化學(xué)發(fā)光免疫分析法在梅毒篩查呈反應(yīng)性無償獻(xiàn)血者歸隊(duì)管理的應(yīng)用

李交 于艷濤 符發(fā)雄 葉偉亮 劉志泉 梁麗雯 朱慧娟 陳永飛 羅嬌娜 歐陽海寧

梅毒是由蒼白螺旋體導(dǎo)致的臨床常見的性傳播疾病。目前，血站系統(tǒng)主要使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測無償獻(xiàn)血者血液中是否存在梅毒螺旋體抗體，實(shí)際應(yīng)用中特異性較差，假陽性過多［1］，會造成合格獻(xiàn)血資源的浪費(fèi)以及假陽性結(jié)果引起的獻(xiàn)血者心理恐慌?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）具有特異性好、敏感性高、方便自動化操作、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于臨床血清學(xué)檢測，但在采供血機(jī)構(gòu)的血液篩查中少用。我站將CLIA應(yīng)用于梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TP-ELISA）篩查呈反應(yīng)性的獻(xiàn)血者歸隊(duì)復(fù)檢檢測，本文初步探討CLIA在無償獻(xiàn)血者歸隊(duì)管理中的適用性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年3月至2020年12月在廣東省佛山市順德區(qū)中心血站應(yīng)用ELISA法篩查陽性的183例梅毒反應(yīng)性無償獻(xiàn)血者的標(biāo)本。其中，男108例，女75例；年齡20～60歲，平均（39.98±9.78）歲。

1.2 試劑與儀器 梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒（ELISA）購自上?？迫A生物工程股份有限公司，梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒（ELISA）購自英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司，梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒（CLIA）購自羅氏公司，梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒（凝集法）購自珠海麗珠試劑股份有限公司。Xantus全自動加樣儀（深圳愛康公司），F(xiàn)AME ELISA全自動檢測分析儀（澳斯邦生物科技有限公司），電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析系統(tǒng)cobas 6000（e 601模塊）（羅氏公司）。

1.3 研究方法 采用兩個(gè)不同生產(chǎn)廠家的梅毒螺旋體感染標(biāo)志物血清學(xué)檢測試劑（ELISA）對所有采集的無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行初次試驗(yàn)檢測，結(jié)果呈反應(yīng)性的標(biāo)本再以同一試驗(yàn)對原血樣做雙孔復(fù)試，若雙孔復(fù)試結(jié)果至少有1種試劑仍為反應(yīng)性，檢測結(jié)論為反應(yīng)性。對ELISA檢測結(jié)論為反應(yīng)性但感染狀態(tài)不確定的獻(xiàn)血者樣本進(jìn)行梅毒螺旋體抗體CLIA檢測。ELISA和CLIA檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本，通過TPPA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確證。所有操作均按儀器和試劑盒說明書進(jìn)行。判斷標(biāo)準(zhǔn)：化學(xué)發(fā)光法，以S/CO值≥1.00判定為陽性，S/CO值＜1.00則判定為陰性；酶聯(lián)法，吸光度≥cutoff值為陽性，吸光度＜cutoff值為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)/百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 共篩查血液標(biāo)本67 852份，檢測結(jié)論為反應(yīng)性（陽性）的標(biāo)本186例，陽性率為0.27%。其中，除3例因標(biāo)本量不足外，另183例標(biāo)本均同時(shí)進(jìn)行CLIA檢測，檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本95例（CLIA檢測陰性結(jié)果、ELISA檢測陽性結(jié)果），再行TPPA確證試驗(yàn)檢測。183例標(biāo)本中，ELISA雙試劑（2個(gè)廠家ELISA試劑）檢測結(jié)論均為陽性結(jié)果的標(biāo)本有87例，ELISA單試劑（1個(gè)廠家ELISA試劑）檢測結(jié)論為陽性結(jié)果的標(biāo)本有96例。

