枯草芽孢桿菌tdh基因?qū)︶u香風(fēng)味的影響

李雯，謝和

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 貴陽，550025)

醬香風(fēng)味是經(jīng)微生物發(fā)酵產(chǎn)生，由酸類、醇類、醛類、酮類、酚類、吡嗪類等多種風(fēng)味物質(zhì)共同發(fā)揮作用形成的一種復(fù)合香味[1]。研究人員對比各種香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，吡嗪類化合物在醬香型白酒中種類多且含量豐富[2]，其中以四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TTMP)和2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine，2,5-DMP)較突出。TTMP呈泡豆子水氣味[3]，其46%酒精水溶液具有甜香、水果香、花香[4]，在微生物發(fā)酵體系中，由乙偶姻和氨基酸脫下的氨作用生成[5]；2,5-DMP呈炒花生的烘焙香味和巧克力、奶油的氣味[6]，在46%酒精水溶液中呈青草、炒豆香[2]，在微生物發(fā)酵過程中，由L-蘇氨酸脫氫酶(L-threonine dehydrogenase，L-TDH)以L-蘇氨酸為底物生成[7-9]。據(jù)報(bào)道，吡嗪類物質(zhì)減少，醬香風(fēng)味會(huì)消失[10]，表明該物質(zhì)在白酒風(fēng)味中對其他香味物質(zhì)有重要的襯托、疊加作用，可使白酒香氣更加豐厚、飽滿[11-13]。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是重要的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)菌種[14-15]，針對B.subtilis現(xiàn)主要通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)[16]、Cre-LoxP定點(diǎn)重組系統(tǒng)和重疊延伸PCR技術(shù)相結(jié)合[17]實(shí)現(xiàn)對B.subtilis的基因敲除，但國內(nèi)外大多數(shù)研究人員仍采用傳統(tǒng)的同源重組敲除技術(shù)。

本實(shí)驗(yàn)室在前期對醬香風(fēng)味的研究工作中發(fā)現(xiàn)，在醬香風(fēng)味更加濃郁、突出的發(fā)酵物中2,5-DMP相對含量較高，TTMP相對含量較低，而在醬香味不突出的發(fā)酵物中則相反。由此推測，2,5-DMP可能是對醬香風(fēng)味起主要烘托作用的吡嗪類物質(zhì)。因此，本研究以可使發(fā)酵物產(chǎn)生濃郁、純正醬香風(fēng)味的B.subtilisE20為原始菌株，使用同源重組技術(shù)敲除tdh基因，然后進(jìn)行產(chǎn)醬香模擬發(fā)酵，對發(fā)酵物進(jìn)行聞香評價(jià)、風(fēng)味物質(zhì)檢測及特征香氣成分評價(jià)，以期了解2,5-DMP在醬香風(fēng)味呈味中的重要性，有助于了解固態(tài)發(fā)酵中醬香風(fēng)味的形成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

枯草芽孢桿菌B.subtilisE20、枯草芽孢桿菌B.subtilis1S101由貴州大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并保存；埃希氏大腸桿菌E.coliDH5α、質(zhì)粒pUC18購自TakaRa公司；質(zhì)粒pUC18-CAT、pUC18-HR-CAT、pUC18-HL-CAT-HR，本研究構(gòu)建。

1.1.2 引物

實(shí)驗(yàn)所用引物如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.1.3 試劑與儀器

氯霉素，北京索萊寶科技有限公司；GreenTaqMix、基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase，TakaRa公司；其他試劑，國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

T100TMPCR儀、GDXR+凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；DYY-4C核酸電泳儀，北京六一儀器廠；ZWYR-D2403真彩觸摸屏三單元疊加振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；HP-5MS色譜柱、HP6890/5975C GC-MS，美國安捷倫公司；2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取纖維，美國Supelco公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，瓊脂粉20，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基：選用市售優(yōu)質(zhì)黃豆，用自來水浸泡24 h，按每瓶50 g分裝于250 mL三角瓶中，棉塞密封，121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 敲除載體的構(gòu)建

以含氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)基因(cat)的B.subtilis1S101基因組DNA為模板，用引物CAT-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得cat基因序列；以野生菌株B.subtilisE20基因組DNA為模板，使用tdh基因同源左臂引物HL-F/R、同源右臂引物HR-F/R擴(kuò)增基因序列，將上述片段連入pUC18，并轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建敲除載體pUC18-HL-CAT-HR。

