代謝改造熱帶假絲酵母提高D-乳酸的產(chǎn)量

黃玉堃，張利華，張海冰，曹鈺

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

乳酸，也叫2-羥基丙酸，是一種無(wú)色無(wú)味的單羧基酸[1]，被廣泛地應(yīng)用于食品、藥品、生物材料等領(lǐng)域[2]。乳酸是聚乳酸的合成單體，聚乳酸是生物可降解塑料的合成原料，被認(rèn)為是基于化石燃料合成塑料的良好替代品[3]。因羥基的結(jié)合位置不同，乳酸可分為D-乳酸(D-lactic acid，D-LA)和L-乳酸，聚D-乳酸和聚L-乳酸按一定比例地混合能夠提升聚乳酸材料的熱穩(wěn)定性和結(jié)晶度[4]。由于人們綠色環(huán)保意識(shí)的不斷提高，對(duì)于生物可降解塑料的需求也不斷增加，乳酸的產(chǎn)量仍需不斷提高。

截至2008年，全球乳酸年產(chǎn)量約為37萬(wàn)t，有近90%的生產(chǎn)廠家采用發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)[5]。2018年，全世界D-乳酸產(chǎn)量是1.6萬(wàn)t，而D-乳酸的需求量約為2.6萬(wàn)t/年[6]。利用發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的微生物來(lái)源廣泛，主要有乳酸桿菌[7]，釀酒酵母[8]，索氏假絲酵母[9]，馬氏克魯維酵母[10]，產(chǎn)甘油假絲酵母[11]等。

由于目前以細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸需要控制環(huán)境為中性pH，獲得的是乳酸鹽，需重新酸化后變成乳酸且過(guò)程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件有較多要求，而酵母菌能夠利用價(jià)格低廉的底物且對(duì)pH有更好的耐受性，所以對(duì)于酵母菌生產(chǎn)乳酸的研究也越來(lái)越多[12]。熱帶假絲酵母是一種非常規(guī)的二倍體酵母[13]，結(jié)合其自身的特點(diǎn)當(dāng)前主要應(yīng)用于長(zhǎng)鏈二元酸的生物生產(chǎn)[14-15]。

本研究以熱帶假絲酵母CU-206為出發(fā)菌株，敲除了丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)基因(pdc)，整合表達(dá)了異源D-乳酸脫氫酶(D-lactate dehydrogenase,D-LDH)基因(d-ldh)和內(nèi)源2-羥基酸脫氫酶(2-hydroxyacid dehydrogenase，2-HAD)(2-had)基因，探究了熱帶假絲酵母菌進(jìn)行乳酸生產(chǎn)的潛力。其中來(lái)自大腸桿菌的D-LDH[16]和來(lái)自其本身的2-HAD[17]能夠催化丙酮酸向D-乳酸的轉(zhuǎn)化。熱帶假絲酵母生產(chǎn)D-乳酸的參考代謝路徑見(jiàn)文獻(xiàn)[18]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和引物

本實(shí)驗(yàn)中所使用的載體pMD19-T Simple購(gòu)自TaKaRa公司，質(zhì)粒均在此載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建獲得；質(zhì)粒Ts-gda324-URA3、Ts-PGAPDH-GFP-TGAPDH由本實(shí)驗(yàn)室保藏；菌株CU-206是熱帶假絲酵母ATCC20336尿嘧啶(URA3)缺陷型菌株；構(gòu)建菌株見(jiàn)表1。本實(shí)驗(yàn)所用的PCR引物見(jiàn)表2，DNA測(cè)序等由蘇州金唯智生物科技有限公司提供。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.1.2 主要培養(yǎng)基、試劑和儀器

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10；

MM培養(yǎng)基(g/L)：酵母氮源培養(yǎng)基(yeast nitrogen base，YNB) 6.7，葡萄糖20，硫酸銨10；

SM培養(yǎng)基(g/L)：YNB 6.7，葡萄糖20，硫酸銨10，尿嘧啶0.06；

SM+5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid，5-FOA)培養(yǎng)基：在SM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2 g/L 5-FOA；

YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20；固體培養(yǎng)基需加入20 g/L瓊脂粉。

乳酸、丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；乙醇標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；YNB、5-FOA，上海生物工程股份有限公司；酵母RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；熒光定量PCR試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

ETC811PCR擴(kuò)增儀，上海東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；WD-9403B瓊脂糖凝膠電泳儀，北京市六一儀器廠；UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼科有限公司；1260 Infinity高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 敲除框的構(gòu)建

基于熱帶假絲酵母ATCC20336的基因組測(cè)序結(jié)果，找到丙酮酸脫羧酶系PDC1，PDC2。以pdc1的基因敲除框?yàn)槔?，熱帶假絲酵母ATCC20336的基因組為模板，設(shè)計(jì)引物PDC1-F1，PDC1-R1，分別帶有MluI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增pdc1基因，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，并與pMD19-T Simple載體進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒Ts-PDC1；再以質(zhì)粒Ts-PDC1為模板，設(shè)計(jì)反向PCR引物rPDC1-F1，rPDC1-R1(分別帶有PstⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn))，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段PDC1u-Ts-PDC1d后進(jìn)行凝膠回收，再用限制性?xún)?nèi)切酶PstⅠ和XbaⅠ消化，留存?zhèn)溆?。同時(shí)對(duì)質(zhì)粒Ts-gda324-URA3用限制性?xún)?nèi)切酶PstⅠ和XbaⅠ消化，將其與凝膠回收且酶切消化后的片段PDC1u-Ts-PDC1d進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒Ts-PDC1-gda324-URA3-PDC1(圖1-a)。對(duì)上述重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶MluⅠ消化后得到敲除框片段PDC1-gda324-URA3-PDC1。pdc1等位基因第二拷貝的敲除框與上述敲除框存在差異，第二拷貝敲除框的同源臂pdc1n為pdc1內(nèi)側(cè)基因，第一拷貝敲除框的同源臂為pdc1外側(cè)基因。pdc2基因的敲除框利用與上述相同的方法進(jìn)行構(gòu)建。

a-pdc1第一拷貝敲除框；b-2-had基因整合框圖1 pdc1基因敲除框和2-had基因整合框的構(gòu)建Fig.1 Construction of pdc1 disruption cassette and 2-had integration cassette

1.2.2 整合框的構(gòu)建

在1.2.1pdc1敲除框構(gòu)建的基礎(chǔ)上，從pdc1基因第二拷貝的敲除框出發(fā)，對(duì)質(zhì)粒Ts-PDC1n-gda-URA3-PDC1n進(jìn)行PstI單酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化；基于熱帶假絲酵母ATCC20336的基因組測(cè)序結(jié)果，找到2-had基因，以ATCC20336的基因組為模板，利用引物2HAD-F1，2HAD-R1對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化產(chǎn)物與質(zhì)粒Ts-PGAPDH-GFP-TGAPDH同時(shí)進(jìn)行Hind Ⅲ，SalⅠ雙酶切后進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒Ts-PGAPDH-2HAD-TGAPDH。利用引物P-2HAD-T-f1(1n)，P-2HAD-T-r1(1-2n)對(duì)質(zhì)粒Ts-PGAPDH-2HAD-TGAPDH進(jìn)行分子克隆，下面以pdc1內(nèi)側(cè)基因pdc1n為整合位點(diǎn)舉例，與質(zhì)粒Ts-PDC1n-gda-URA3-PDC1n的PstⅠ單酶切產(chǎn)物進(jìn)行一步克隆連接，構(gòu)建得到質(zhì)粒Ts-PDC1n-PGAPDH-2HAD-TGAPDH-gda324-URA3-PDC1n，如圖1-b利用MluⅠ單酶切，獲得PDC1n-PGAPDH-2HAD-TGAPDH-gda324-URA3-PDC1n線性化片段，對(duì)所得片段進(jìn)行純化。根據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道，選取其中來(lái)自大腸桿菌的d-ldh基因，并參考熱帶假絲酵母密碼子優(yōu)化表，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成基因，D-乳酸脫氫酶基因的整合框構(gòu)建參考上述2-had的整合框構(gòu)建。

