快速濾過型凈化法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量

高曉敏，王琚鋼，馬智玲，嚴(yán)程明，陳吳海

1(銅仁學(xué)院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁，554300)2(貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(銅仁學(xué)院), 貴州 銅仁，554300)3(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 南亞熱帶作物研究所，廣東 湛江，524091)4(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 湛江試驗(yàn)站，廣東 湛江，524013)5(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 湛江，524000)

孔雀石綠(malachite green，MG)和結(jié)晶紫(crystal violet，CV)均屬于三苯甲烷類染料，最先應(yīng)用在紡織工業(yè)上[1]，但同時(shí)因具有廣譜抗菌、便宜及藥效顯著等特點(diǎn)，曾被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品的養(yǎng)殖和運(yùn)輸過程中，預(yù)防和治療水產(chǎn)品細(xì)菌性感染疾病[2]。水產(chǎn)品的組織中能夠富集此類藥物，且當(dāng)藥物進(jìn)入生物體內(nèi)會(huì)通過生物轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的隱性孔雀石綠 (leucomalachite green，LMG)和隱性結(jié)晶紫(leucocrystal violet，LCV)[3]，其在水產(chǎn)品體內(nèi)的代謝速率較為緩慢，殘留時(shí)間較長(zhǎng)，難以消除，研究表明，長(zhǎng)期食用此類水產(chǎn)品，很容易引起人體部分臟器和組織中毒，產(chǎn)生“三致”等副作用，嚴(yán)重威脅人體健康[4]。

為此，美國(guó)、歐盟、日本等多國(guó)已禁止MG、CV在水產(chǎn)品的養(yǎng)殖及運(yùn)輸過程中使用[5]，我國(guó)也將其列為禁用藥物，要求在動(dòng)物性食品中不得檢出[6]。但因治療效果顯著，價(jià)格低，使得其在水產(chǎn)品養(yǎng)殖、運(yùn)輸?shù)韧緩街袑医恢埂Ｄ壳八a(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫的分析方法主要包括：高效液相色譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、酶聯(lián)免疫法[9]、毛細(xì)管電泳法[10]、電化學(xué)法[11]等，其中液相色譜法與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的應(yīng)用最為普遍。目前檢測(cè)該藥物的國(guó)標(biāo)方法有GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》[12]和GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》[13]。液相色譜法一般將MG用硼氫化鉀還原為L(zhǎng)MG，利用其具有熒光性而使用熒光檢測(cè)器進(jìn)行分析[14]；或?qū)MG通過二氧化鉛進(jìn)行柱后衍生氧化為MG，使用紫外或二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)[15]。與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相比，高效液相色譜法的檢出限相對(duì)較高，當(dāng)目標(biāo)物在樣品中的含量較低時(shí)，僅僅依靠保留時(shí)間進(jìn)行定性的局限性很大，而串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度和專屬性較高、簡(jiǎn)便快速、干擾少、可避免假陽性等優(yōu)點(diǎn)，成為眾多研究者首選的測(cè)定方法[16]。

目前，針對(duì)水產(chǎn)品中藥物殘留檢測(cè)的樣品前處理方法主要有固相萃取法[17]、還原法[13]、柱后衍生法[15]、液液萃取法[18]、AlphaLISA檢測(cè)方法[19]、QuEChERS法[20]等，快速濾過型凈化柱(multi-plug filtration cleanup，m-PFC)在傳統(tǒng) QuEChERS 方法之上進(jìn)行優(yōu)化[21]，簡(jiǎn)化前處理操作，利用新復(fù)合型納米材料，更大比表面積，分散性好等優(yōu)點(diǎn)，提高去除基質(zhì)中色素、有機(jī)酸、部分糖類、脂類、甾醇類等干擾物，完成基質(zhì)的凈化。與傳統(tǒng)方法相比，該方法不需要稱量N-丙基乙二胺、C18和無水硫酸鎂等吸附劑，無需活化淋洗洗脫程序，可實(shí)現(xiàn)一步凈化，從而大大縮短了凈化時(shí)間，可大幅度提高前處理的總體速率。目前該方法已成功應(yīng)用于人參[22]、生姜[23]、果蔬[24]、茶葉[25]等農(nóng)藥的多殘留檢測(cè)中，但尚未見用于水產(chǎn)品中藥物殘留的分析。本文采用m-PFC結(jié)合UPLC-MS/MS 檢測(cè)技術(shù)，建立了水產(chǎn)品中MG及其代謝物MG、CV及其代謝物L(fēng)CV同時(shí)檢測(cè)的方法，旨在為簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)水產(chǎn)品中的藥物多殘留和藥物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPLC-TQS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)，美國(guó)Waters公司；ME204E 分析天平，瑞士梅特勒-多利多儀器有限公司；渦輪振蕩器，德國(guó)IKA 公司；Milli-QA10超純水儀，美國(guó)Millipore公司；IKA T25高速組織勻漿機(jī)，飛利浦公司；高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；超聲波清洗器，瑞士BUCHI公司；移液器，Eppendorf 中國(guó)有限公司。