1.2.2 基因敲除菌株的構(gòu)建

將構(gòu)建成功的敲除載體pUC18-HL-CAT-HR轉(zhuǎn)化至E20感受態(tài)細(xì)胞中，E20感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化按照文獻(xiàn)描述的方法[18]。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有5 μg/mL氯霉素的LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。使用驗(yàn)證引物TEST-F/R對挑取的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR、基因組DNA PCR和測序鑒定，將鑒定為重組型的菌株命名為E20-Δtdh。

1.2.3 產(chǎn)醬香模擬發(fā)酵方法

從牛肉膏蛋白胨固體平板上挑取野生菌株E20、突變菌株單菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，150 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。用移液槍吸取1 mL種子菌液接種于黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩均勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中，模擬產(chǎn)醬香升溫發(fā)酵，溫度控制方法依次為30、35、40、45、50、55 ℃各24 h。

1.2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測

運(yùn)用頂空固相微萃取裝置聯(lián)合GC-MS對野生菌株、突變菌株的黃豆發(fā)酵物進(jìn)行檢測分析。取搗碎后混勻樣品3 g，置于25 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在65 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min，移出萃取頭并立即插入GC進(jìn)樣口(250 ℃)中，熱解析進(jìn)樣。GC條件：色譜柱為HP-5MS(60 m×0.25 mm,0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱，初始溫度 40 ℃(保留2 min)，以3.5 ℃/min升溫至180 ℃；以10 ℃/min升溫至260 ℃，運(yùn)行時(shí)間：50 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓15.85 psi，載氣流量1.0 mL/min，分流10∶1，溶劑延遲時(shí)間：3 min。MS條件：EI離子源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 847 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍29～500 amu。對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist 17和Wiley 275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，用峰面積歸一化法測定各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.5 特征香氣成分評價(jià)方法

目前許多學(xué)者主要參考劉登勇等[19]的氣味活度值(odor activity value，OAV)法評價(jià)各揮發(fā)性成分對樣品總體香氣的貢獻(xiàn)。為篩選出所檢出風(fēng)味物質(zhì)中OAV最高的若干種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，可用這些化合物的相對百分含量(C)進(jìn)行分析[20]。因此，參考解春芝[20]的方法采用相對風(fēng)味活度值(relative OAV，ROAV)定義對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分：ROAVmax=100。其他風(fēng)味成分ROAV計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：Ci、Ti分別為各揮發(fā)性物質(zhì)的相對百分含量和相對應(yīng)的感覺閾值，Cmax、Tmax分別為對樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的相對百分含量和相對應(yīng)的感覺閾值。

所有組分均滿足0

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除載體的構(gòu)建

分別以1S101和E20的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得CAT、tdh基因同源左臂(HL)和同源右臂(HR)片段，3個(gè)片段的大小分別為1 539、892、511 bp。將CAT、HL、HR目的片段采用雙酶切、酶連接的方法分步接入pUC18，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中；從氯霉素(25 μg/mL)LB固體平板上挑選單菌落進(jìn)行PCR及質(zhì)粒雙酶切(EcoR I、KpnI)鑒定，結(jié)果顯示2條明顯的與預(yù)期相符的條帶(4 736、892 bp)(圖1)；同時(shí)測序結(jié)果顯示，構(gòu)建的敲除質(zhì)粒序列同預(yù)期一致，表明pUC18-HL-CAT-HR載體構(gòu)建成功,構(gòu)建流程如圖2所示。

M-DL 5 000 marker;1～2-pUC18-HL-CAT-HR質(zhì)粒平行樣圖1 pUC18-HL-CAT-HR質(zhì)粒雙酶切Fig.1 pUC18-HL-CAT-HR plasmid double enzyme digestion

2.2 基因敲除菌株的獲得及驗(yàn)證

檢測引物TEST-F/R(表1)位于tdh基因同源左臂上游、同源右臂下游。使用引物TEST進(jìn)行PCR驗(yàn)證原始菌株和敲除菌株，片段大小為2 760、3 407 bp。挑取經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證為陽性交換的突變菌株進(jìn)行基因組DNA PCR，獲得條帶單一、明亮且片段大小為3 407 bp左右的目的條帶(圖3)，且測序結(jié)果表明，突變菌株中的tdh基因已成功被敲除載體上的cat基因替換，表明突變菌株E20-Δtdh構(gòu)建成功。

M-DL 5 000 marker；1～3-E20-Δtdh基因組DNA平行樣圖3 E20-Δtdh基因組DNA PCRFig.3 E20-Δtdh genomic DNA PCR

