基于介孔二氧化硅包載白藜蘆醇納米體系的制備

張文君，李 想，張國鋒，王 晴，呂春艷，劉 楊

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，抗腫瘤天然藥物教育部工程研究中心，黑龍江省預(yù)防與治療老年性疾病藥物研究重點實驗室，哈爾濱 150076；2.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150025)

0 引 言

白藜蘆醇(resveratrol,RES)(3,5,4′三羥基-1,2二苯乙烯)是一種非黃酮類天然多酚化合物，其廣泛存在于葡萄、花生、虎杖和紅酒中[1-2]。RES因其抗氧化、抗炎和抗微生物等特性而具有廣泛的治療潛力[3]。在諸多RES的藥理作用中，最突出的是RES的抗癌作用，其對多種腫瘤細胞如乳腺癌細胞、直腸癌細胞和甲狀腺癌細胞等均產(chǎn)生顯著的體外細胞毒性作用。研究表明，RES通過控制細胞的生長、分裂、凋亡以及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響癌癥的各個階段，從而發(fā)揮抗癌作用[4-8]。但由于RES在生物藥劑學(xué)分類中屬BSC Ⅱ類藥物，在水中溶解度較低，進而導(dǎo)致其直接口服生物利用度較低，且RES受紫外線照射易分解，這些條件都限制了RES的進一步開發(fā)與利用[9-10]，故目前對RES的應(yīng)用研究多集中于提高其光穩(wěn)定，水溶性等方面。有研究報道采用超聲-乳化擴散法制備的RES-SLN與原料藥相比，通過測定RES的含量變化證明了在25 ℃的條件下放置10 d的RES-SLN光熱穩(wěn)定性良好，在體外模擬胃液中36 h之內(nèi)呈緩釋釋放，累計釋放度達80%以上[11]。

納米傳遞系統(tǒng)(nano delivery system，NDS)與傳統(tǒng)制劑相比,能夠更有效地提高難溶性天然化合物水中溶解度以及其生物利用度[12]，通過將藥物充分地吸附或包裹在載體材料中，使藥物避免直接與光源、熱源等接觸，從而提高被包載藥物的穩(wěn)定性，不僅如此，藥物載體的多樣化，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物緩控釋、速釋、靶向等多功能需求，被包載后的藥物能夠更好地實現(xiàn)預(yù)防、診斷及治療疾病的目的[13-14]。根據(jù)不同的組成和結(jié)構(gòu)分類，近些年來納米載體被廣為開發(fā)，包括碳納米管、碳點、聚合物膠束、脂質(zhì)體、氧化鐵納米粒子、納米凝膠和樹狀大分子等[15-18]。介孔二氧化硅 (mesoporous silica,MS)是研究最為廣泛的無機納米載體之一，由于其不同的原材料和合成方法，可以制備出不同類型的MS。因其具有高比表面積、大孔徑、易于功能化、生物相容性好、易于修飾、化學(xué)和熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點，經(jīng)常作為納米制劑的載體材料被應(yīng)用于藥物傳遞系統(tǒng)[19-21]。近年來，已有部分學(xué)者報道了將MS作為載體分別制備膠體納米粒[22]、W/O/W型復(fù)合納米乳用以負載RES的相關(guān)實驗[23]，或通過將MS煅燒[24]和修飾[25]制備出不同類型的MS負載RES的相關(guān)研究，結(jié)果表明都能夠不同程度地改善RES的水溶性、穩(wěn)定性及釋放速率，但這些研究多為緩釋制劑，由于載體被修飾以后空間和結(jié)構(gòu)的改變致使其載藥量相對較低，且緩釋制劑不適宜負載半衰期較長、副作用大、治療指數(shù)較窄的模型藥物[26]，這限制了其在某些有特定臨床治療需求方面的應(yīng)用。本論文研究的MS負載RES納米體系具有速釋性能，能彌補如RES等難溶性藥物在體內(nèi)因為溶解度低而生物利用度差的缺點，其載藥量、穩(wěn)定性均有所提升，且通過調(diào)整藥載比和給藥次數(shù)可實現(xiàn)藥物的合理應(yīng)用，這使得速釋制劑具有更好的應(yīng)用前景。

本文采用浸漬離心法，MS作為載體負載RES構(gòu)建納米體系(RES-MS-NDS)，通過掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)、X射線衍射(XRD)、N2吸附-脫附、FT-IR光譜、差熱-熱重分析儀(TG-DTA)對負載RES前后的MS進行表征分析，證明MS負載RES納米體系載藥量可高達39.44%±1.21%，且能有效提高RES的熱和光照穩(wěn)定性，體外不同pH值緩沖液釋放實驗結(jié)果顯示，2 h累計釋放即可達到80%以上，證明RES-MS-NDS具有良好的速釋性能，為其在藥物傳遞系統(tǒng)及速釋制劑研發(fā)等領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

