巴西蕉誘導(dǎo)的香蕉枯萎病菌1號和4號小種致病相關(guān)基因表達(dá)分析

肖義煒　李春強(qiáng)　李文彬　孫建波　曾會才　彭明

摘 要 目前對于香蕉枯萎病菌的致病分子機(jī)制尚不十分清楚。為了闡明枯萎病菌的致病分子機(jī)制，從香蕉枯萎病菌1號（Foc1）和4號小種（Foc4）的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)的表達(dá)量差異較大的蛋白中，選取了9個致病相關(guān)蛋白或潛在的致病基因，利用熒光定量PCR方法進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。結(jié)果顯示：與對照相比，巴西蕉處理的Foc4中，上調(diào)表達(dá)的基因有：酰胺轉(zhuǎn)移酶基因（amidotransferase）、線粒體過氧化物還原酶基因（mitochondrial peroxiredoxin）、幾丁質(zhì)酶基因（chitinnase 1）、羧肽酶基因（carboxypeptidase cpds），差異表達(dá)不明顯的有腺苷激酶基因（adenosine kinase）、NADP-依賴型甘油脫氫酶基因（NADP-dependent glycerol dehydrogenase）、磷酸甘油酸激酶基因（phosphoglycerate kinase）、谷胱甘肽還原酶基因（glutathione reductase）、酰胺酶基因（amidase family protein）。Foc1中，與對照相比，上調(diào)表達(dá)的基因有：腺苷激酶基因、NADP-依賴型甘油脫氫酶基因，下調(diào)表達(dá)的基因有：酰胺轉(zhuǎn)移酶基因、羧肽酶基因。綜合分析顯示，酰胺轉(zhuǎn)移酶、過氧化物酶、幾丁質(zhì)酶、羧肽酶基因可能在Foc4的致病作用中起作用。

關(guān)鍵詞 香蕉枯萎病；尖孢鐮刀菌古巴?；?；基因表達(dá)譜；致病相關(guān)基因

中圖分類號 S668.1 文獻(xiàn)識別碼 A

Abstract The understanding of Fusarium oxysporum f. sp. cubense molecular pathogenic mechanism is still not clear. Nine pathogenesis related protein genes or potential virulence genes were selected from lots of differences expression proteins discovered in comparative proteomic analysis of F. oxysporum f. sp. cubense race 1 and race 4 and to analyze the gene expression profile by real time PCR. The results indicated that amidotransferase，mithchondrial peroxiredoxin，chitinnase 1，carboxypeptidase cpds were up-regulated compared with the controls in Foc4 group induced by Musa AAA Cavendish cv Brazil. Adenosine，NADP-dependent glycerol dehydrogenase，phosphoglycerate kinase，glutathione reductase and amidase family protein expressions were barely noticeable difference in two races. In Foc1，adenosine and NADP-dependent glycerol dehydrogenase were up-regulated in induced group compared with the control group. Amidotransferase and carboxypeptidase cpds were down-regulated. Those suggested that amidotransferase，mithchondrial peroxiredoxin，chitinnase 1 and carboxypeptidase cpds might play an important role in the pathogenesis of Foc4.

Key words Banana wilt； Fusarium oxysporum f. sp. cubense； Gene expression profile； Pathogenicity-related gene

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.009

香蕉（Musa spp.）生長在熱帶、亞熱帶，是全世界最主要的水果之一；也是發(fā)展中國家最重要的四大作物之一[1]。尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，F(xiàn)oc）引起的香蕉枯萎病，也稱巴拿馬病，是目前防治難度大、蔓延快的土傳維管束病害，嚴(yán)重影響世界各香蕉生產(chǎn)國香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。香蕉枯萎病病原菌有4個生理小種，其中1號和4號小種分布最廣，危害性最大[2]。20世紀(jì)40年代至60年代，1號小種引起的香蕉枯萎病的爆發(fā)，導(dǎo)致香蕉在世界范圍毀滅性破壞。后來發(fā)現(xiàn)起源于中國南部的“Cavendish”亞群（如巴西蕉）抗1號小種，于是取代“Gros Michel”成為栽培最廣的品種[3]。然而，該亞群對4號小種是易感的。由于缺乏高抗4號小種且品質(zhì)優(yōu)良的香蕉栽培品種，所以4號小種引起的香蕉枯萎病迅速蔓延到各香蕉生產(chǎn)區(qū)，并在澳洲和許多亞洲國家造成重大損失，已成為香蕉產(chǎn)業(yè)最嚴(yán)重的問題。