MG、LMG、CV、LCV、內(nèi)標(biāo)氘代孔雀石綠(D5-MG)、內(nèi)標(biāo)氘代隱性孔雀石綠(D6-LMG)(6種標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于98%)，德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇為色譜級(jí)，德國(guó)Merck公司；乙酸銨、甲酸為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水硫酸鎂、氯化鈉為分析純，中國(guó)Macklin公司；m-PFC專用凈化柱和陶瓷均質(zhì)子，北京綠綿科技有限公司；0.22微孔濾膜，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

單標(biāo)儲(chǔ)備液：分別精密稱取MG、LMG、CV、LCV、D5-MG和D6-LMG標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg于25 mL的棕色容量瓶中，用乙腈溶解定容配制成400 μg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，然后再用乙腈稀釋配成10 μg/mL的單標(biāo)中間液，于-20 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別精密吸取MG、LMG、CV、LCV單標(biāo)中間液1.00 mL于10 mL的棕色容量瓶中，用乙腈定容后配成1.00 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于-20 ℃避光保存。

混合內(nèi)標(biāo)中間液：分別精密吸取氘代孔雀石綠和內(nèi)標(biāo)氘代隱性孔雀石綠單標(biāo)中間液1.00 mL于10 mL的棕色容量瓶中，用乙腈定容后配成1.00 μg/mL混合內(nèi)標(biāo)中間溶液，于-20 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要，隨用隨配制，吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈-5 mmol/L乙酸銨混合溶液(體積比1∶1)稀釋配制0.100、0.200、1.00、4.00和6.00 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度為1 ng/mL，于-20 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

樣品制備：用均質(zhì)器將500 g可食的鮮魚肉均質(zhì)后混勻，裝入干凈的容器中，用保鮮膜密封，保存于-20 ℃冰箱中冷凍備用。

樣品的提?。簩悠啡〕錾越鈨觯Q取勻漿樣品5.0 g(精確至0.01 g)于50 mL 具塞離心管中，加入100 μL的混合標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)，依次加入 2.0 mL 超純水和 10.0 mL乙腈(含體積分?jǐn)?shù)為1%的甲酸)，渦旋 1 min，再加入4.0 g MgSO4、1.0 g NaCl及1顆陶瓷均質(zhì)子，渦旋1 min；以8 000 r/min離心5 min，將全部上清液轉(zhuǎn)入空離心管中，冷凍除脂后，剩余提取液待凈化。

樣品的凈化：準(zhǔn)確移取上述提取液1 mL，從m-PFC凈化柱頂部加入，柱底端連接0.22 μm有機(jī)濾膜，濾膜下方連接進(jìn)樣小瓶，然后緩慢推動(dòng)注射桿，流速1～1.5 s/滴，棄去初濾液1～2滴，收集續(xù)濾液，即得待測(cè)液，待UPLC-MS/MS測(cè)定(圖1)。

圖1 樣品前處理流程圖Fig.1 The flow chart of the sample pretreatment

1.4 液相色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜條件：ACQUITY UPLC?BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為5 mmol/L乙酸銨溶液(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸)，流速：0.3 mL/min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：2 μL，梯度洗脫，具體流動(dòng)相比例見表1。

1.有27顆珍珠，其中1顆是假的，但外觀和真的一樣，只是比真珍珠輕一點(diǎn)。請(qǐng)問，最少用天平稱幾次（不用砝碼）就可以把假珍珠找出來？

表1 液相色譜梯度洗脫方法Table 1 Gradient elution method of liquid chromatography

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描(electrospray ion source positive ion，ESI+)，霧化氣溫度：500 ℃，霧化氣流速1 000 L/h，毛細(xì)管電壓：0.4 kV，錐孔氣流速：150 L/h，檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)。

1.5 定量計(jì)算

采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定MG和CV的峰面積，MG和CV的內(nèi)標(biāo)物為氘代孔雀石綠，LMG和LCV的內(nèi)標(biāo)物為氘代隱性孔雀石綠。

本方法中MG的殘留量是指MG和它的代謝物L(fēng)MG殘留量之和，以MG表示。

本方法中MG的殘留量是指MG及其的代謝物L(fēng)CV殘留量之和，以CV表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

與GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》的色譜條件對(duì)比，本文將乙腈更換為甲醇，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，乙腈的極性大于甲醇，在反相色譜柱中，化合物會(huì)延后出峰，并且堿性的4個(gè)MG類化合物都出現(xiàn)峰型變寬和拖尾的情況，因此，選擇乙酸銨作為緩沖溶液，可以調(diào)節(jié)pH值并促進(jìn)目標(biāo)物生成正離子的情況下，加入甲酸，使pH<4，可以有效解決色譜柱游離硅羥基與堿性化合物的二級(jí)作用所造成的拖尾，從而獲得峰型對(duì)稱，靈敏度較高的峰(圖2)。

圖2 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 μg/kg時(shí)4種標(biāo)準(zhǔn)品分別在優(yōu)化液相方法和國(guó)標(biāo)液相方法下的總離子流對(duì)比圖Fig.2 Comparison of total ion chromatograms of four standards under optimized liquid phase method and national standard liquid phase method at 0.5 μg/kg

將梯度洗脫流速設(shè)置為0.3 mL/min時(shí)，洗脫速度加快，3 min內(nèi)可將目標(biāo)物全部洗脫出來，分析時(shí)間短，有機(jī)試劑用量少，基線較穩(wěn)定，干擾少，化合物能夠有效分離，可以達(dá)到快速檢測(cè)的目的。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

圖3 六種標(biāo)準(zhǔn)物MRM離子流圖Fig.3 Standard ion chromatograms for multi-reaction monitoring of six standards

表2 質(zhì)譜參數(shù)表Table 2 Mass spectrometric parameters

2.3 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

使用m-PFC法凈化時(shí)，提取通常需要根據(jù)基質(zhì)的差異，決定是否選擇需要添加MgSO4進(jìn)行脫水干燥以及使用氯化鈉加速水相與有機(jī)相的分層，同時(shí)需要選擇合適的m-PFC凈化柱，以促進(jìn)基質(zhì)中多藥物殘留的充分溶出。本研究中，為了便于冷凍除脂，添加了無水硫酸鎂和氯化鈉，選擇吸附填料為新復(fù)合型納米材料的m-PFC小柱，對(duì)水產(chǎn)品的提取液進(jìn)行凈化，獲得了理想的凈化效果。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)

ME普遍存在于藥物殘留分析中，是指基質(zhì)中一種或者多種成分對(duì)目標(biāo)物分析結(jié)果的影響。樣品基質(zhì)中的某些共提取物組分能明顯降低或增強(qiáng)目標(biāo)物離子的生成速率與強(qiáng)度，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。尤其是在質(zhì)譜檢測(cè)中，基質(zhì)效應(yīng)很普遍。可以使用比值法來評(píng)價(jià)：ME=B/A，其中，A為純?nèi)軇┲兴幬锏捻憫?yīng)值，B為空白樣品基質(zhì)中添加相同含量藥物的響應(yīng)值。若比值>1，則視為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，比值<1，則為基質(zhì)減弱效應(yīng)，比值=1，說明基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的測(cè)定沒有影響。

本研究在同一質(zhì)量濃度水平下，采用流動(dòng)相和基質(zhì)空白分別配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，并通過對(duì)4種物質(zhì)的響應(yīng)比值來獲得基質(zhì)效應(yīng)的大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白基質(zhì)對(duì)MG、CV、LMG的峰響應(yīng)有較大抑制作用，基質(zhì)效應(yīng)的比值<1，而對(duì)LCV峰響應(yīng)幾乎無影響，基質(zhì)效應(yīng)的比值≈1(表3)?；|(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生原因復(fù)雜，難以根本清除。據(jù)報(bào)道，用來減少或補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的方法有：基質(zhì)凈化法、同位素內(nèi)標(biāo)法、空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液等[25]。使用同位素內(nèi)標(biāo)，可以有效地校正基質(zhì)效應(yīng)，但如果內(nèi)標(biāo)含量和分析物含量不一致，基質(zhì)效應(yīng)會(huì)有差異[26-27]。本研究為了能較好地降低ME的影響，采用空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和同位素內(nèi)標(biāo)2種方式進(jìn)行校正。

表3 四種標(biāo)準(zhǔn)物的ME對(duì)比Table 3 Comparison of matrix effects of 4 standards

2.5 方法的線性范圍、檢出限和定量限

4種藥物在最佳條件下的總離子流圖見圖4?？梢?，在最佳條件下4種藥物的分離度良好，在5 min內(nèi)可完成4種藥物的基線分離。

圖4 四種標(biāo)準(zhǔn)物在1.00 ng/mL時(shí)的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of 4 standards at 1.00 ng/mL

