油茶節(jié)律基因LHY的克隆及其在外源激素處理下對(duì)光合作用的影響

何之龍，張 震，許彥明，王 瑞，王湘南，陳永忠

（湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

油茶Camellia oleifera作為我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種之一[1]，以其良好的適應(yīng)性與經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國(guó)南方廣大紅壤丘陵地區(qū)有廣泛種植[2]。按照2019年全國(guó)油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)場(chǎng)會(huì)上國(guó)家林業(yè)和草原局提出的油茶發(fā)展規(guī)劃，我國(guó)油茶面積將從現(xiàn)有的10.2萬(wàn)hm2發(fā)展到13.5萬(wàn)hm2，未來(lái)5年計(jì)劃新造油茶林3萬(wàn)hm2，加上近6萬(wàn)hm2的低產(chǎn)林亟需品種改造，優(yōu)良油茶品種的需求巨大。長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)油茶品種的選育進(jìn)展緩慢，如何突破油茶高效育種技術(shù)的瓶頸，提高油茶良種選育的效率，培育聚合高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗等多目標(biāo)性狀的新品種，是油茶育種工作者關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題[3]。

植物自身具有內(nèi)源性的生物鐘系統(tǒng)，在植物從萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、生殖生長(zhǎng)到授粉等的整個(gè)生命循環(huán)中，生物鐘系統(tǒng)廣泛地調(diào)控了植物自身的生理、代謝和發(fā)育的過(guò)程，使這些生命活動(dòng)能在最佳時(shí)間發(fā)生[4]。其中一些發(fā)育過(guò)程是在日周期的基礎(chǔ)上直接受到生物鐘系統(tǒng)調(diào)控的；其他一些發(fā)育過(guò)程是在年周期的基礎(chǔ)上，通過(guò)生物鐘系統(tǒng)檢測(cè)日照時(shí)長(zhǎng)的變化，從而受到調(diào)控。高等植物的生物鐘系統(tǒng)由輸入途徑、振蕩器、輸出途徑3個(gè)主要部分構(gòu)成。輸入途徑參與環(huán)境信號(hào)的感知和傳輸；振蕩器是生物鐘系統(tǒng)的核心，負(fù)責(zé)產(chǎn)生和維持節(jié)律；輸出途徑將振蕩器產(chǎn)生的節(jié)律同步傳遞到下游的植物代謝和生理過(guò)程[5]。振蕩器作為高等植物生物鐘系統(tǒng)的最為核心的組成元件，由晝夜循環(huán)的轉(zhuǎn)錄抑制回路組成，在這個(gè)回路中的元件通過(guò)正向或者逆向調(diào)控振蕩器中其他元件的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)自身的表達(dá)[6]。節(jié)律基因LHY是MYB家族轉(zhuǎn)錄因子，其編碼的蛋白質(zhì)是高等植物生物鐘系統(tǒng)核心振蕩器中維持日間循環(huán)的一個(gè)重要組成部分[7]。

光合作用是植物積累生物量最主要的途徑，通過(guò)改良植物本身光合作用效率來(lái)提高產(chǎn)量的育種方法被稱(chēng)為高光效育種[8]。目前，油茶主要以經(jīng)濟(jì)性狀等作為主要育種指標(biāo)[9]，雖然關(guān)于油茶光合作用的研究已經(jīng)有一些報(bào)道，但是這些研究主要集中在光合作用日動(dòng)態(tài)模式、不同品種間光合效率差異以及不同環(huán)境脅迫下的光合作用響應(yīng)等方面[10-11]。本研究中從晝夜節(jié)律切入，采用同源克隆技術(shù)[12]獲得油茶節(jié)律基因LHY的cDNA全長(zhǎng)序列，利用不同植物激素對(duì)油茶節(jié)律基因LHY的表達(dá)調(diào)控作用，研究節(jié)律基因的表達(dá)與油茶光合作用強(qiáng)度的相關(guān)性，解析油茶節(jié)律基因表達(dá)調(diào)控光合作用的機(jī)制，旨在為油茶的高光效育種研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以油茶良種‘湘林210’的2年生嫁接苗為試驗(yàn)材料，置于人工氣候箱模擬的中日照環(huán)境下培養(yǎng)。24 h的循環(huán)條件：從6:00開(kāi)始，以10 000 lx光照強(qiáng)度在30 ℃下培養(yǎng)12 h；從18:00開(kāi)始，以無(wú)光照條件在28 ℃下培養(yǎng)12 h。經(jīng)過(guò)為期1周的適應(yīng)性培養(yǎng)后，分別選取5株長(zhǎng)勢(shì)相同的幼苗作為生物學(xué)重復(fù)。分別使用100 μg/L脫落酸（abscisic acid，ABA）和100 mg/L赤霉素（gibberellin，GA）溶液在光照開(kāi)始時(shí)（6:00）對(duì)幼苗進(jìn)行葉面噴施處理，并設(shè)置以蒸餾水噴施為對(duì)照組。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因片段克隆