79-2型雙向磁力攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；TGL-16G臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-7504型紫外可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；JSM-7500F 掃描電子顯微鏡，JEOL公司；JEM-2100F 透射電子顯微鏡，日本電子公司；FTIR-650 型傅里葉變換紅外光譜儀，天津港東科技發(fā)展股份有限公司；WS70-1型紅外線快速干燥箱，上海市吳淞五金廠；DTG-60 型差熱-熱重分析儀，日本島津 SHIMADZU公司；Bruker D8 X-射線衍射儀，德國布魯克公司；Microfor TriStar Ⅱ Plus2.02比表面積和孔隙度分析儀，美國麥克公司。

1.3 方 法

1.3.1 RES-MS-NDS的制備

采用浸漬離心法[27]，精密稱定RES原料藥，以無水乙醇為藥物溶劑，配制成50 mg/mL的RES乙醇溶液，精密稱取50 mg的MS加入至5 mL上述RES乙醇溶液中，設(shè)置載藥溫度為25 ℃，中速攪拌24 h后，將樣品放入離心機在5 000 r/min的條件下離心5 min，分離離心后的沉淀，將其減壓干燥，最終得到樣品粉末。

1.3.2 RES-MS-NDS負載率的測定

RES標準曲線的建立：精密稱定RES對照品，制備得濃度為108 μg/mL的儲備液，從中分別吸取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL于10 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇稀釋并定容至刻度，配制成1.08 μg/mL、2.16 μg/mL、4.32 μg/mL、5.40 μg/mL、7.56 μg/mL、9.72 μg/mL一系列濃度的對照液，以乙醇為參比在306 nm波長下測定吸光度A，以濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，建立標準曲線。試驗結(jié)果表明RES在1.08～9.72 μg/mL范圍線性關(guān)系良好，回歸方程為A=0.093 4C+0.004 6(R2=0.999 9)。

負載率的計算：精密稱取RES-MS-NDS粉末適量，加一定量無水乙醇，超聲30 min，使RES完全溶解，冷卻至室溫，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液用無水乙醇稀釋至適宜濃度，在306 nm波長處，紫外分光光度計測定其吸光度，代入標準曲線方程求算RES濃度，并計負載率。負載率R計算公式(1)如下：

(1)

式中:W為RES-MS-NDS中RES的質(zhì)量，W總為RES-MS-NDS的總質(zhì)量(即藥物與載體的總質(zhì)量)。

1.3.3 RES-MS-NDS性能表征

(1)RES-MS-NDS的SEM分析

用掃描電子顯微鏡分別觀察MS和RES-MS-NDS的形貌特征及粒徑大小。取適量干燥樣品，在其表面噴金，將噴金后的樣品置于掃描電子顯微鏡的觀察室進行拍攝。

(2)RES-MS-NDS的TEM分析

為了觀察到MS和RES-MS-NDS的微觀形貌及孔道形態(tài)，進行了透射電子顯微鏡分析。加速電壓為220 V，把樣品粉末通過超聲波振蕩分散在乙醇中，再將其滴在銅網(wǎng)上，待干燥成膜后，對電鏡照片進行觀察分析。

(3)RES-MS-NDS的XRD分析

采用X射線衍射儀對RES負載前后的MS進行X射線粉末衍射分析。實驗采用Cu靶，以Cu Kα輻射，設(shè)置2θ角范圍為5°～90°，掃描時間0.02(°)/s，對數(shù)據(jù)進行作圖分析，通過衍射峰判斷晶體結(jié)構(gòu)。

(4)RES-MS-NDS的比表面積及孔徑分析

稱取樣品適量，采用比表面積和孔隙度分析儀對載RES前后的MS在測試溫度為77 K條件下進行N2吸附-脫附實驗，繪制吸附脫附等溫曲線，并通過BJH (Barrett-Joyner-Halenda)法計算孔徑和孔容，BET (Brunauer-Emmett-Teller)計算比表面積[28]。通過對比載RES前后等溫線、孔徑分布、孔容大小以及比表面積的變化更加直觀地分析RES進入載體孔道內(nèi)的情況。