由表4可知，4種藥物的線性范圍均在0.1～6.0 ng/mL，色譜峰面積與對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。本實(shí)驗(yàn)通過向草魚空白基質(zhì)中添加多個(gè)較低水平的藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行試驗(yàn)，所得溶液經(jīng)UPLC-MS/MS 分析，取各藥物的S/N=10時(shí)的質(zhì)量濃度計(jì)算該藥物的定量限，以S/N=3時(shí)相應(yīng)濃度確定檢出限。經(jīng)計(jì)算，4種藥物的檢出限均為0.05 μg/kg，定量限均為0.2 μg/kg。比標(biāo)準(zhǔn)方法檢出限(0.5 μg/kg)降低近10倍，說明本方法有較高的靈敏度。

表4 四種化合物的線性范圍、檢出限和定量限以及加標(biāo)回收率和精密度Table 4 Linear relationships, detection limits and quantitation limits, recoveries and RSD of 4 compounds

2.6 加標(biāo)回收率和精密度

本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液-內(nèi)標(biāo)法定量，對(duì)水產(chǎn)品羅非魚、草魚中空白樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，添加水平分別為0.5、1、2、10 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)6次，低速渦旋后加蓋密封，冷藏過夜，第2天取出后置于通風(fēng)櫥避光放至常溫，加入內(nèi)標(biāo)后靜置2 h，之后按照本文樣品的前處理方法進(jìn)行提取凈化。由表4可知，在不同的添加水平下，該方法的回收率為71.1%～84%，RSD為 9%～14%，表明該方法準(zhǔn)確度較高，精密度良好，能夠滿足檢測(cè)要求。

2.7 m-PFC方法與標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

以水產(chǎn)品樣品為例，當(dāng)添加水平為2 μg/kg時(shí)，分別采用m-PFC方法和GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》對(duì)4種藥物的回收率進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，采用m-PFC法，4種藥物的回收率為71.5%～85%，RSD<11%；采用標(biāo)準(zhǔn)方法，4種藥物的回收率為78%～104%，RSD<8%。2種方法相比，回收率相差較小，準(zhǔn)確度也均符合要求，但是標(biāo)準(zhǔn)方法前處理過程包括液液分配至二氯甲烷層進(jìn)行提取，中性氧化鋁柱和陽離子固相柱的凈化以及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮等過程，步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，有毒試劑消耗量大等[28]。而本方法中樣品直接用乙腈振蕩提取，高速離心，冷凍除脂后，將上清液直接注入m-PFC小柱凈化，凈化一步完成，直接吸附雜質(zhì)，無需活化淋洗洗脫，試劑用量少，無需濃縮，單個(gè)樣品凈化時(shí)間小于1 min。相比標(biāo)準(zhǔn)方法，具有步驟簡(jiǎn)單，省時(shí)省力、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度的前提下大大提升了檢測(cè)效率，完全滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的要求。

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

以本研究所建立的m-PFC凈化結(jié)合UPLC-MS/MS法，對(duì)市售的草魚、羅非魚、鰱魚共3份水產(chǎn)品樣品中的4種藥物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為未檢出，與國(guó)標(biāo)方法測(cè)定的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究采用m-PFC前處理凈化技術(shù)，結(jié)合UPLC-MS/MS法，建立了水產(chǎn)品中MG及其代謝物L(fēng)MG、CV及其代謝物L(fēng)CV同時(shí)檢測(cè)的分析方法。該方法單個(gè)樣品凈化時(shí)間<1 min，整個(gè)樣品的前處理及分析時(shí)間能夠在30 min內(nèi)完成。4種藥物的線性范圍在0.1～6.0 ng/mL，檢出限為0.05 μg/kg，定量限為0.2 μg/kg，其檢出限較GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》的檢出限值 (0.5 μg/kg) 降低近10倍。在 0.5、1、2、10 μg/kg 這4個(gè)添加水平下，方法平均回收率均在 71.1%～84%，RSD均小于14%，回收率較好且方法穩(wěn)定。與傳統(tǒng)前處理方法相比，所建立的方法具有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、靈敏度高，在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度的前提下大大提升了檢測(cè)效率，為孔雀石綠及其結(jié)晶紫在水產(chǎn)品中的殘留測(cè)定提供了一種有效的技術(shù)支撐，同時(shí)為研發(fā)建立更快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)水產(chǎn)品中藥物殘留的方法提供了新思路。