香蕉枯萎病是土傳維管束病害，由于病原菌是在維管束中侵染為害，香蕉假莖粗大，化學(xué)藥劑很難在維管束中達(dá)到有效的抑制濃度，因此，至今沒有十分有效的化學(xué)藥劑用于該病的防治。由于具有生產(chǎn)價值的香蕉品種都是三倍體，雜交育種困難，香蕉抗病育種大都依靠體細(xì)胞變異和田間芽變選育，除培育出一些耐病品種，如臺灣的寶島蕉（AAA）、農(nóng)科一號（AAA）等外，至今尚未培育出對Foc4高抗的品種，也未找到十分有效的防治措施，只能在栽培上采取一些綜合防控措施來預(yù)防和降低發(fā)病率，香蕉枯萎病的防控仍然是一個難題。

目前對香蕉枯萎病病原菌生物學(xué)特性比較清楚[4]，檢測體系基本建立[5]，遺傳變異方面也有可喜的進(jìn)展[4，6]。在香蕉抗病方面，香蕉根系中的通氣組織[7]、維管束結(jié)構(gòu)、細(xì)胞大小及排列的緊密、導(dǎo)管的大小與多少等因素與品種的抗病性相關(guān)[8]。還發(fā)現(xiàn)有些香蕉被枯萎病菌侵染后，會被誘導(dǎo)產(chǎn)生凝膠[9]或某些化合物[10]，從而阻止病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)展。但迄今，對病原菌致病和香蕉抗/感病的分子機(jī)制尚不清楚。在香蕉中克隆到的抗病相關(guān)基因還很少，只分離到一些香蕉RGA（Resistance gene analog sequence）片段[11-12]和SSH克隆[13]，主要是一些細(xì)胞壁強(qiáng)化基因，但在抗枯萎病中的作用尚不清楚。在病原菌致病機(jī)制方面，目前報道的有：與胞外酶和過氧化氫酶活性有關(guān)的Foatf1基因，該基因缺失導(dǎo)致毒力降低[14]；pgc2基因，其融合表達(dá)的PGC2蛋白能使香蕉組織變軟和壞死[15]；4號小種中克隆到的foABC1基因[16-17]，對植保素或抗毒素類物質(zhì)具有忍耐性。而在香蕉與枯萎病菌互作方面則尚未見有報道。

為了闡明枯萎病菌的致病分子機(jī)制，本項研究前期試驗(yàn)中已對巴西蕉處理的Foc1和Foc4進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定出99個差異蛋白；在Foc4中鑒定出46個高豐度或特異表達(dá)的蛋白（尚未發(fā)表）。本文從這些差異蛋白中選取了9個基因，對這些基因進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，為進(jìn)一步揭示香蕉枯萎病菌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

由于Foc1與Foc4存在小種致病性差異，F(xiàn)oc1不侵染巴西蕉（Musa AAA Cavendish subgroup cv. Brazil）而Foc4侵染，因此本研究采用巴西蕉分別處理Foc1與Foc4。巴西蕉種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所試驗(yàn)大棚，取吸芽進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得幼苗（袋裝苗），轉(zhuǎn)接到大培養(yǎng)瓶培養(yǎng)50 d后用于試驗(yàn)。香蕉枯萎病菌1號小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1，F(xiàn)oc1）N2菌株和4號小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4，F(xiàn)oc4）B2菌株由黃俊生研究員惠贈，均分離自海南島，并進(jìn)行了基因組測序[18]。

1.2 方法

1.2.1 香蕉處理及采樣 將香蕉枯萎病菌1號小種（Foc1）和4號小種（Foc4）分別接種到三角瓶中，同時放入28 ℃搖床，180 r/min培養(yǎng)48 h。此時菌液濃度約106 cells/mL，用PDB培養(yǎng)液調(diào)節(jié)菌液濃度使Foc1和Foc4濃度一致。而后分別用1 000 mL三角瓶分裝，每瓶500 mL，分裝時搖勻使每瓶濃度一致。取苗齡相同、長勢一致（4～5片葉，約15 cm高）、健康無染病的巴西蕉組培苗，用無菌水將根部清洗干凈；然后將香蕉根部浸入分裝好的菌液中進(jìn)行處理，每瓶放1株香蕉苗，對照不用香蕉處理，3個重復(fù)。處理8 h后將香蕉苗取出，然后放入28 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。采樣：每個樣品收集菌液100 mL，每24 h取樣1次，連續(xù)4 d，共0、24、48、72 h和96 h 5個時間點(diǎn)。