為確保突變菌株E20-Δtdh具有遺傳穩(wěn)定性，使用抗性平板進(jìn)行劃線傳代培養(yǎng)(傳至12代)，提取基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，均獲得了大小為3 407 bp左右的片段(圖4)，表明突變菌株E20-Δtdh遺傳性穩(wěn)定。

M-DL 5 000 marker；1～11-2～12代E20-Δtdh菌株基因組圖4 E20-Δtdh基因組PCRFig.4 E20-Δtdh genomic PCR

2.3 醬香模擬發(fā)酵物感官評價(jià)

使用野生菌株E20、突變菌株E20-Δtdh分別對黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)醬香模擬發(fā)酵，以加入等量無菌水的黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵物進(jìn)行感官評價(jià)(表2、圖5)。添加無菌水的空白對照樣品(HCK)主要呈黃豆的甜香味；經(jīng)野生菌株E20發(fā)酵的黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基(HE20)褐變極為明顯，最終呈棕褐色或黑褐色，有濃郁、純正的醬香風(fēng)味，有大量的黏液產(chǎn)生；由突變菌株E20-Δtdh發(fā)酵的黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基(HE20-Δtdh)褐變程度與HE20一致，同樣有大量黏液產(chǎn)生，但醬香味比HE20略淡，有焦糊味產(chǎn)生。

圖5 醬香模擬發(fā)酵后的黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基Fig.5 Soybean fermentation medium after Maotai flavor simulated fermentation

表2 醬香模擬物發(fā)酵感官評價(jià)Table 2 Sensory evaluation on fermentation of Maotai flavor simulants

2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測與分析

黃豆發(fā)酵物HCK、HE20、HE20-Δtdh的總離子流色譜圖如圖6所示。

a-HCK；b-HE20；c-HE20-Δtdh圖6 黃豆發(fā)酵物風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS總離子流色譜圖Fig.6 GC-MS total ion flow chromatography of flavor compounds in soybean fermentation products

由表3可知，使用微生物和不使用微生物進(jìn)行發(fā)酵，主體風(fēng)味成分有較大的差異。在HCK、HE20和HE20-Δtdh中分別檢測出了61、38、34種揮發(fā)性風(fēng)味成分。HCK的吡嗪類物質(zhì)相對含量與HE20相差19.481%，差異顯著，與HE20-Δtdh相差3.392%，差異不顯著。與HCK相比，HE20和HE20-Δtdh中的烷烴類、烯類、醇類、呋喃類、苯類、酚類、醚類、其他類物質(zhì)的總量都較低，但酸類物質(zhì)總量有所增加，在HE20-Δtdh中，酸類物質(zhì)含量高達(dá)86.474%。

表3 HCK、HE20、HE20-Δtdh中的揮發(fā)性成分Table 3 Relative content of volatile components in HCK, HE20 and HE20-Δtdh

續(xù)表3

續(xù)表3

風(fēng)味物質(zhì)對總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)不僅取決于其含量，還取決于其氣味閾值。通過查詢，共找到24種揮發(fā)性風(fēng)味化合物氣味閾值；進(jìn)行ROAV分析，結(jié)果如表4所示,HCK中ROAV>1的物質(zhì)有1-辛烯-3-醇和己醛，是HCK中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，1-辛烯-3-醇呈青草香、水果香、蘑菇香，己醛具有花香、水果香；對總體風(fēng)味有修飾作用的物質(zhì)有異戊醛、辛醛、壬醛、丁酸乙酯和己酸乙酯(0.1≤ROAV<1)，它們均具有花香、水果香、甜香味，與嗅聞到的黃豆甜香味相符。

表4 HCK、HE20、HE20-Δtdh中揮發(fā)性物質(zhì)的閾值及ROAVTable 4 Threshold and ROAV of volatile substances in HCK, HE20, HE20-Δtdh

續(xù)表4

在醬香味純正、濃郁的HE20中，關(guān)鍵風(fēng)味化合物(ROAV>1)有苯乙醛、1-辛烯-3-醇、異戊醛、3-甲基丁酸、三甲基吡嗪、2-甲基丙酸、2,5-DMP、苯甲醛、2-甲基丁酸；ROAV在0.1～1的僅有乙醛，有一定的刺激味。醬香味較淡的HE20-Δtdh除缺少了2,5-DMP呈香外，其余關(guān)鍵風(fēng)味化合物同HE20一致，但ROAV有差異；HE20的異戊醛、苯乙醛、苯甲醛的ROAV分別是HE20-Δtdh的1.9、1.8、1.4倍；HE20-Δtdh的1-辛烯-3-醇、乙酸、2-甲基丙酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸分別是HE20的1.1、14、5.6、7.4、3.6倍，雖然兩者的乙酸ROAV相差倍數(shù)最大，但乙酸對總體風(fēng)味無直接影響。