在24 h的培養(yǎng)周期內(nèi)每隔6 h取油茶苗木幼嫩葉片作為樣本，用蒸餾水洗凈后放入液氮進(jìn)行速凍，提取植物葉片樣本的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，反轉(zhuǎn)錄cDNA直接用于油茶LHY基因序列片段PCR擴(kuò)增反應(yīng)。根據(jù)葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)油茶LHY基因序列片段克隆引物（CoLHY-sense：5′-CTGCCTTGG TCCATCACA-3′；CoLHY-antisense：5′-GGCCCAT TCATTTCCTTG-3′），將早晨（6:00）、中午（12:00）、傍晚（18:00）和午夜（24:00）4個(gè)時(shí)間點(diǎn)葉片樣本的cDNA第1鏈等量混合作為模板，進(jìn)行油茶節(jié)律基因LHY序列片段PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并以DL2000 DNA Marker指示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小，選擇符合預(yù)期長(zhǎng)度的特異性擴(kuò)增條帶進(jìn)行純化與回收。目的片段經(jīng)加A尾處理后連接pMD18-T（TaKaRa）載體，采用凍融法轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板培養(yǎng)基后在37 ℃下暗培養(yǎng)24 h，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)接液體LB培養(yǎng)基后培養(yǎng)2 h，取吸光度值約為0.6的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取并測(cè)序。

1.2.2 基因片段序列分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)進(jìn)行Blast比對(duì)，篩選與目的基因編碼的氨基酸序列相似性較高的其他物種氨基酸序列，使用MEGA5軟件將各物種的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；使用ORF-finder在線(xiàn)分析軟件預(yù)測(cè)目的基因的開(kāi)放讀碼框，在Expasy數(shù)據(jù)庫(kù)（http://au.expasy.org/tools/）中使用ProtParam軟件和ProtScale軟件分別進(jìn)行氨基酸序列特征的預(yù)測(cè)分析，使用SOPMA在線(xiàn)分析軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)等的預(yù)測(cè)。

1.2.3 光合作用指標(biāo)測(cè)定

經(jīng)人工氣候箱模擬的日照光周期適應(yīng)培養(yǎng)1周后，于處理前48 h內(nèi)從6:00起每隔6 h以及處理后0、2、4、6、8和10 h，分別用LI-6400XT型光合儀，在每株幼苗頂端部位選取3片健康的1年生葉片進(jìn)行光合參數(shù)測(cè)定，空氣流量設(shè)為500 μmol/s，光強(qiáng)設(shè)為1 000 μmol/(m2·s)，CO2氣體由小鋼瓶提供，控制摩爾分?jǐn)?shù)為400 μmol/mol。

1.2.4 熒光定量PCR分析

在進(jìn)行光合作用指標(biāo)測(cè)定的同時(shí)，取每株幼苗頂端部位3片成熟的新鮮葉片，經(jīng)液氮速凍后，用CTAB法提取樣品總RNA，cDNA第1鏈的合成和熒光定量PCR所用的試劑均購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，以ETIF3H基因?yàn)闊晒舛縋CR反應(yīng)的內(nèi)參基因，用2-ΔΔCT相對(duì)定量法分析油茶節(jié)律基因LHY在外源激素處理下表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶LHY基因同源序列片段的PCR擴(kuò)增

以早晨（6:00）、中午（12:00）、傍晚（18:00）和午夜（24:00）4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的油茶葉片樣本總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等量混合作為模板，用CoLHY-sense/antisense引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，第1泳道檢測(cè)到1條長(zhǎng)度約2 500 bp（＞2 000 bp）的特異擴(kuò)增條帶，與預(yù)測(cè)目的產(chǎn)物長(zhǎng)度相符。

圖1 油茶節(jié)律基因LHY序列片段PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR product of circadian gene LHY sequence fragment in C.oleifera