1.2.3 酵母的氯化鋰轉(zhuǎn)化

酵母的氯化鋰轉(zhuǎn)化法參考文獻(xiàn)[19]，以尿嘧啶缺陷型菌株CU-206為出發(fā)菌株，在SM固體平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落接種于20 mL SM培養(yǎng)基, 在30 ℃ 培養(yǎng)1.5～2 d，OD600值到8～12，轉(zhuǎn)接適量菌液于50 mL SM培養(yǎng)基中，使其初始OD600值為0.1，培養(yǎng)10～12 h，OD600值到1左右時(shí)離心(5 000 r/min，5 min)。TE溶液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，1 mmol/L EDTA)清洗1次，瞬時(shí)離心，重懸在裝有1 mL 100 mmol/L氯化鋰保藏管中，30 ℃，200 r/min搖床放置1 h；將鮭魚(yú)精用PCR儀99 ℃加熱6 min，加熱完畢后迅速置于冰盒中；DNA純化片段10 μL、細(xì)胞88 μL、鮭魚(yú)精2 μL，混勻。置于30 ℃溫度下孵育30 min，每隔15 min顛倒1次；加入900 μL 400 g/L PEG3350，含100 mmol/L氯化鋰。30 ℃，200 r/min搖床放置1 h；42 ℃熱激5 min，快速冷卻至室溫，插入冰中5 min，瞬時(shí)離心后水洗，加100～200 μL無(wú)菌水重懸細(xì)胞，涂布MM平板，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

1.2.4 酵母轉(zhuǎn)化子的篩選與URA3的重復(fù)使用

挑取上述MM平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子，在新的MM平板上劃線，刮取適量菌體提取基因組，利用整合基因位點(diǎn)外側(cè)和內(nèi)側(cè)的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證；再將PCR驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子涂布到SM+5-FOA平板上，對(duì)篩選標(biāo)記基因URA3彈出，利用PCR初步驗(yàn)證彈出URA3基因后，將PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)正確后保藏正確菌株，在此基礎(chǔ)上重復(fù)利用URA3[20]，對(duì)第二拷貝基因敲除，以及后續(xù)基因的整合。以外源d-ldh基因的整合為例，其構(gòu)建流程見(jiàn)圖2。

圖2 d-ldh基因整合熱帶假絲酵母流程圖Fig.2 Gene integration of d-ldh in C.tropicalis

1.2.5 基因表達(dá)水平的測(cè)定

將菌株ATCC20336、AK04、AK06在YPD平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，接單菌落到10 mL YPD培養(yǎng)基中30 ℃，200 r/min培養(yǎng)1 d，轉(zhuǎn)接適量菌液到50 mL YPD培養(yǎng)基中，相同的條件下培養(yǎng)7～10 h，待OD600值達(dá)到1.5～2.5時(shí)，用Yeast RNAiso Kit試劑盒提取各菌株RNA，后使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再以得到的cDNA為模板，ACT為內(nèi)參基因，使用ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix試劑盒配制體系，應(yīng)用CFX96Real-Time PCR Detection System擴(kuò)增儀對(duì)目的基因進(jìn)行qPCR檢測(cè)，引物如表2所示。

1.2.6 生長(zhǎng)曲線與搖瓶發(fā)酵

生長(zhǎng)曲線：將ATCC20336、AK01、AK02、AK03、AK04、AK05、AK06和AK07分別在MM平板上劃線，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到20 mL YPD培養(yǎng)基中，在30 ℃，200 r/min培養(yǎng)1.5～2 d；取適量菌液轉(zhuǎn)接到50 mL YPD培養(yǎng)基中，控制它們的初始OD600值為0.1左右，每株菌取3個(gè)平行，每隔12 h取1次樣，測(cè)定OD600值。

搖瓶發(fā)酵：將各菌株在YPD平板劃線，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到20 mL YPD培養(yǎng)基中，200 r/min，30 ℃培養(yǎng)1.5 d；按1 %的接種量轉(zhuǎn)接到50 mL YP-5%D培養(yǎng)基中，每株菌取3個(gè)平行，每隔12 h取1次樣，測(cè)定殘?zhí)呛蚿H值，發(fā)酵過(guò)程中未加入任何中和劑。