在HE20、HE20-Δtdh的關(guān)鍵風(fēng)味化合物中，苯乙醛、異戊醛、苯甲醛主要呈果香、堅(jiān)果香、花香，關(guān)鍵的酸類風(fēng)味化合物3-甲基丁酸、2-甲基丙酸、2-甲基丁酸主要呈現(xiàn)酸、汗味等，與在醬香型白酒中檢測到的主要酸類化合物相吻合[23-24]，三甲基吡嗪、2,5-DMP主要呈濃厚的堅(jiān)果香氣、青草香、炒豆香；結(jié)合感官評價(jià)(表2)，HE20-Δtdh缺少了2,5-DMP，醬香風(fēng)味不突出，表明該物質(zhì)在發(fā)酵物形成醬香風(fēng)味中具有十分重要的作用。

吡嗪類化合物對醬香風(fēng)味的形成具有重要作用。對HE20、HE20-Δtdh中的吡嗪類物質(zhì)進(jìn)行T檢驗(yàn)(表5)，HE20-Δtdh中的三甲基吡嗪和3-乙基-2,5-DMP呈減少趨勢，且差異顯著；在HE20-Δtdh中檢測到少量的2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪(0.139%)，在HE20中未檢測出。在HE20中檢測出大量的2,5-DMP(15.129%)而在HE20-Δtdh中未檢測到，表明tdh基因的缺失影響了2,5-DMP的生成；在HE20中檢測到的TTMP相對含量并不高，HE20-Δtdh中TTMP相對含量比HE20多出了3.042%，兩者差異顯著。另一方面，據(jù)ROAV分析(表4)，2,5-DMP、三甲基吡嗪對發(fā)酵物的總體風(fēng)味有直接影響，TTMP在HE20中對總體風(fēng)味無顯著影響(ROAV<0.1)，在HE20-Δtdh對總體風(fēng)味起修飾作用(0.1≤ROAV<1)。因此推測，在對醬香風(fēng)味起烘托作用的吡嗪類物質(zhì)中，2,5-DMP的貢獻(xiàn)可能比TTMP的貢獻(xiàn)大。

表5 HE20、HE20-Δtdh發(fā)酵物中吡嗪類物質(zhì)相對含量獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)Table 5 Independent sample T test for the relative content of pyrazines in HE20 and HE20-Δtdh fermentation

3 結(jié)論

本研究通過同源重組對1株可使發(fā)酵物產(chǎn)生濃郁醬香味的B.subtilisE20菌株的tdh基因進(jìn)行了基因敲除。將突變菌株與野生菌株接種至黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行模擬產(chǎn)醬香升溫發(fā)酵。通過感官評價(jià)和頂空固相微萃取聯(lián)合GC-MS技術(shù)分析了發(fā)酵物風(fēng)味的變化，結(jié)合ROAV分析發(fā)現(xiàn)，野生菌株E20可使黃豆發(fā)酵產(chǎn)生濃郁的醬香風(fēng)味，苯乙醛、1-辛烯-3-醇、異戊醛、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸、三甲基吡嗪、2,5-DMP、苯甲醛、2-甲基丁酸為關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味化合物。tdh基因敲除后黃豆發(fā)酵物醬香味不突出，該基因?qū)S豆發(fā)酵物中的酸類、醛類、吡嗪類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量影響較大，未檢測到2,5-DMP。通過ROAV分析發(fā)現(xiàn)，tdh基因敲除后黃豆發(fā)酵物的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味化合物除無2,5-DMP外，其余與野生菌株E20黃豆發(fā)酵物的一致。在醬香風(fēng)味的特征成分——吡嗪類物質(zhì)中，2,5-DMP、三甲基吡嗪對總體風(fēng)味有直接影響，TTMP在HE20中對總體風(fēng)味無顯著影響，在HE20-Δtdh對總體風(fēng)味有修飾作用，表明在對醬香風(fēng)味起烘托作用的吡嗪類物質(zhì)中，起主要貢獻(xiàn)作用的是2,5-DMP，TTMP對總體風(fēng)味的修飾作用不大。tdh基因與2,5-DMP的生成密切相關(guān)且與醬香風(fēng)味的形成呈正相關(guān)關(guān)系，這對進(jìn)一步研究醬香風(fēng)味的形成機(jī)制有重要意義。