將含有目的片段重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒并測(cè)序，結(jié)果顯示目的片段為2 565 bp的核苷酸序列，通過(guò)NCBI BLAST在線(xiàn)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該目的片段核苷酸序列與茶樹(shù)LHY基因同源性達(dá)到98%，覆蓋率達(dá)89%；與中華獼猴桃LHY基因同源性達(dá)到73%，覆蓋率達(dá)89%。將該目的片段使用在線(xiàn)工具ORF Finder進(jìn)行開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該序列包含1個(gè)長(zhǎng)度為2 301 bp的編碼序列（coding sequence，CDS），編碼766個(gè)氨基酸，如圖2所示。

圖2 油茶LHY基因的核苷酸和氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino sequences of LHY gene in C.oleifera

2.2 油茶LHY基因編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

使用ProtParam tool在線(xiàn)分析軟件預(yù)測(cè)油茶LHY基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列特征，其氨基酸組成見(jiàn)表1。預(yù)測(cè)的油茶LHY基因編碼蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為83.88 kDa，分子式為C3617H5694N1062O1187S26，其 中Ser、Ala、Glu、Pro、Thr和Leu的占比較高，分別為10.40%、9.40%、7.60%、7.30%、6.80%和6.70%。油茶LHY基因編碼蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)和理論等電點(diǎn)分別為53.98和5.93，說(shuō)明該蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定的酸性蛋白。

表1 油茶LHY基因編碼蛋白的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of LHY gene encoding protein in C.oleifera

使用ProtScale在線(xiàn)分析軟件對(duì)油茶LHY基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行親水性/疏水性預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見(jiàn)，第446～449個(gè)氨基酸區(qū)域的疏水性最強(qiáng)，得分為2.089～2.100；第600～608個(gè)氨基酸區(qū)域的親水性最強(qiáng)，得分為-3.600～-2.156，推測(cè)油茶LHY基因編碼的蛋白質(zhì)是親水性蛋白質(zhì)。

圖3 油茶LHY基因編碼蛋白的親水性/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Predicted distribution of hydrophilicity/hydrophobicity of LHY gene encoding protein in C.oleifera

使用SOPMA在線(xiàn)分析軟件對(duì)油茶LHY基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見(jiàn)，無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）是油茶LHY基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要成分，占67.62%；其他結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（24.28%）、β-轉(zhuǎn)角（2.09%）、延伸鏈（6.01%）散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

圖4 油茶LHY基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Prediction of the secondary structure of LHY gene encoding protein in C.oleifera

2.3 油茶LHY基因編碼氨基酸序列的比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將預(yù)測(cè)的油茶LHY基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列提交NCBI進(jìn)行在線(xiàn)Blast比對(duì)分析，選擇其中顯示同源比對(duì)相似性較高的19個(gè)物種LHY基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，包括茶樹(shù)C.sinensis（ARM20189.1）、中華獼猴桃Actinidia chinensis（PSS00200.1）、歐洲栓皮櫟Quercus suber（XP_023925259.1）、柑橘Citrus sinensis（XP_006491389.1）、胡楊Populus euphratica（XP_011039461.1）、樹(shù)棉Gossypium arboreum（XP_017637446.1）、核 桃Juglans regia（XP_018834196.1）、煙 草Nicotiana tabacum（XP_016450418.1）、芝麻Sesamum indicum（XP_020553443.1）、可可Theobroma cacao（XP_017979073.1）、葡萄Vitis vinifera（XP_010661511.1）、開(kāi) 心 果Pistacia vera（XP_031251101.1）、蓖 麻Ricinus communis（XP_002515093.1）、橡 膠 樹(shù)Hevea brasiliensis（XP_021676056.1）、川桑Morus notabilis（XP_024028464.1）、木槿Hibiscus syriacus（XP_039036712.1）、木薯Manihot esculenta（XP_021611101.1）、榴梿Durio zibethinus（XP_022757633.1）和棗Ziziphus jujuba（XP_015888949.1）。使用DNAMAN 6.0軟件，將預(yù)測(cè)的油茶LHY基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列與篩選出的19個(gè)LHY基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行兩兩比對(duì)，結(jié)果顯示這些氨基酸序列相似性為53.38%～91.06%。其中，相似性最高的是茶樹(shù)LHY基因編碼蛋白質(zhì)，為91.06%；相似性最低的是煙草LHY基因編碼蛋白質(zhì)，為53.38%。使用MEGA5.1軟件計(jì)算以上共計(jì)20個(gè)物種的LHY基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列的相似性，并采用Neighbour-Joining方法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見(jiàn)，油茶LHY基因與同為山茶屬的茶樹(shù)親緣關(guān)系最近，與蓖麻和煙草親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖5 油茶LHY基因編碼氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of LHY gene encoding amino acid sequence in C.oleifera