2.2 標(biāo)本檢測情況 血液標(biāo)本采用CLIA法與ELISA法檢測梅毒螺旋體抗體的結(jié)果一致性比較，檢測結(jié)果一致的標(biāo)本有88例，一致率為48.09%（88/183）。87例ELISA雙試劑陽性結(jié)果的標(biāo)本中，CLIA檢測陽性結(jié)果的標(biāo)本83例、陰性結(jié)果的標(biāo)本4例，CLIA和ELISA兩種檢測方法陽性結(jié)果一致率為95.40%（83/87）。96例ELISA單試劑陽性結(jié)果的標(biāo)本中，CLIA檢測陽性結(jié)果的標(biāo)本有5例（4例-英科新創(chuàng)試劑、1例-上?？迫A試劑）、陰性結(jié)果的標(biāo)本91例（24例-英科新創(chuàng)試劑、67例-上?？迫A試劑），兩種檢測方法的陽性結(jié)果一致率為5.21%（5/96）。ELISA檢測反應(yīng)性標(biāo)本中，ELISA雙試劑陽性結(jié)果標(biāo)本和ELISA單試劑陽性結(jié)果標(biāo)本分別與CLIA檢測結(jié)果比較，陽性結(jié)果一致率有顯著差異（χ2=5.55，P=0.018）。兩種檢測方法結(jié)果不一致的95例標(biāo)本，進(jìn)行TPPA確證試驗(yàn)檢測，結(jié)果均為陰性。CLIA與TPPA檢測陰性結(jié)果一致率為100%（95/95），結(jié)果證實(shí)CLIA的假陽性率較低。

2.3 ELISA檢測結(jié)果的S/CO值分布與假陽性率的關(guān)系 ELISA檢測陽性結(jié)果的95例標(biāo)本依據(jù)S/CO值大小對應(yīng)陽性結(jié)果強(qiáng)弱分布（見表2），三組結(jié)果分布例數(shù)兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.34，P＜0.05）。結(jié)果證實(shí)，ELISA檢測陽性結(jié)果的標(biāo)本，其S/CO值越低則假陽性率越高。

表2 ELISA檢測結(jié)果S/CO值分布與假陽性率的關(guān)系

2.4 ELISA檢測陽性結(jié)果的無償獻(xiàn)血者參加血站歸隊(duì)管理情況 化學(xué)發(fā)光法與TPPA結(jié)果均陰性的95名無償獻(xiàn)血者，其中34例主動參加血站無償獻(xiàn)血者的歸隊(duì)檢測（ELISA），占比35.79%。1例ELISA雙試劑陽性結(jié)果的獻(xiàn)血者，再次相同方法歸隊(duì)檢測的結(jié)果為陰性。28例ELISA單試劑陽性結(jié)果的獻(xiàn)血者，再次相同方法歸隊(duì)檢測的結(jié)果均為陰性。見表3。

表3 ELISA檢測陽性結(jié)果的無償獻(xiàn)血者參加血站歸隊(duì)檢測結(jié)果

3 討論

目前，國內(nèi)外診斷梅毒主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室特異性梅毒螺旋體抗體血清學(xué)檢測技術(shù)，主要有ELISA、TPPA、CLIA。其中，ELISA的應(yīng)用最為廣泛，尤其是在采供血機(jī)構(gòu)的血液檢測中；TPPA是現(xiàn)階段對梅毒螺旋體特異性抗體檢測判定的常用確證試驗(yàn)之一；CLIA是臨床篩查梅毒感染研究較多的方法之一［2］，且靈敏度高、正確性高，檢測耗時(shí)短，但采供血機(jī)構(gòu)應(yīng)用較少。本研究將CLIA應(yīng)用于ELISA檢測呈陽性反應(yīng)性的無償獻(xiàn)血者的歸隊(duì)管理。根據(jù)國家衛(wèi)生計(jì)生委統(tǒng)計(jì)，2016年我國梅毒報(bào)告發(fā)病例數(shù)超過43萬，居傳染病第3位，發(fā)病率高達(dá)31.967/10萬。2019年3月至2020年12月我站無償獻(xiàn)血者的梅毒篩查陽性率為0.27%。考慮到無償獻(xiàn)血者為傳染病低危人群，所以更應(yīng)做好血液篩查梅毒呈反應(yīng)性無償獻(xiàn)血者的歸隊(duì)管理工作。