1.2.7 乳酸及其副產(chǎn)物的測(cè)定

對(duì)發(fā)酵液樣品進(jìn)行離心[21]，12 000 r/min，5 min保留上清液，并稀釋相應(yīng)倍數(shù)，用0.22 μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾后加入到液相樣品瓶中；HPLC中使用的是Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm)，保護(hù)柱是Bio-rad Carbo-H， 流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，柱溫為55 ℃，檢測(cè)器是RID-10A示差折光檢測(cè)器。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙酮酸脫羧酶基因的敲除

構(gòu)建了質(zhì)粒Ts-PDC1u-gda324-URA3-PDC1d，用XbaI，PstI雙酶切，獲得大小為3.4 kbp和1.9 kbp的片段(圖3-a)；后將該質(zhì)粒用MluI酶切純化，將線性化片段向出發(fā)菌CU-206中轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化子，提取基因組后用敲除位點(diǎn)外側(cè)引物PDC1wcF1，PDC1wcR1進(jìn)行PCR驗(yàn)證分別得到2.2 kbp和3.2 kbp的條帶(圖3-b);將上述正確的轉(zhuǎn)化子涂布到SM+5-FOA平板上，對(duì)URA3進(jìn)行彈出，用PDC1wcF1，PDC1wcR1引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證分別得到1.6 kbp和2.2 kbp的條帶；對(duì)正確彈出URA3的轉(zhuǎn)化子，向其轉(zhuǎn)化第二拷貝敲除盒PDC1n-gda324-URA3-PDC1n，獲得轉(zhuǎn)化子，提取基因組用敲除位點(diǎn)外側(cè)和內(nèi)側(cè)引物PDC1wcF1，PDC1n-R1進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得3.4 kbp的條帶(圖3-c)。以同樣的方式構(gòu)建pdc2基因敲除菌株，電泳驗(yàn)證圖此處省略。經(jīng)測(cè)序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了pdc1基因敲除菌株AK01、pdc2基因敲除菌株AK02和pdc1/pdc2基因敲除菌株AK03。

2.2 內(nèi)源2-羥基酸脫氫酶與異源D-乳酸脫氫酶的過(guò)表達(dá)

以ATCC20336的基因組為模板，利用引物2-HAD-F1，2-HAD-R1對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1 017 bp的條帶；以pdc1內(nèi)側(cè)基因?yàn)檎衔稽c(diǎn)為例，將構(gòu)建好的質(zhì)粒Ts-PDC1n-P-2HAD-T-gda-URA3-PDC1n用MluI單酶切，分別得到5.4 kpp和2.7 kbp的條帶，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化后轉(zhuǎn)化到pdc1單拷貝敲除彈出URA3的菌株中，獲得轉(zhuǎn)化子，提取基因組，用整合位點(diǎn)外側(cè)和內(nèi)側(cè)的引物PDC1wcF1，2HAD-R1，進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖3-d)得到3.7 kbp的條帶，對(duì)照組中無(wú)條帶，后送測(cè)序，結(jié)果顯示成功構(gòu)建并獲得pdc1基因敲除且過(guò)表達(dá)2-had基因的菌株AK04和pdc1/pdc2基因敲除且過(guò)表達(dá)2-had基因的菌株AK06。

以同樣的方法成功構(gòu)建pdc1基因敲除且過(guò)表達(dá)異源d-ldh的菌株AK05和pdc1/pdc2基因敲除且過(guò)表達(dá)d-ldh的菌株AK07，電泳驗(yàn)證圖此處省略。