2.4 外源植物激素對(duì)油茶光合作用的影響

2.4.1 對(duì)凈光合速率的影響

外源激素處理下油茶葉片凈光合速率的變化如圖6所示。

圖6 外源激素處理下油茶葉片凈光合速率的變化Fig.6 Net photosynthetic rate under exogenous hormones treatment in C.oleifera leaves

由圖6可見(jiàn)，在通過(guò)人工氣候箱模擬的中日照光周期環(huán)境下，對(duì)照組油茶幼苗葉片的凈光合速率在光照開(kāi)始后呈現(xiàn)先升、后降的趨勢(shì)，光照持續(xù)2～4 h時(shí)凈光合速率達(dá)到最大值。使用100 mg/L的GA溶液處理后，油茶幼苗葉片的凈光合速率比對(duì)照組有顯著升高，且仍保持先升、后降的趨勢(shì)，光照持續(xù)6 h時(shí)凈光合速率達(dá)到最大值，為7.38 μmol/(m2·s)，相比對(duì)照組升高了19.09%。使用100 μg/L的ABA溶液處理后，油茶幼苗葉片的凈光合速率比對(duì)照組有顯著降低，從光照持續(xù)2 h時(shí)開(kāi)始也呈現(xiàn)了先升、后降的趨勢(shì)，光照持續(xù)4 h時(shí)凈光合速率達(dá)到最大值，為5.91 μmol/(m2·s)，相比對(duì)照組降低了7.32%。

2.4.2 對(duì)氣孔導(dǎo)度的影響

外源激素處理下油茶葉片氣孔導(dǎo)度的變化如圖7所示。由圖7可見(jiàn)，在通過(guò)人工氣候箱模擬的中日照光周期環(huán)境下，對(duì)照組油茶幼苗葉片的氣孔導(dǎo)度在光照持續(xù)0～6 h內(nèi)無(wú)顯著變化，光照持續(xù)8 h后開(kāi)始下降。使用100 mg/L的GA溶液處理后，油茶幼苗葉片的氣孔導(dǎo)度比對(duì)照組有顯著升高，光照持續(xù)6 h后達(dá)到最大值，為0.079 mmol/(m2·s)，相比對(duì)照組上升了34.91%。使用100 μg/L的ABA溶液處理后，油茶幼苗葉片的氣孔導(dǎo)度較對(duì)照組有所下降，且在光照持續(xù)6 h時(shí)顯著降低，為0.052 mmol/(m2·s)，相比對(duì)照組下降了10.55%。

圖7 外源激素處理下油茶葉片氣孔導(dǎo)度的變化Fig.7 Stomatal conductance under exogenous hormones treatment in C.oleifera leaves

2.4.3 對(duì)胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)的影響

外源激素處理下油茶葉片胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)的變化如圖8所示。由圖8可見(jiàn)，在通過(guò)人工氣候箱模擬的中日照光周期環(huán)境下，對(duì)照組油茶幼苗葉片的胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)在光照開(kāi)始后未表現(xiàn)出明顯的變化趨勢(shì)，在光照持續(xù)2～4 h內(nèi)表現(xiàn)出不同程度的降低，然后恢復(fù)到光照開(kāi)始時(shí)的水平。使用100 mg/L的GA溶液處理后，油茶幼苗葉片的胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)在光照持續(xù)2～6 h內(nèi)比對(duì)照組有顯著升高，其中光照持續(xù)2 h時(shí)升高幅度最大，為231.22 μmol/mol，比對(duì)照組升高了32.64%，然后持續(xù)降低，在光照持續(xù)10 h時(shí)達(dá)到最小值，為184.19 μmol/mol。使用100 μg/L的ABA溶液處理后，油茶幼苗葉片的胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)出先降低、后升高的趨勢(shì)，光照持續(xù)4 h時(shí)達(dá)到最小值，為185.71 μmol/mol，與對(duì)照組無(wú)顯著差異，光照持續(xù)10 h時(shí)達(dá)到最大值，為243.33 μmol/mol，比對(duì)照組上升了12.60%。