1.2.2 RNA提取 將采集到的同一批次相同處理的三個重復(fù)的樣品混在一起，用CTAB法分別提取Foc1和Foc4的總RNA，具體提取方法見文獻(xiàn)[19]。

1.2.3 RT合成第一條鏈cDNA 按照TIANGEN公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA第一鏈。

1.2.4 熒光定量PCR檢測 以蛋白質(zhì)學(xué)數(shù)據(jù)庫所得序列設(shè)計熒光定量PCR基因引物（表1），產(chǎn)物大小為150 bp左右，設(shè)計好的引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。儀器為AB公司的StepOnePlus Real-Time PCR系統(tǒng)，操作步驟按照Takara公司熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

圖1是9個基因的熒光定量PCR分析結(jié)果。從圖1-A可以看出，香蕉處理后的Foc4中，各時間點(diǎn)酰胺轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量較對照高很多，而在Foc1中該基因的表達(dá)量與對照相比差別不大。而且，香蕉處理組中，各時間點(diǎn)Foc4中酰胺轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量比Foc1中均高出許多，在前期蛋白質(zhì)組學(xué)分析中檢測到的蛋白質(zhì)的量，F(xiàn)oc4也比Foc1高（圖1-A柱狀圖）。

在巴西蕉處理及未處理的Foc4中，腺苷激酶基因表達(dá)水平在整個試驗(yàn)階段一直處于低水平狀態(tài)，且在處理與對照中其表達(dá)量基本相同；在對巴西蕉非致病的Foc1中，試驗(yàn)前2 d處理與對照的腺苷激酶基因表達(dá)量基本一致；72 h后，腺苷激酶基因的表達(dá)水平有所增加，但處理較對照增加幅度更大（圖1-B）。48 h后Foc4中的基因表達(dá)量比Foc1低許多，而在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中檢測到的蛋白質(zhì)的量，F(xiàn)oc4是Foc1的2倍，蛋白質(zhì)與基因表達(dá)之間存在差異，其原因可能是基因轉(zhuǎn)錄的mRNA水平并不能完全代表其相應(yīng)蛋白質(zhì)的豐度，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)水平的表達(dá)不僅取決于基因轉(zhuǎn)錄的速率，也與mRNA的出核、細(xì)胞漿定位、轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性、mRNA翻譯調(diào)節(jié)及蛋白質(zhì)的降解密切相關(guān)。對蛋白質(zhì)合成的調(diào)控不僅局限于轉(zhuǎn)錄過程，在蛋白質(zhì)合成的其他階段也存在調(diào)控機(jī)制[20-21]。研究表明，mRNA和蛋白質(zhì)無論在單個基因還是在整個細(xì)胞系中相關(guān)系數(shù)一般小于0.5[21]，在酵母中某些基因mRNA的豐度和相應(yīng)翻譯的蛋白質(zhì)水平可相差30倍之多，而且在低豐度蛋白質(zhì)中更加明顯[22]。

在香蕉處理的Foc1中，NADP依賴型甘油脫氫酶在24 h表達(dá)量快速升高近20倍，而后又迅速下降到幾乎為0，72 h后又重新開始上升，而對照一直處于低水平。與對照相比，香蕉處理的Foc4中，該基因的表達(dá)水平在各時間點(diǎn)均有所升高（圖1-C）。表明在1號和4號小種中，巴西蕉的誘導(dǎo)使NADP依賴型甘油脫氫酶基因的表達(dá)量增高。在48 h和96 h時間點(diǎn)該基因的表達(dá)總量Foc4與Foc1相當(dāng)，蛋白質(zhì)組學(xué)分析中檢測到的蛋白質(zhì)量，F(xiàn)oc4較Foc1多。

Foc4中，香蕉處理組與對照組的磷酸甘油激酶基因表達(dá)無明顯差異且各時間點(diǎn)的變化不大。Foc1對照組表達(dá)量波動較大，處理組該基因的表達(dá)量基本不變（圖1-D）。該基因表達(dá)量和蛋白質(zhì)組學(xué)中檢測到的蛋白質(zhì)量均為Foc1較Foc4高。