(5)RES-MS-NDS的FT-IR光譜分析

傅里葉變換紅外光譜通過跟蹤不同的吸收或透射峰，從而識別特定的化學(xué)鍵或官能團。采用傅里葉變換紅外光譜儀對RES和載體之間的相互作用進行分析。在配置的紅外燈干燥箱內(nèi)取約200 mg干燥的溴化鉀用瑪瑙乳缽將其研磨成粉末，再加入干燥的樣品大約2 mg進行研磨，保證溴化鉀和樣品粉末混合均勻，然后將混合后的樣品裝入壓片模具中將其制成一個透明的薄片，而后插入樣品池進行分析。測試條件為分辨率2 cm-1，掃描次數(shù)為16次，波長范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.4 RES-MS-NDS的穩(wěn)定性分析

(1)RES-MS-NDS的熱穩(wěn)定性分析

采用差熱-熱重分析儀對RES及 RES-MS-NDS的熱穩(wěn)定性、脫水情況、吸附情況等進行分析，使用氣氛為N2，溫度范圍為室溫～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min，流量為30 mL/min。

(2)RES-MS-NDS的光照穩(wěn)定性分析

取相同批次RES和RES-MS-NDS 各三份，在見光條件下，室溫保存0 d、1 d、3 d、5 d、7 d分別取樣，觀察外觀狀態(tài)，測定RES-MS-NDS的負載率及RES的含量。

1.4 RES-MS-NDS在體外不同pH值緩沖液釋放研究

1.4.1 RES在體外不同pH值緩沖液標準曲線的建立

(1)pH=1.2 PBS：精密稱定RES對照品至100 mL棕色容量瓶中，加入10 mL乙醇超聲處理，溶解，用pH=1.2磷酸鹽緩沖液定容，制備成濃度為101 μg/mL的儲備液。分別從中吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL于10 mL棕色容量瓶中，用pH=1.2磷酸鹽緩沖液稀釋并定容至刻度，配制成1.01 μg/mL、2.02 μg/mL、3.03 μg/mL、4.04 μg/mL、5.05 μg/mL、6.06 μg/mL一系列濃度的對照液，在306 nm波長條件下測定吸光度A，以濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，建立標準曲線。

(2)pH=6.8 PBS：精密稱定 RES對照品至100 mL棕色容量瓶中，加入10 mL乙醇超聲處理，溶解，用pH=6.8磷酸鹽緩沖液定容，制備濃度為100 μg/mL的儲備液。分別從中吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL于10 mL棕色容量瓶中，用pH=6.8磷酸鹽緩沖液稀釋并定容至刻度，配制成1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL、6.0 μg/mL、8.0 μg/mL一系列濃度的對照液，在306 nm波長條件下測定吸光度A，以濃度C記為橫坐標，吸光度A記為縱坐標，建立標準曲線。

1.4.2 RES-MS-NDS在體外不同pH值緩沖液中釋放的測定

分別取一定量的RES和RES-MS-NDS兩組樣品，每組平分三份，每份約相當(dāng)于RES 40 mg，精密稱定。分別以900 mL、pH=1.2和pH=6.8的 PBS緩沖液作為溶出介質(zhì)，設(shè)定溫度為37 ℃± 0.5 ℃，模擬胃液和腸液環(huán)境，調(diào)整轉(zhuǎn)速為50 r/min。pH=1.2 PBS溶液于 5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min 取待測樣品5 mL、pH=6.8 PBS溶液于5 min、15 min、30 min、45 min、60 min、120 min 取待測樣品5 mL，同時迅速補加同等溫度下體積溶出介質(zhì)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，用紫外分光光度法測定RES含量，并計算出累積釋放度。

2 結(jié)果與討論

2.1 RES-MS-NDS的性能表征結(jié)果

2.1.1 RES-MS-NDS的SEM和TEM分析

MS和RES-MS-NDS的掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡的照片如圖1所示。從圖中可以看出MS呈交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，形似疏松海綿，孔隙發(fā)達，孔道無規(guī)則。載RES前后其形貌和結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化，說明MS結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，RES的負載未破壞其形貌和骨架結(jié)構(gòu)。

圖1 MS和RES-MS-NDS的SEM和TEM照片F(xiàn)ig.1 SEM and TEM images of MS and RES-MS-NDS

2.1.2 RES-MS-NDS的XRD分析

MS、RES和RES-MS-NDS的XRD結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，MS的XRD圖譜為彌散的衍射峰，在2θ=15°～30°之間有一個較寬且鈍其形似饅頭樣的衍射峰，最強衍射峰約為2θ=23°，并且該峰的強度還比較小，為非晶材料的特征衍射峰，表明MS屬于典型的非定形結(jié)構(gòu)[29]。RES的XRD圖譜可以觀察到明顯的特征衍射峰，說明RES以晶體的形式存在，為晶體粉末。當(dāng)經(jīng)過MS裝載后，可以發(fā)現(xiàn)其與MS的XRD圖譜基本一致，曲線為彌散的衍射峰，均在2θ=15°～30°之間有個形似饅頭狀的衍射峰，說明RES的裝載沒有影響MS的骨架結(jié)構(gòu)，RES-MS-NDS的XRD圖譜還存在少量RES的晶體衍射峰，分析原因可能是由于少量RES以物理吸附的形式吸附在MS表面。

