粵北鷹嘴桃流膠病的病原全型特征分析

李夏　李文英　孫麗麗　徐培智　盧鈺升

摘 要 鷹嘴桃是粵北地區(qū)重要的優(yōu)稀水果，具有重要的經(jīng)濟價值和社會效益，但流膠病的發(fā)生危害嚴重影響地方產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。對粵北主要種植區(qū)鷹嘴桃流膠病病害進行調(diào)查研究，根據(jù)全型形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、ITS及EF1-α序列分析，將鷹嘴桃流膠病的病原鑒定為葡萄座腔菌[Botryosphaeria dothidea（Moug. in Fr.）Ces. & De Not]，證實該病菌有性態(tài)與無性態(tài)的關(guān)聯(lián)，并對鷹嘴桃流膠病的致病因子進行分析與探討，為該病害的防治提供重要的科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞 九仙桃；流膠??；葡萄座腔菌屬；全型特征；序列分析

中圖分類號 S662.1 文獻標識碼 A

Abstract Olecranon peach is one of the rare and excellent fruits with economic significance and social benefits in northern Guangdong. The occurrence of gummosis severely affects the sustainable development of local fruit industry. The aim is to reveal the pathogen causing olecranon peach gummosis in the main planting areas of northern Guangdong. Based on holo morphological characteristics on nature host， artificial culture， ITS as well as EF1-α sequence data， the pathogen was identified as Botryosphaeria dothidea（Moug. in Fr.）Ces. & De Not， the anamorph-teleomorph connection of the fungus was confirmed and the pathogenic factors of olecranon peach gummosis were analyzed and discussed. The results would provide some scientific insights for the prevention and control of gummosis. The related specimens and strains material were stored in the Center of Microbial Resources， Guangdong Academy of Agricultural Sciences（CMR-GAAS）.

Key words Nine fairy peach；Gummosis；Botryoshpaeria；Holomorphological characteristics；Sequence analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.026

鷹嘴桃（Olecranon peach），因果型尾部似鷹嘴而得名，又因產(chǎn)于“中國九仙桃之鄉(xiāng)”翁源縣江尾鎮(zhèn)九仙村而得名九仙桃，屬中國南方硬肉桃品系，因其果大核小、肉質(zhì)爽脆、風味獨特廣受人們的喜愛，是廣東北部地區(qū)傳統(tǒng)的特色水果。1985年被評為廣東省優(yōu)稀水果品種[1]，2007年通過無公害食品認證，享有“仙桃”、“嶺南佳果”之美譽。目前，鷹嘴桃已成為粵北地區(qū)連平、翁源等地的農(nóng)業(yè)主導產(chǎn)業(yè)之一。

近年來，鷹嘴桃種植區(qū)病害頻發(fā)，其中以流膠病危害最為嚴重，主要為害果樹主干、主枝、枝條等，引起果實流膠，甚至直接導致鷹嘴桃落果、絕收，流膠嚴重時導致樹體死亡，該病害的普遍發(fā)生已成為制約粵北地區(qū)鷹嘴桃產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素。但迄今為止，對引起粵北地區(qū)鷹嘴桃產(chǎn)區(qū)流膠病的主要病原菌種類的研究尚未見報道，本研究采用經(jīng)典形態(tài)學特征鑒定方法及分子生物學方法對引起鷹嘴桃流膠病的病原菌進行鑒定，分析其致病因子，為防控流膠病的發(fā)生和危害提供科學信息。

1 材料與方法

1.1 材料

標本及菌株材料：鷹嘴桃流膠病發(fā)病枝條標本，采自翁源縣鷹嘴桃種植區(qū)。

供試菌株：均分離自新鮮標本材料。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

主要試劑：柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒購自上海生工生物公司；引物ITS5和ITS4、引物EF1-728F和EF1-986R由上海立菲公司合成；PCR擴增所用試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病害標本采集及癥狀觀察 2014年4月下旬，對廣東省翁源縣鷹嘴桃主要種植區(qū)發(fā)生的真菌病害進行調(diào)查，并采集具有典型流膠病癥狀的新鮮病害標本帶回實驗室鏡檢及病原分離；新鮮病害標本在體視顯微鏡下觀察外形特征并記錄拍照（SteREO Lumar.V12， ZEISS， Germany）。