從圖1-E可以看出，在Foc4中，48 h前，線粒體過氧化物還原酶基因處理組和對照組表達(dá)量幾乎相同但極低；72 h后，處理組表達(dá)量升高3～5倍，而對照組卻幾乎為0或表達(dá)量極低。在Foc1中，處理與對照組相比較并未見明顯改變且各時間點(diǎn)的表達(dá)水平變化不大。蛋白質(zhì)組學(xué)中48 h和96 h檢測到的蛋白質(zhì)量Foc1大于Foc4，而基因表達(dá)量48 h時 Foc1大于Foc4，96 h 時Foc4大于Foc1；可能的原因是蛋白質(zhì)翻譯較基因表達(dá)滯后，96 h時表達(dá)基因還沒有完全被翻譯成過氧化物還原酶。

在Foc1和Foc4中，處理與對照的谷胱甘肽還原酶基因和酰胺酶家族蛋白基因表達(dá)量差別不大，且前后幾天的變化也不明顯（圖1-F、H）。24 h后，F(xiàn)oc1與Foc4中的表達(dá)量差異不明顯，雖然蛋白質(zhì)組學(xué)中檢測到的蛋白質(zhì)量差異較大，推測這2個基因均未參與到病原菌的致病過程之中。

與對照相比，48 h后香蕉處理的Foc1和 Foc4中，幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)量都有升高。但最后一天（96 h），F(xiàn)oc1中該基因表達(dá)量回復(fù)到原點(diǎn)，而在Foc4中其表達(dá)量卻繼續(xù)升高至5倍以上，F(xiàn)oc4對照中表達(dá)量接近0（圖1-G）。前期蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，F(xiàn)oc4的幾丁質(zhì)酶蛋白量也較Foc1中高很多。推測幾丁質(zhì)酶在Foc4侵染過程中起作用。

從圖1-I可以看出，24 h時，F(xiàn)oc1中羧肽酶基因在對照組中的表達(dá)量高于處理組，之后處理組與對照組該基因均低水平表達(dá)并基本無差別。而在Foc4中，72 h后羧肽酶基因在處理組中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于對照組。48 h后羧肽酶基因在Foc4中的表達(dá)量較Foc4中高，蛋白質(zhì)組學(xué)分析中檢測到的蛋白量Foc4中很高，而Foc1中幾乎檢測不到。

3 討論與結(jié)論

酰胺轉(zhuǎn)移酶是生物體內(nèi)嘌呤產(chǎn)物合成途徑的關(guān)鍵酶[23]，在對數(shù)生長期的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，在對數(shù)生長末期合成終止[24]。RIG-I（retinoic acid-induced gene I，維甲酸誘導(dǎo)基因I）對先天性免疫至關(guān)重要，但是某些病原菌，如皰疹病毒（herpesvirus），能夠通過酰胺轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫酰氨基作用劫持活化的 RIG-I 避免抗病毒細(xì)胞因子產(chǎn)生[25]。本研究中，酰胺轉(zhuǎn)移酶基因在香蕉處理后期的Foc4中有明顯增長，其原因可能是Foc4受到植物寄主巴西蕉的誘導(dǎo)后該酶合成增加，以抵御寄主免疫產(chǎn)生的抗病因子；而在Foc1中處理與對照的表達(dá)量差別不大，可能是巴西蕉抑制了Foc1中該基因的表達(dá)，而Foc4則克服了這種抑制；這些結(jié)果顯示該酶很可能參與了 Foc4對巴西蕉的致病過程，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

腺苷激酶是一個嘌呤補(bǔ)救途徑中存在的一種酶，催化嘌呤的磷酸化作用，也在甲基化作用中扮演重要角色[26]。雖然有報道稱該酶與黃單胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris）致病性相關(guān)[27]，但本研究中對巴西蕉致病的Foc4中腺苷激酶的表達(dá)量處理與對照之間卻無明顯變化。因此推測腺苷激酶與香蕉枯萎病菌的致病性不相關(guān)。

NADPH主要參與合成代謝，在甘油代謝過程主要參與細(xì)胞的高滲透壓生理調(diào)節(jié)和胞內(nèi)氧化還原平衡調(diào)節(jié)[28]。營養(yǎng)狀況也影響真菌侵染，基因突變后，變成營養(yǎng)缺陷型從而失去致病能力。Sweigard等[29]發(fā)現(xiàn)灰梨孢菌咪唑甘油磷酸脫氫酶基因pth3突變后，使組氨酸無法合成而成為非致病性突變株。本研究中NADP依賴型甘油脫氫酶在香蕉處理后期Foc4和Foc1中表達(dá)量有增加趨勢，表明枯萎病菌在侵染時的營養(yǎng)需求增大。