圖2 RES及包載前后MS的XRD圖譜Fig.2 XRD patterns of resveratrol and mesoporous silica before and after loading

2.1.3 RES-MS-NDS的比表面積及孔徑分析結(jié)果

MS和RES-MS-NDS的N2吸附-脫附等溫曲線如圖3所示。從圖3可以看出，裝載前后的MS在相對壓力較小的情況下，進行吸附量上升較為緩慢的單分子層吸附，單分子層的吸附量達到飽和后，隨著相對壓力的增加，吸附量進行多層吸附，且由于毛細管冷凝的原因，壓力增加時吸附量上升很陡，此類吸附等溫線為Ⅳ型等溫曲線，屬于典型的介孔吸附等溫曲線。此外，由于發(fā)生毛細管凝聚[30]，導(dǎo)致滯后現(xiàn)象的產(chǎn)生，即脫附等溫線與吸附等溫線不重合，脫附等溫線滯后于吸附等溫線，當(dāng)相對壓力(P/P0)降至0.4以下時，兩條曲線再次重合，形成滯后環(huán)[31]。由圖3可知，MS的滯后環(huán)均介于H1和H2型之間，孔徑分布廣且孔的形狀不明確。包載后的滯后環(huán)與載體MS的滯后環(huán)相比變化不明顯，但在相對壓力下其對氮氣的吸附量明顯減小，這是由于比表面積減小，說明RES已經(jīng)成功負載到MS中。

圖3 負載RES前后的MS的N2吸附-脫附等溫線圖Fig.3 N2 adsorption-desorption isotherm of mesoporous silica before and after RES loading

通過BET法和BJH法對包載前后MS的平均比表面積、孔容和孔徑進行計算分析，結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出，負載RES后的MS比表面積和孔容均呈現(xiàn)明顯下降趨勢，載RES后MS的比表面積降低為原來的41.33%，孔容降低為原來的54.48%，藥物可以高效地負載于載體材料的介孔孔道內(nèi)，由此，載藥后載藥體系的比表面積和孔容會有所降低，而孔徑變大，也是因為RES進入MS的孔道中，對孔道擠壓填充所導(dǎo)致的。以上表明RES已經(jīng)成功負載到MS上。

表1 載RES前后MS的N2吸附-脫附分析Table 1 N2 adsorption-desorption analysis of mesoporous silica before and after RES loading

2.1.4 RES-MS-NDS的FT-IR光譜結(jié)果

MS、RES和RES-MS-NDS的紅外光譜如圖4所示。從圖中可以看出，RES為非黃酮類多酚化合物，其特征吸收峰為3 240 cm-1處的酚羥基吸收峰[32]，1 590 cm-1、1 510 cm-1處的苯環(huán)吸收峰，964 cm-1處的反式碳碳雙鍵吸收峰。從譜線(c)可以看出，與MS的特征峰相比，譜線(c)不僅存在MS骨架結(jié)構(gòu)的特征吸收峰[33](458 cm-1、800 cm-1、1 090 cm-1)，還有微弱的RES的特征吸收峰(1 510 cm-1、1 320 cm-1)，未出現(xiàn)明顯的新的特征峰，說明RES以物理吸附的形式進入MS孔道中，且載RES后的MS骨架依舊完整，證明RES成功負載到MS中。

圖4 RES與包載前后MS的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of RES and mesoporous silica before and after loading

2.2 RES-MS-NDS穩(wěn)定性研究

2.2.1 RES-MS-NDS熱穩(wěn)定性

MS、RES和RES-MS-NDS的差熱-熱重曲線如圖5所示。由圖5可以看出，MS的失重率為15%左右，在溫度為100 ℃時，有6%～7%失重，對應(yīng)MS中的水分子，其余失重7%～8%，對應(yīng)MS中的一些殘留表面活性劑。RES在245 ℃左右時開始分解，600 ℃左右時幾乎完全失重。RES-MS-NDS在100 ℃時也有5%左右的水分子的失重，在240～600 ℃的失重率為23%左右，對應(yīng)系統(tǒng)中的藥物，進一步證明RES原料藥已成功負載于MS中，且與RES原料藥相比，其失重率明顯降低，說明RES-MS-NDS有效提高了RES的熱穩(wěn)定性。