1.2.2 病原菌分離及培養(yǎng)性狀觀察 在無菌條件下，從枝干上的病原菌子實體生長部位按單孢分離法[2]，對病原菌進行分離和多次純化后，獲得純培養(yǎng)菌株，分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，26 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察記錄菌落特征及其生長特性。相關(guān)標本和菌株材料保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所微生物資源中心（CMR-GAAS，Center of Microbial Resources，Guangdong Academy of Agricultural Sciences）。

1.2.3 病原菌形態(tài)特征觀察 選取發(fā)病枝條上的子實體生長部位，采用冷凍切片機（HM560，MICROM；Germany）切片，切片厚度為6～8 μm。選取理想切片在光學顯微鏡（Zeiss AxioScope A1microscope； Germany）下進行形態(tài)觀察及顯微拍照，記錄子囊座及分生孢子器的形態(tài)特征；挑取成熟的子囊座及分生孢子器浸入水中并將其在載玻片上壓碎，釋放出內(nèi)容物，光學顯微鏡下觀察并記錄子囊、子囊孢子、分生孢子產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子等的形態(tài)特征。所觀察記錄的形態(tài)結(jié)構(gòu)依照Phillips等[2]的描述，中文學名和術(shù)語參照菌物學概論[3]和Ridgway[4]的比色表進行描述。

1.2.4 病原菌的致病性測定 通過實驗室鷹嘴桃樹枝條接種試驗，對病害枝條標本分離得到的菌株進行致病性測定。

致病性測定采用傷口接種法[5]：將分離純化后的菌株培養(yǎng)物接種于PDA平板上，在26 ℃黑暗培養(yǎng)4 d后，用4 mm滅菌打孔器在PDA平板菌落邊緣切取菌餅。用無菌手術(shù)刀片將鷹嘴桃主枝條刮傷，木質(zhì)部傷口為4 mm左右，然后將菌餅菌絲面朝傷口處貼緊，重新將切口處樹皮貼回菌餅。每個菌株接種2處，同時接種空白的PDA培養(yǎng)基塊各2處作為對照。每天觀察并記錄枝條的發(fā)病情況。待接種后的枝條發(fā)病后，按照柯赫氏法則，重新分離純化，觀察所得分離物與接種菌是否相同，并測序鑒定。

1.2.5 病原菌DNA的提取 采用真菌基因組DNA抽提試劑盒（Sangon Biotech）提取菌株培養(yǎng)物基因組DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，并于4 ℃保存。

1.2.6 ITS及EF1-α片段擴增、測序及序列分析 采用ITS通用引物ITS5（5′-GGAAGTAAA AGTCGTAACAAGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′）擴增ITS1-5.8S-ITS2片段，反應體系為25 μL；反應條件為：95 ℃預變性5 min，94 ℃ 變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s、35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[6]；采用引物EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）和EF1-986R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）擴增EF1-α片段，反應體系為25 μL；反應條件為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s、40個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存[7]；經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。PCR擴增產(chǎn)物送華大基因（北京）進行DNA序列測定。

1.2.7 序列比對分析 將獲得的ITS及EF1-α序列與GenBank中的已有相關(guān)序列進行同源性比較，分析分離菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

共采集新鮮真菌標本21份，其中9份是鷹嘴桃病害枝條標本，CMR0158及CMR0173為主要研究材料，從這2個病害枝條標本的子實體部位分離得到2株菌株，菌株編號分別為Bd0158及Bd0173，具體信息如下。

標本編號：CMR0158及CMR0173。

菌株編號：無性階段菌株Bd0158及有性階段菌株Bd0173。

寄主及危害特征：鷹嘴桃樹干或枝條上生，鷹嘴桃枝上初期皮孔溢出黃色凝膠狀體（圖1-l），后期通常為黑色突起的斑點或者是半埋生在樹皮內(nèi)的黑點為子實體形成階段（圖1-a， b；圖2-a， b）。