M-DL 5 000 markera-1-質(zhì)粒Ts-PDC1u-gda324-URA3-PDC1d酶切驗(yàn)證；b-1-ATCC20336對(duì)照；b-2-pdc1單拷貝敲除轉(zhuǎn)化子；c-1-pdc1單拷貝敲除彈出URA3對(duì)照；c-2～7-pdc1雙拷貝敲除轉(zhuǎn)化子；d-1-pdc1單拷貝敲除彈出URA3對(duì)照；d-2-pdc1雙拷貝敲除整合2HAD轉(zhuǎn)化子圖3 pdc1基因敲除與2-had基因整合菌株的PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR identification of pdc1 Gene disruption and 2-had Gene integration strains and plasmid

2.3 基因表達(dá)水平的分析

內(nèi)源2-had過(guò)表達(dá)菌株AK04和AK06與野生型菌株ATCC20336的mRNA相對(duì)豐度如圖4所示，AK06的mRNA表達(dá)量是野生型菌株的4.85倍，而AK04的mRNA表達(dá)量只有野生型的1/10，這一點(diǎn)與AK04的乳酸產(chǎn)量低于野生型菌株相一致。推測(cè)其原因可能是pdc1同工酶基因是pdc的關(guān)鍵酶基因，2-had在pdc1基因位點(diǎn)的整合阻礙了2-had的過(guò)表達(dá)，而在pdc2基因位點(diǎn)的整合能夠過(guò)表達(dá)。

圖4 不同菌株2-had基因的表達(dá)水平Fig.4 Gene expression levels of 2-had in different strains

2.4 不同重組菌株的生長(zhǎng)情況

野生型菌株ATCC20336與其他7株基因改造菌株在250 mL搖瓶，裝液量為50 mL的YPD中30 ℃培養(yǎng)108 h的生長(zhǎng)情況如圖5所示。相較于野生型菌株ATCC20336和pdc2等位基因敲除菌株AK02，pdc1等位基因敲除的菌株AK01和AK03出現(xiàn)了一定的生長(zhǎng)抑制，這一點(diǎn)也可以從各菌株在YP-5%D發(fā)酵過(guò)程中的殘?zhí)窍牡靡钥闯?，如圖6所示。由此推測(cè)丙酮脫酸酶基因pdc的2個(gè)同工酶PDC1和PDC2中，pdc1等位基因的敲除對(duì)菌株的生長(zhǎng)情況影響較大。相較于表達(dá)內(nèi)源2-had的菌株AK04和AK06，表達(dá)異源LDH的菌株AK05和AK07也出現(xiàn)了不同程度的生長(zhǎng)抑制，推測(cè)異源蛋白LDH的表達(dá)對(duì)菌體產(chǎn)生一定毒性，抑制了菌體的生長(zhǎng)。

a-ATCC20336與AK01、AK04和AK05的生長(zhǎng)情況；b-ATCC20336與AK02、AK03、AK06和AK07的生長(zhǎng)情況圖5 不同菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curves of different strains

a-葡萄糖含量；b-pH值；c-甘油含量；d-丙酮酸含量；e-乙醇含量圖6 不同菌株發(fā)酵時(shí)pH與副產(chǎn)物的變化情況Fig.6 Variation of pH and by-products during the fermentation of different strains

2.5 重組菌株的乳酸及其副產(chǎn)物的檢測(cè)