圖5 RES與包載前后MS的熱重曲線Fig.5 Thermogravimetric curves of RES and mesoporous silica before and after loading

2.2.2 RES-MS-NDS 光照穩(wěn)定性

取相同批次RES和RES-MS-NDS 各三份，在見光條件下，室溫保存0 d、1 d、3 d、5 d、7 d，觀察外觀狀態(tài)并測定含量，結(jié)果如表2所示。在光照條件下，相比于RES原料，RES-MS-NDS的光穩(wěn)定性在5 d之內(nèi)有所改善，但長期仍需避光保存。

表2 見光條件下RES-MS-NDS穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=3)Table 2 Stability test results of RES-MS-NDS under light conditions (n=3)

2.3 RES-MS-NDS在體外不同pH值緩沖液中釋放結(jié)果

RES在pH=1.2 PBS溶液中標準曲線的結(jié)果為在1.01～6.06 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為A=0.124 9C-0.001 1(R2=0.999 8)；RES在pH=6.8 PBS溶液中的標準曲線的結(jié)果為在1.0～8.0 μg/mL范圍線性關(guān)系良好，回歸方程為A=0.102 4C+0.010 9(R2=0.999 9)。

參照溶出度的測定方法(《中華人民共和國藥典》2020年版四部附錄XC第二法)[34]測定RES和RES-MS-NDS的不同pH值緩沖液釋放，計算累計釋放百分率，繪制累積釋放曲線。RES和 RES-MSN-NDS在不同pH值下的累計釋放曲線如圖6所示。

從圖6(a)結(jié)果看出，RES在pH=1.2 PBS溶液中釋放緩慢，90 min時的累積釋放率約為55%，但經(jīng)過MS裝載后的RES溶解度顯著提高，釋放速率也得到了提升，同時釋放曲線平緩，未發(fā)生突釋現(xiàn)象，2 h累積釋放率可達到80%以上。從圖6(b)結(jié)果看出，RES在pH=6.8 PBS溶液中釋放緩慢，2 h時的累積釋放率約為76%，但經(jīng)過MS裝載后的RES累積釋放率在相同時間內(nèi)可達到90%以上。RES和RES-MS-NDS在酸性較強的溶液中均釋放較慢，因為RES的結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，藥物呈弱酸性，所以在pH=1.2 PBS溶液中釋放得更緩慢[35]。RES-MS-NDS在pH=6.8 PBS溶液中釋放較快，更利于RES在體內(nèi)腸道的吸收。綜上所述，RES-MS-NDS有利于提高RES在不同pH值緩沖液中的釋放速率，利于RES口服產(chǎn)品開發(fā)。

圖6 RES及 RES-MS-NDS不同pH值PBS中的釋放曲線Fig.6 Curves of release RES and RES-MS-NDS in PBS with different pH values

3 結(jié) 論

本實驗利用浸漬離心法成功構(gòu)建了一種介孔二氧化硅包載白藜蘆醇的納米體系，通過對RES負載到MS前后進行表征測試，觀察到MS粒徑大小不均一，呈不規(guī)則塊狀，骨架呈現(xiàn)出交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔隙發(fā)達且無序，RES可高效率地負載到MS中，且以無定形態(tài)存在MS的孔道內(nèi)。RES-MS-NDS與RES相比，因孔道內(nèi)的RES受到MS的保護，從而提高了RES的熱穩(wěn)定性。光照穩(wěn)定性實驗表明，相比于RES原料，RES-MS-NDS能夠在7 d內(nèi)有效提高其穩(wěn)定性。體外釋放實驗表明，與RES原料相比，RES-MS-NDS釋放速率均有不同程度提高，其原因為:MS具有大比表面積，可使RES與介質(zhì)的接觸面積增加；發(fā)達無序的孔隙結(jié)構(gòu)可以延伸至多個方向，更利于RES釋放；且負載在MS的RES呈無定形態(tài)，無定形態(tài)的RES處于高自由能且無序狀態(tài)，以上均有助于提高RES的溶解度和釋放速率。

由于MS孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)達、比表面積大、粒徑小，在提高RES穩(wěn)定性的同時，增加RES在不同pH值緩沖液中的釋放速度，還有望通過相同方法手段來提高RES的生物利用度，為RES在食品、藥品、保健品等領(lǐng)域中的開發(fā)提供了又一種方法。