采集地點：廣東翁源青云山，經(jīng)緯度N24°14′30"，E114°07′50"，海拔1 246 m。

采集人：李文英、孫麗麗。

采集時間：2014年4月30日。

有性態(tài)特征：子囊座最初埋生，后期突破表皮暴露于外，多聚生于共同的子座上，棕色至黑色，大多為多腔；包被一般為2層，外層通常由深棕色至棕色的角狀厚壁細胞組成，內(nèi)層由淺棕色或無色角狀細胞組成；子囊腔球形至近球形，頂部中央具發(fā)育完全的乳突狀孔口，具緣絲，單腔直徑266.8～294.6 μm；子囊腔內(nèi)產(chǎn)生子實層，擬側(cè)絲無色，具隔，少分枝；子囊雙壁，棍棒狀，具短柄和明顯頂室，囊內(nèi)8個子囊孢子呈疊瓦狀排列，65.2～120.4 μm×16.3～22.2 μm；子囊孢子擬紡錘形至卵形，孢子長寬比約為3.22，單胞無色，壁薄光滑，具顆粒狀內(nèi)容物，20.2～26.4 μm×7.3～9.5 μm（圖1）。有性特征與葡萄座腔菌[Botryosphaeria dothidea （Moug. in Fr.） Ces. & De Not]一致[7]。

無性態(tài)特征：分生孢子果為分生孢子器，通常與子囊座形態(tài)相似，常生于同一子座內(nèi)，單生或多生，棕色至黑色，單腔或多腔；包被一般為2層，外層通常由深棕色至棕色的角狀厚壁細胞組成，內(nèi)層由淺色或無色角狀細胞組成；分生孢子器球形至近球形，分生孢子梗自分生孢子器的內(nèi)壁產(chǎn)生，近圓柱形，無色，壁平滑；分生孢子長紡錘形，無色無隔，薄壁，具顆粒狀內(nèi)容物，兩端略窄鈍圓，22.3～28.1 μm×4.1～5.3 μm（圖2）。無性特征與Slippers等[8]描述的“七葉樹殼梭孢（Fusicoccum aesculi Corda）”特征一致。

2.2 病原菌的培養(yǎng)性狀

在26 ℃恒溫條件下，培養(yǎng)3 d時菌落直徑達60 mm，菌落早期正面白色、棉絮狀、邊緣不規(guī)則，背面白色；培養(yǎng)5 d時菌落直徑即達80 mm，菌落邊緣灰白色且不規(guī)則鋸齒狀，正面中心深灰色、棉絮狀，背面邊緣灰色、中心淺綠色至深綠色（圖1-m， n；圖2-h， i）。培養(yǎng)15 d 后，培養(yǎng)物上出現(xiàn)散生黑色顆粒狀物，為子囊座或分生孢子器的雛形分化物。菌落特征和培養(yǎng)特性與B. dothidea相符[2]。

2.3 病原菌致病性

選用無性階段菌株Bd0158及有性階段菌株Bd0173，以傷口接種法對鷹嘴桃健康枝條進行致病性測定。結(jié)果表明，鷹嘴桃枝條接種處5 d左右開始出現(xiàn)輪紋狀凹陷，并向周圍擴展；8 d后傷口接種處開始出現(xiàn)黃色膠體，凹陷更明顯；有性階段菌株Bd0173接種處比無性階段菌株Bd0158接種處流膠更為嚴重，且凹陷更明顯。在同樣情況下，僅接種無菌PDA塊的對照枝條，10 d后傷口處未出現(xiàn)發(fā)病癥狀，更無流膠現(xiàn)象。取接種后的枝條病健交界處組織分離、純化，所分離獲得的菌株均與原接種菌株的菌落形態(tài)完全一致，經(jīng)過測序及同源性比較，重分離得到的菌株為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea），因此，可推斷B. dothidea是鷹嘴桃流膠病的病原菌。

2.4 病原菌的特征序列分析

用引物ITS5/ITS4從菌株Bd0158、Bd0173的基因組DNA中均擴增出一條約為500 bp的片段，用引物EF1-728F/EF1-986R均擴增得到一條約為300 bp的片段，通過GenBank（NCBI）Megablast搜索同源序列比對分析。結(jié)果表明，用引物ITS5/ITS4擴增得到的序列與B. dothidea模式菌株CMW 8000的AY236949的ITS序列同源性均為100%；用引物EF1-728F/EF1-986R擴增得到的序列與B. dothidea菌株WH-51的HQ660483的EF1-α序列同源性均為100%，與前述有性態(tài)形態(tài)特征的鑒定結(jié)果一致[8]。