磷酸甘油酸激酶主要參與糖降解途徑，目前尚未發(fā)現(xiàn)致病相關(guān)性的報道，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也未體現(xiàn)其與致病性有關(guān)。研究表明，過氧化物還原酶在過氧化代謝中起著至關(guān)重要的作用[30]。過氧化物還原酶能清除自由基活性氧（ROS），在細(xì)胞毒性過氧化物的解毒作用中起催化作用，還能夠作為分子伴侶在面臨氧化應(yīng)激時參與細(xì)胞的損傷修復(fù)[31]。本研究中線粒體過氧化物還原酶在處理后期的Foc4中表達(dá)量明顯升高，可能的原因是受到侵染的巴西蕉生成了較多的自由基，以及病原菌體內(nèi)的新陳代謝增加導(dǎo)致游離自由基較多，使病原菌產(chǎn)生相關(guān)清除自由基的應(yīng)激反應(yīng)，降解這些氧自由基，因此，推測該基因可能與Foc4的致病性有相關(guān)。但具體情況有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

幾丁質(zhì)是甲殼動物、昆蟲、線蟲、真菌等物種外殼的主要成分，起營養(yǎng)和保護(hù)等作用[32]。幾丁質(zhì)酶主要用于降解寄主細(xì)胞壁，或者在致病過程中降解病原菌自身的幾丁質(zhì)從而利于侵染，研究表明寡孢根霉菌（Rhizopus oligosporus）的chi3幾丁質(zhì)酶基因在菌絲的生長過程中表達(dá)，有利于菌絲頂端細(xì)胞松弛形成膨壓并使末端伸長[33]。缺失幾丁質(zhì)酶的病毒對寄主的致死時間明顯推遲[34]。本實(shí)驗(yàn)中，處理后期的Foc4中，幾丁質(zhì)酶表達(dá)量快速上升，可能是由于香蕉處理后菌群內(nèi)的幾丁質(zhì)升高導(dǎo)致菌體本身需要幾丁質(zhì)酶的降解，或者因?yàn)橄憬兜恼T導(dǎo)使幾丁質(zhì)酶表達(dá)增加使菌絲頂端細(xì)胞松弛有利于侵染。但具體情況還有待對該基因進(jìn)行敲除、互補(bǔ)和功能驗(yàn)證等進(jìn)一步研究。

谷胱甘肽還原酶雖然是細(xì)胞的重要抗氧化劑，但鮮有致病相關(guān)性的報道，本實(shí)驗(yàn)中也未發(fā)現(xiàn)其與致病性相關(guān)。酰胺酶是一種在生物體中無所不在的酶，這些酶通常涉及多種代謝[35]，主要用于水解冬酰胺，并未發(fā)現(xiàn)在病原菌致病方面報道，本實(shí)驗(yàn)也未發(fā)現(xiàn)其與枯萎病菌的致病性相關(guān)。

羧肽酶是催化水解多肽鏈含羧基末端氨基酸的酶。病原真菌能夠分泌羧肽酶等分泌蛋白，作為潛在的致病因子對某些病原菌的毒力很重要，可為病原真菌專一性提供碳源[36]。研究表明，L，D-羧肽酶對單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）的毒力起作用[37]。此外，在米曲霉（Aspergillus oryzae）和黑曲霉（Aspergillus niger）中也分離到幾個羧肽酶[38]。本研究中，72 h后Foc4中處理組羧肽酶基因的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組，而且在Foc4中蛋白質(zhì)組學(xué)檢測到的羧肽酶蛋白量也很高，而在Foc1中幾乎檢測不到。推測其可能作為致病因子參與了Foc4的致病過程，或者在降解植物抗病反應(yīng)所釋放的小分子肽類中起作用，具體情況有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究在對Foc1 和Foc4的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析的基礎(chǔ)上，選取9個差異蛋白進(jìn)行基因表達(dá)分析。結(jié)果顯示，所討論的9個基因中，酰胺轉(zhuǎn)移酶、過氧化物酶、幾丁質(zhì)酶、羧肽酶基因可能在Foc4的致病作用中起作用。

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