圖8 外源激素處理下油茶葉片胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)的變化Fig.8 Intercellular CO2 mole fraction under exogenous hormones treatment in C.oleifera leaves

2.4.4 對(duì)蒸騰速率的影響

外源激素處理下油茶葉片蒸騰速率的變化如圖9所示。

圖9 外源激素處理下油茶葉片蒸騰速率的變化Fig.9 Transpiration rate under exogenous hormones treatment in C.oleifera leaves

由圖9可見(jiàn)，在通過(guò)人工氣候箱模擬的中日照光周期環(huán)境下，對(duì)照組油茶幼苗葉片的蒸騰速率在光照開(kāi)始后呈現(xiàn)先升、后降的趨勢(shì)，光照持續(xù)4～6 h時(shí)蒸騰速率達(dá)到最大值；使用100 mg/L的GA溶液處理后，油茶幼苗葉片的蒸騰速率比對(duì)照組有顯著升高，且仍保持先升、后降的趨勢(shì)，光照持續(xù)6 h時(shí)蒸騰速率達(dá)到最大值，為1.27 mmol/(m2·s)，比對(duì)照組升高了28.75%。使用100 μg/L的ABA溶液處理后，油茶幼苗葉片的蒸騰速率比對(duì)照組有顯著降低，光照持續(xù)2 h后也保持了先升、后降的趨勢(shì)，光照持續(xù)6 h時(shí)蒸騰速率達(dá)到最大值，為0.91 mmol/(m2·s)，比對(duì)照組降低了8.02%。

2.5 外源植物激素對(duì)油茶節(jié)律基因LHY表達(dá)的影響

在通過(guò)人工氣候箱模擬的中日照光周期環(huán)境下，外源激素處理下油茶節(jié)律基因LHY表達(dá)水平的變化如圖10所示。由圖10可見(jiàn)，在不同處理下，油茶節(jié)律基因LHY的表達(dá)水平自光照開(kāi)始呈現(xiàn)出持續(xù)上調(diào)的趨勢(shì)，使用100 mg/L的GA溶液處理后上調(diào)幅度較大，使用100 μg/L的ABA溶液處理后上調(diào)幅度較小。光照持續(xù)10 h時(shí)，各處理組油茶節(jié)律基因LHY的表達(dá)水平均達(dá)到最大值，其中GA處理組比對(duì)照組上調(diào)152.75%，ABA處理組比對(duì)照組下調(diào)53.05%。

圖10 外源激素處理下油茶葉片節(jié)律基因LHY表達(dá)水平的變化Fig.10 Relative expression of LHY gene under exogenous hormones treatment in C.oleifera leaves

3 結(jié)論與討論

MYB家族轉(zhuǎn)錄因子LHY（late elongated hypocotyl）和CCA1（circadian clock associated 1）蛋白能夠激活PRR9、PRR7和PRR5/NI（PSEUDORESPONSE REGULATORs 9, 7, 5/NIGHT INHIBITOR）等基因的表達(dá)；而PRR9、PRR7和PRR5/NI蛋白作為轉(zhuǎn)錄共調(diào)控因子，結(jié)合到LHY和CCA1等基因的啟動(dòng)子上，抑制這些基因的表達(dá)，由此構(gòu)成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)被稱(chēng)為高等植物生物鐘系統(tǒng)核心振蕩器的日間循環(huán)[6]。本研究中采用RT-PCR技術(shù)獲得了油茶LHY基因目的片段共2 565 bp，預(yù)測(cè)編碼區(qū)序列為2 301 bp，編碼766個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量約為83.88 kD。通過(guò)對(duì)油茶LHY基因編碼氨基酸序列的分析，預(yù)測(cè)油茶LHY基因編碼蛋白為具有親水性的不穩(wěn)定酸性蛋白質(zhì)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主。經(jīng)過(guò)對(duì)油茶LHY基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列同源性的比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)果表明該基因編碼蛋白質(zhì)與茶樹(shù)LHY基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列的同源性最高，相似性為91.06%。