2.5 病原菌的分類鑒定分析

根據(jù)病原菌的顯微形態(tài)特征，病原初步鑒定有性階段菌株Bd0173為Botryosphaeria dothidea，無性階段菌株Bd0158為Fusicoccum aesculi，2個菌株的培養(yǎng)特性及ITS 和EF1-α序列同源性比對結(jié)果表明，菌株Bd0158及Bd0173均屬于Botryosphaeria dothidea，進一步證實Fusicoccum aesculi 為Botryosphaeria dothidea 的無性態(tài)。根據(jù)最新的《國際藻類，真菌及植物命名法則》[9]和阿姆斯特丹宣言[10]的要求及提議，采用“一種真菌，一個名稱”的最新分類命名方法，參照Phillips等[2]的觀點和描述，無性階段的Fusicoccum aesculi為Botryosphaeria dothidea的異名，進一步證實其有性階段和無性階段的關(guān)聯(lián)。

根據(jù)病原菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、ITS及EF1-α序列同源性比對結(jié)果， 將引起鷹嘴桃流膠病的病原鑒定為葡萄座腔菌[Botryosphaeria dothidea（Moug. in Fr.）Ces. & De Not]。按照最新分類系統(tǒng)[11]，隸屬于子囊菌門（Ascomycota）、 座囊菌綱（Dothideomycetes）、葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales）、葡萄座腔菌科（Botryosphaericeae ）。

3 討論與結(jié)論

流膠病是桃樹乃至核果類果樹的一種重要病害，在全國乃至全球各地廣泛發(fā)生，中國南方主要發(fā)生在桃樹、李樹、櫻桃、檸檬、柑桔產(chǎn)區(qū)，嚴重影響各地種植區(qū)的產(chǎn)業(yè)發(fā)展[12-13]。流膠病因其典型癥狀均為流膠而得名，但其致病因子復雜多樣，國內(nèi)外一些研究者認為流膠病是由真菌引起的傳染性病害，或為病理性，或為生理性，或二者兼之，同時受地理環(huán)境、氣候因素及年降雨量的影響較大，不同果樹品種其流膠病的致病因子也有所不同[14-16]。因此，查明引起流膠的起始因子及致病病菌對防治流膠病十分關(guān)鍵。

鷹嘴桃是粵北地區(qū)重要的優(yōu)稀水果，具有重要的經(jīng)濟價值和社會效益，近年來主要種植區(qū)病害頻發(fā)，主要病害有流膠病、根癌病、炭疽病、霜霉病等，其中流膠病的嚴重危害成為影響地方產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素。本研究對粵北主要種植區(qū)鷹嘴桃流膠病病害進行初步調(diào)查研究，結(jié)合全型形態(tài)學特征、rDNA-ITS 及EF1序列分析，將鷹嘴桃流膠病的病原鑒定為B. dothidea。

鷹嘴桃流膠病的病原鑒定結(jié)果與前人研究報道的桃樹流膠病的主要病原基本一致。近年來，常有結(jié)合形態(tài)學特征及分子系統(tǒng)學方法對桃樹流膠病的研究報道，張勇等[17]認為山東桃樹流膠病由B. dothidea引起；Wang等[18]報道引起桃流膠病病原主要是葡萄座腔菌類真菌（Botryosphaeriaceous fungi），主要包括3個種，分別為Botryosphaeria dothidea、Diplodia seriata和Lasiodiplodia theobromae，其中以B. dothidea分布最廣，且致病力最強；萬保雄[19]認為廣西地區(qū)油桃、毛桃流膠病由B. dothidea引起，其發(fā)生與樹體營養(yǎng)、夏季高溫、年降雨量等因素相關(guān)?？傊珺. dothidea為引起桃樹流膠病的主要真菌病原種類之一。

B. dothidea是一種常見的植物病原真菌，引起的果樹流膠病是世界性的真菌病害，嚴重危害水果品質(zhì)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展。本研究首次系統(tǒng)報道了B. dothidea在粵北鷹嘴桃上的病菌全型形態(tài)特征和詳細培養(yǎng)特性，又一次證實其有性世代與無性世代的關(guān)聯(lián)，為流膠病的病原侵染和病害循環(huán)機制研究及防治策略制定提供一定的科學信息。針對鷹嘴桃流膠病在高溫高濕的華南地區(qū)致病因子復雜多樣且難以控制等現(xiàn)狀，應對該病原菌的生物學特性、生態(tài)環(huán)境影響因子、抑菌措施篩選等方面開展進一步工作，從而為更好地防控流膠病提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

致謝：在此文完成過程中，農(nóng)業(yè)生物基因研究中心陳中健博士、吳秀菊女士、張衛(wèi)娜女士提供顯微切片攝影技術(shù)幫助，本單位唐明燈博士、李林峰博士及李義純博士提供致病性試驗材料，特此致謝。

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