本研究針對梅毒ELISA篩查陽性結(jié)果的無償獻(xiàn)血者標(biāo)本，同時(shí)進(jìn)行CLIA檢測，ELISA雙試劑陽性結(jié)果的標(biāo)本占比95.40%，顯著高于單試劑陽性結(jié)果的標(biāo)本（5.21%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。還將ELISA與CLIA結(jié)果不一致的標(biāo)本進(jìn)一步采用TPPA進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)果全部為陰性，CLIA檢測陰性結(jié)果與TPPA確證陰性結(jié)果完全符合，證實(shí)CLIA的假陽性率較低?？梢?，ELISA檢測結(jié)果存在一定比例的假陽性，183例標(biāo)本中占比51.91%（95/183）。95例確證結(jié)果陰性標(biāo)本中有91例為單試劑陽性結(jié)果，可能與我站設(shè)置ELISA臨界值（CUTOFF）灰區(qū)（下調(diào)臨界值）有關(guān)。95例ELISA假陽性結(jié)果中，三組S/CO值的分布也有顯著差異（P＜0.05），還發(fā)現(xiàn)S/CO值越低則假陽性率越高。當(dāng)ELISA結(jié)果S/CO值在1～2區(qū)間時(shí)，標(biāo)本的假陽性率高達(dá)76.84%（73/95）。提示梅毒螺旋體抗體確證陽性結(jié)果的可能性較小，誤淘汰獻(xiàn)血者的機(jī)率較高，而這部分獻(xiàn)血者的歸隊(duì)管理需要重點(diǎn)關(guān)注，血站系統(tǒng)有必要將CLIA應(yīng)用于歸隊(duì)管理中，降低血液篩查結(jié)果的假陽性率。

本研究中95名梅毒螺旋體抗體確證陰性的無償獻(xiàn)血者中，有34人主動參加了我站的無償獻(xiàn)血者歸隊(duì)檢測，占應(yīng)參加歸隊(duì)無償獻(xiàn)血者的35.79%?？梢娺€是有部分無償獻(xiàn)血者熱衷支持無償獻(xiàn)血公益事業(yè)。但在使用TP-ELISA篩查過程中，常有部分無償獻(xiàn)血者的梅毒螺旋體抗體檢測結(jié)果呈陽性反應(yīng)，經(jīng)確證試驗(yàn)卻是陰性［3］，這種假陽性結(jié)果不僅浪費(fèi)血液資源，還造成部分固定無償獻(xiàn)血者的流失，同時(shí)也給無償獻(xiàn)血者生活和心情都帶來一系列負(fù)面影響?，F(xiàn)今血站系統(tǒng)的無償獻(xiàn)血者歸隊(duì)檢測策略是應(yīng)用篩查項(xiàng)目陽性的ELISA試劑雙孔復(fù)檢相應(yīng)的項(xiàng)目。因方法學(xué)不變，仍會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，導(dǎo)致無償獻(xiàn)血者無法獲得合格獻(xiàn)血資格而不能歸隊(duì)。本實(shí)驗(yàn)中有5例無償獻(xiàn)血者歸隊(duì)檢測仍為陽性結(jié)果而無法順利歸隊(duì)，占比（5/34）14.71%。CLIA特異性好，假陽性率低于ELISA，已開始應(yīng)用于醫(yī)院系統(tǒng)臨床感染性疾病的輔助診斷［4］。為了更好的保證每位獻(xiàn)血者的權(quán)利，可以將CLIA應(yīng)用于無償獻(xiàn)血的歸隊(duì)檢測中。

ELISA對梅毒各期均有較高的靈敏度和特異性［5］，操作簡便，且價(jià)格容易接受，但也存在干擾因素多、重復(fù)性差等問題［6］。TPPA因特異性相對較好，甚至可達(dá)99.9%，常用做梅毒螺旋體抗體的確證實(shí)驗(yàn)［7］，但TPPA試劑的價(jià)格昂貴，且操作較為復(fù)雜，檢測耗時(shí)較長，不能夠自動化判定結(jié)果，需要肉眼判斷，另外還較難保存，對操作者具有較高的水平要求，限制其在大規(guī)模篩查標(biāo)本中的應(yīng)用［8-9］。CLIA是酶免疫技術(shù)的新發(fā)展，在梅毒血清學(xué)檢測中具有高靈敏度、高特異性、自動化操作、高通量檢測、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果判斷更加客觀［10］，必要情況下可以補(bǔ)充應(yīng)用TPPA，現(xiàn)在雖已被廣泛用于手術(shù)、輸血前的篩查試驗(yàn)，但尚未在采供血機(jī)構(gòu)中廣泛開展使用。2019版《血站技術(shù)操作規(guī)程》已明確規(guī)定CLIA可用于采供血機(jī)構(gòu)輸血相關(guān)傳染病病原學(xué)標(biāo)志物檢測，說明該方法已經(jīng)獲得供血者篩查通用技術(shù)規(guī)范的認(rèn)可。本研究應(yīng)用CLIA對血站ELISA篩查反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CLIA可應(yīng)用于無償獻(xiàn)血者的歸隊(duì)檢測管理，為其在采供血機(jī)構(gòu)的全面推廣應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。