油茶的凈光合速率等光合作用指標(biāo)在一天當(dāng)中呈現(xiàn)先升、后降的“單峰”曲線(xiàn)[10]，或受午間光抑制呈現(xiàn)“雙峰”曲線(xiàn)[11]，除光照、溫度等環(huán)境因素對(duì)光合作用具有一定程度的影響外，植物本身的生物鐘系統(tǒng)也是導(dǎo)致光合作用呈現(xiàn)周期性振蕩的重要因子?；谏镧娤到y(tǒng)揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中優(yōu)勢(shì)形成的機(jī)制是一個(gè)全新的思路和嘗試，關(guān)于擬南芥二倍體和異源四倍體雜交種的研究結(jié)果解釋了雜交種的生長(zhǎng)活力增強(qiáng)和生物量增加的機(jī)制：正確的生物鐘節(jié)律增強(qiáng)了適應(yīng)性和新陳代謝[13-14]。二倍體種間雜種和異源多倍體通過(guò)表觀調(diào)控和自主調(diào)節(jié)協(xié)調(diào)了來(lái)自父母本的節(jié)律基因的同步性并增強(qiáng)其表達(dá)，大幅度地調(diào)控了下游靶基因的表達(dá)水平，如光合作用和糖代謝基因的表達(dá)幅度和代謝通量、抗逆相關(guān)基因的表達(dá)通量，從而獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。擬南芥的相關(guān)研究揭示了生物鐘系統(tǒng)核心振蕩器影響到生物鐘的節(jié)奏、幅度、周期和輸入/輸出途徑，至少包括光合作用與糖代謝在內(nèi)的15%的基因及其90%的轉(zhuǎn)錄組受到生物鐘的控制[13]，維持節(jié)律調(diào)控促進(jìn)了CO2固定和植物生長(zhǎng)，反之則降低適應(yīng)性[14]。此外，研究者從氣孔活動(dòng)和光合作用中發(fā)現(xiàn)生物鐘系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞水平生物過(guò)程的調(diào)控[15]，白天擬南芥葉片的氣孔導(dǎo)度高于晚上，在景天酸代謝的植物中則相反[16]。擬南芥中參與光合作用光捕獲過(guò)程的相關(guān)基因表達(dá)水平受到生物鐘系統(tǒng)的調(diào)控，番茄中參與光合作用的葉綠素a/b結(jié)合蛋白（chlorophyll a/b binding protein）和核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶激活酶（rubisco activase）的蛋白表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平也均受到生物鐘系統(tǒng)的調(diào)控[17]。豆類(lèi)和棉花的相關(guān)研究結(jié)果表明，光合色素的組成即使在持續(xù)的光照或黑暗中仍保持節(jié)律性振蕩，說(shuō)明光合色素的組成也處于晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)之下[18]。除了參與光合作用的基因，一些參與光呼吸、糖代謝以及運(yùn)輸?shù)幕蛲瑯邮艿缴镧娤到y(tǒng)的調(diào)控[19]。

植物生物鐘系統(tǒng)核心振蕩器日間元件LHY的編碼基因通常在光照條件下表達(dá)水平較高。因此，本研究中通過(guò)人工施加外源植物激素對(duì)節(jié)律基因表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，分析日間光照環(huán)境下，外源植物激素處理下油茶節(jié)律基因LHY與光合作用間的關(guān)系。結(jié)果表明，施加一定濃度外源GA和ABA的信號(hào)均對(duì)油茶幼苗的光合作用生理指標(biāo)和節(jié)律基因LHY表達(dá)有顯著調(diào)控作用。100 mg/L的GA溶液處理在中日照光周期中能顯著提高凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，并在一定程度上促進(jìn)LHY基因表達(dá)；100 μg/L的ABA溶液處理在中日照光周期中能顯著抑制凈光合速率和蒸騰速率，并在一定程度上抑制LHY基因表達(dá)。

GA和ABA均是重要的植物激素，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中均能參與到許多生命過(guò)程的調(diào)控當(dāng)中。有研究結(jié)果表明，GA和ABA含量均表現(xiàn)出隨著晝夜節(jié)律而波動(dòng)[20-21]。此外，還有報(bào)道表明，受GA和ABA誘導(dǎo)的基因隨著生物鐘基因節(jié)律性波動(dòng)[21-22]。本研究中僅從基因表達(dá)水平分析了油茶節(jié)律基因LHY與光合作用直接的關(guān)系，為了解析油茶生物鐘系統(tǒng)參與調(diào)控光合作用的內(nèi)在機(jī)理，后續(xù)將對(duì)油茶節(jié)律基因LHY參與光合作用途徑調(diào)控的直接作用機(jī)制以及調(diào)控靶基因開(kāi)展深入研究。