取不同發(fā)酵時(shí)間的樣品，測(cè)定pH以及預(yù)處理后進(jìn)行高效液相色譜的檢測(cè)。殘?zhí)呛透碑a(chǎn)物乙醇、丙酮酸、甘油的生產(chǎn)情況如圖6所示。圖6-a顯示了各菌株對(duì)于葡萄糖的消耗情況，這也與2.4(圖5)中的生長(zhǎng)曲線相關(guān)聯(lián)。圖6-b反映了各菌株發(fā)酵過(guò)程中pH的變化情況，野生型菌株ATCC20336的pH一直穩(wěn)定在6附近，基因重組菌株的pH基本都呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，pH的下降與丙酮酸，乳酸等有機(jī)酸的產(chǎn)生有關(guān)；在菌體生長(zhǎng)平衡期由于菌體的衰亡以及碳源的逐漸耗盡細(xì)胞被迫利用有機(jī)酸，導(dǎo)致pH有所上升。同時(shí)LDH的酶活性也受到pH的影響[22]，這也說(shuō)明后續(xù)的發(fā)酵優(yōu)化中對(duì)于pH的控制也顯得極為重要。圖6-c反映了副產(chǎn)物甘油的生產(chǎn)情況，由熱帶假絲酵母利用葡萄糖生產(chǎn)乳酸的參考代謝路徑可知，碳流有相當(dāng)部分進(jìn)入甘油生產(chǎn)路徑，從而降低了目的產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)量，其中AK07在96 h時(shí)甘油的產(chǎn)量達(dá)到10.85 g/L。圖6-d表現(xiàn)出各菌株中間代謝產(chǎn)物丙酮酸的生產(chǎn)情況，其中AK04在72 h時(shí)的產(chǎn)量為11.68 g/L。由圖6-e各菌株乙醇的生產(chǎn)情況可知，野生型菌株的乙醇產(chǎn)量最大為17.17 g/L，AK01、AK04和AK05基本不產(chǎn)乙醇，可以發(fā)現(xiàn)pdc1等位基因的敲除可以顯著降低乙醇產(chǎn)量。

不同菌株的乳酸最大產(chǎn)量如圖7所示。值得注意的是，作為pdc1和pdc2兩同工酶等位基因同時(shí)敲除且表達(dá)異源LDH的菌株AK07在發(fā)酵過(guò)程中始終未檢測(cè)到乳酸的產(chǎn)生，通過(guò)提取該菌株的RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，后進(jìn)行PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，異源ldh基因幾乎不表達(dá)。其中野生型菌株ATCC20336的乳酸產(chǎn)量約為0.21 g/L，AK06在48 h時(shí)的產(chǎn)量為0.45 g/L，較野生型菌株的產(chǎn)量提升1倍。AK05在72 h時(shí)最大產(chǎn)量為6.10 g/L,是野生型菌株產(chǎn)量的29倍。

圖7 不同菌株的D-乳酸產(chǎn)量Fig.7 Production of D-LA by different strains

3 結(jié)論與討論

本研究從熱帶假絲酵母生產(chǎn)乳酸的代謝路徑出發(fā)，探究了基因工程改造對(duì)其乳酸積累的影響。通過(guò)對(duì)丙酮酸脫羧酶PDC的同工酶基因pdc1，pdc2單獨(dú)敲除和復(fù)合敲除，研究了基因敲除對(duì)于菌株生長(zhǎng)情況和產(chǎn)物生產(chǎn)性能的作用，發(fā)現(xiàn)pdc1基因的敲除能夠顯著地抑制菌株的生長(zhǎng)以及降低菌株乙醇的產(chǎn)量，而pdc2的敲除對(duì)于菌株的影響較小；通過(guò)過(guò)表達(dá)熱帶假絲酵母內(nèi)源性的2-羥基酸脫氫酶基因2-had，旨在促進(jìn)丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-had的過(guò)表達(dá)未對(duì)菌株的乳酸產(chǎn)量產(chǎn)生明顯的影響；對(duì)菌株整合表達(dá)來(lái)自大腸桿菌且經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的D-乳酸脫氫酶基因d-ldh，結(jié)果表明d-ldh整合表達(dá)菌株AK05的乳酸產(chǎn)量是野生型菌株ATCC20336的29倍，體現(xiàn)出較好的乳酸生產(chǎn)性能，而另一d-ldh整合表達(dá)菌株AK07未表現(xiàn)出預(yù)期的乳酸生產(chǎn)性能，在其發(fā)酵液中未能檢測(cè)到乳酸。目前也面臨著重組菌株在發(fā)酵過(guò)程中的pH維持較低的水平，不利于乳酸的積累；乳酸生產(chǎn)菌株的中間代謝產(chǎn)物丙酮酸和甘油的產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比高出許多等問(wèn)題。

本研究對(duì)熱帶假絲酵母進(jìn)行了一系列基因的敲除與整合，獲得了一株D-乳酸產(chǎn)量最高為6.10 g/L的菌株，為后續(xù)進(jìn)一步代謝改造熱帶假絲酵母提高D-乳酸產(chǎn)量提供參考。