.000，表1）。

表1 183例甲狀腺癌患者原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中ER表達(dá)［例（%）］

原發(fā)灶中PR陽(yáng)性表達(dá)率49.31%（36/73），36例陽(yáng)性患者淋巴結(jié)表達(dá)仍為陽(yáng)性的27例，占比75.00%（27/36），9例轉(zhuǎn)陰，37例原發(fā)灶PR為陰性患者中7例轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，占比18.91%（7/37），共16例在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶表達(dá)不一致，不一致率21.91%（16/73）。原發(fā)灶和淋巴結(jié)表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.793，P=0.000，表2）。

表2 183例甲狀腺癌患者原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中PR表達(dá)［例（%）］

原發(fā)灶中HER-2的陽(yáng)性表達(dá)率24.66%（18/73），18例 中15例 在 淋 巴 結(jié) 表 達(dá) 為 陽(yáng) 性，占 比83.33%（15/18），3例轉(zhuǎn)為陰性，55例在原發(fā)灶為陰性患者中8例轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，占比14.55%（8/55），共11例在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶表達(dá)不一致，不一致率15.07%（11/73）。原發(fā)灶和淋巴結(jié)表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.831，P=0.002）。在淋巴結(jié)中HER-2陽(yáng)性率高于原發(fā)灶，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

表3 原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中HER-2表達(dá)［例（%）］

2.3 ER、PR、HER-2表達(dá)不一致與性別、年齡和甲狀腺癌分期的關(guān)系 不同性別的ER、PR、HER-2表達(dá)不一致差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。年齡＜55歲患者ER、HER-2不一致率明顯高于年齡≥55歲者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。III～I(xiàn)V期患者HER-2不一致率高于I～I(xiàn)I期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表4）。

表4 ER、PR、HER-2表達(dá)不一致與性別、年齡和甲狀腺癌分期關(guān)系（例）

3 討論

甲狀腺癌病因目前尚未肯定，但雌激素是重點(diǎn)研究的病因之一［9］。中外均有文獻(xiàn)報(bào)道，甲狀腺癌患者的ER水平明顯升高［10-11］。ER屬于類固醇激素受體家族，除ERα和ERβ兩種主要亞型外，還有G蛋白耦聯(lián)雌激素受體1等亞型。ERα能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，ERα激動(dòng)劑能增強(qiáng)癌細(xì)胞增殖、增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，ERβ能促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡［12］。Zeng等［13］認(rèn)為，ERα與ERβ比例失衡可能導(dǎo)致了甲狀腺癌的發(fā)生。雌激素還能與細(xì)胞膜上的ER亞型GRP30結(jié)合，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及凋亡。已有研究發(fā)現(xiàn)，與合并其他類型的惡性腫瘤相比，甲狀腺癌合并乳腺癌患者比例明顯升高［14］。國(guó)外學(xué)者對(duì)4 243例原發(fā)性甲狀腺癌患者和6 833例原發(fā)性乳腺癌患者追蹤了2～40年，發(fā)現(xiàn)4.3%甲狀腺癌患者再發(fā)乳腺癌，2.6%乳腺癌患者再發(fā)甲狀腺癌，這個(gè)比率遠(yuǎn)高于一般人群［15］。值得注意的是，合并甲狀腺癌和乳腺癌患者組織中ER和PR的表達(dá)明顯高于未合并的單發(fā)乳腺癌或甲狀腺癌患者。

對(duì)于乳腺癌患者，目前臨床已根據(jù)分子分型采用他莫昔芬、芳香化酶抑制劑等內(nèi)分泌治療，能使患者更好地獲益［16］。同時(shí)，也有大量研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的原發(fā)灶和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的生物學(xué)標(biāo)志物ER、PR、Her-2、Ki-67的表達(dá)情況存在差異，推測(cè)這是治療失敗的原因之一［6，17］。本研究觀察了分化型甲狀腺癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶ER等生物學(xué)標(biāo)志物的變化，發(fā)現(xiàn)ER、PR、HER-2的表達(dá)不一致率分別為28.07%、24.56%、15.79%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明甲狀腺癌患者的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶也存在著生物學(xué)異質(zhì)性，值得進(jìn)一步研究。

本研究分析了ER、PR、HER-2表達(dá)不一致與性別、年齡和甲狀腺癌分期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)年齡＜55歲患者ER、HER-2不一致率明顯高于年齡≥55歲者；III～I(xiàn)V期患者HER-2不一致率高于I～I(xiàn)I期。美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）第八版分化型甲狀腺癌分期將診斷年齡切點(diǎn)值調(diào)整為55歲［18］。本研究據(jù)此將患者年齡分為55歲以上和55歲以下組，發(fā)現(xiàn)年齡對(duì)不一致率有明顯影響。同時(shí)，本研究III～I(xiàn)V期患者HER-2不一致率升高。HER-2為跨膜糖蛋白受體，其過(guò)表達(dá)可刺激RAS-RAF-MEK、MAPK、PI3K信號(hào)通路，增加腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵 襲［19］。HER-2過(guò)表達(dá)是乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，與淋巴結(jié)、骨等處的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。對(duì)于HER-2陽(yáng)性的乳腺癌患者可采用靶向藥物曲妥珠單抗等治療［20］。除乳腺癌外，HER-2在直腸癌、胃癌患者中也存在過(guò)表達(dá)。國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道，HER-2在分化型甲狀腺癌中過(guò)表達(dá)，并且HER-2陽(yáng)性與臨床分期相關(guān)［21］。

甲狀腺癌生存率高，整體預(yù)后較好，但也存在著一定比例的復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究ER等生物學(xué)標(biāo)志物的表達(dá)，有助于判斷患者的預(yù)后，同時(shí)也為甲狀腺癌的內(nèi)分泌治療積累數(shù)據(jù)。本研究初步觀察到甲狀腺癌患者原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶表達(dá)存在著不一致性。后續(xù)可繼續(xù)累積病例追蹤觀察，分析表達(dá)不一致性與患者的復(fù)發(fā)等預(yù)后的相關(guān)性。