嗜瓊膠華美菌芳基硫酸酯酶的克隆表達(dá)及在瓊膠脫硫中的初步應(yīng)用?

吳美嫻， 付曉婷??， 劉 振， 毛相朝,2

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 山東 青島 266003； 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266237)

芳基硫酸酯酶(Arylsulfatase, E.C.3.1.6.1)是一類斷裂硫酸酯鍵、生成無(wú)機(jī)硫酸鹽類、參與調(diào)節(jié)代謝的酶，廣泛分布于自然界、細(xì)菌、哺乳動(dòng)物中，結(jié)構(gòu)較為保守[1]。目前已報(bào)道的芳基硫酸酯酶種類繁多，如來(lái)源于Pseudomonasaeruginosa[2]、Kluyveromyceslactis[3]、FusariumproliferatumLE1[4]及來(lái)源于人的芳基硫酸酯酶[5]，其在土壤環(huán)境評(píng)價(jià)、水治理、醫(yī)學(xué)方面都有應(yīng)用價(jià)值，具有較好的發(fā)展前景。

瓊膠是紅藻類細(xì)胞壁的主要組成成分，常使用江蘺、石花菜、紫菜等作為原料來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)。瓊膠具有良好的凝膠性及穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、科學(xué)等領(lǐng)域。瓊膠品質(zhì)取決于瓊膠的凝膠強(qiáng)度，而瓊膠的凝膠強(qiáng)度取決于其中硫酸基的含量，硫酸基會(huì)在瓊膠凝膠形成的過(guò)程中阻礙分子交聯(lián)，降低瓊膠的凝膠強(qiáng)度，因此脫除硫酸基對(duì)改善瓊膠品質(zhì)具有重要意義[6]。目前工業(yè)上多采用堿處理法對(duì)瓊膠上的硫酸基進(jìn)行脫除，但是堿處理法存在反應(yīng)條件劇烈、瓊脂糖產(chǎn)率低、制備出的產(chǎn)品瓊膠色澤差，環(huán)境污染嚴(yán)重等問(wèn)題[7]。

芳基硫酸酯酶的反應(yīng)機(jī)制可應(yīng)用于脫除瓊膠中的硫酸基，相較于堿處理來(lái)說(shuō)酶法脫硫的反應(yīng)條件更加溫和、環(huán)境友好，此外芳基硫酸酯酶還可以脫除堿處理法不能脫除的瓊膠中瓊脂糖前體C4位上的硫酸基，用于制備更高價(jià)值的產(chǎn)品如低電滲的瓊脂糖、色譜樹(shù)脂等[8]。Wang等從Marinomonassp. FW-1中分離純化得到的芳基硫酸酯酶，對(duì)于瓊膠上硫酸基的脫除率為89.61%[9]。Kim等從Sphingomonassp. AS6330中分離純化得到的芳基硫酸酯酶對(duì)于瓊膠上的硫酸基的脫除效果可達(dá)97.7%，這是目前報(bào)道的酶法脫除瓊膠硫酸基的最高脫除率。然而，盡管來(lái)源于Sphingomonassp. AS6330的芳基硫酸酯酶脫硫率很高，但其以瓊膠為底物時(shí)的酶活(3.93 U)僅為以對(duì)硝基苯硫酸酯(p-nitrophenyl sulfate,pNPS)為底物時(shí)酶活(97.2 U)的4%[10]。到目前為止已報(bào)道的芳基硫酸酯酶對(duì)瓊膠的酶活都很低。因此，擴(kuò)大芳基硫酸酯酶基因庫(kù)，尋找以瓊膠為底物時(shí)酶活較高的芳基硫酸酯酶對(duì)推進(jìn)酶法進(jìn)行瓊膠的高效脫硫，將酶法瓊膠脫硫從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模推向產(chǎn)業(yè)化，實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)瓊膠與瓊脂糖的規(guī)?；a(chǎn)具有重要意義。

嗜瓊膠華美菌(Formosaagariphila) KMM 3901可高效降解瓊膠，其基因組含多種蛋白酶及糖苷水解酶，其中糖苷水解酶通常與轉(zhuǎn)運(yùn)因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和硫酸酯酶共同形成獨(dú)特的多糖利用位點(diǎn)，這說(shuō)明硫酸酯酶對(duì)于硫酸化海藻多糖的降解至關(guān)重要[11]。因此，嗜瓊膠華美菌KMM 3901中可能存在有重要價(jià)值的芳基硫酸酯酶。

本研究從嗜瓊膠華美菌KMM 3901基因組中發(fā)掘出一段芳基硫酸酯酶目的基因，并構(gòu)建大腸桿菌工程菌用于異源表達(dá)該芳基硫酸酯酶片段，對(duì)表達(dá)的芳基硫酸酯酶進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，最后探究了其在脫除瓊膠上硫酸基中的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 試劑材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 嗜瓊膠華美菌KMM 3901購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(菌株編號(hào)：1.12423)；大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、表達(dá)載體pET-28a(+)均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 試劑 KOD 高保真酶購(gòu)自日本東洋紡生物科技有限公司；膠回收試劑盒 Gel Extraction Kit (200) 購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；PCR回收試劑盒 Gel Extraction Kit (200) 購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；Taq 聚合酶混合體系 2×Taq Master Mix購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司；快速質(zhì)粒小提試劑盒 TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit 購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；卡那霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；瓊脂粉購(gòu)自福建綠新集團(tuán)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)LB培養(yǎng)基：用電子天平按比例稱取1%蛋白胨、1% NaCl、0.5%酵母粉，加一定蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓盅b，于121 ℃高溫滅菌20 min，取出備用。

(2)ZYP-5052培養(yǎng)基：按比例稱量0.2% 1 mol/L MgSO4，0.5% 酵母粉，1% 蛋白胨，5% 20×P(1 mol/L Na2HPO4，1 mol/L KH2PO4，0.5 mol/L (NH4)2SO4)，加一定蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，分裝，于121 ℃高溫滅菌20 min。在誘導(dǎo)目的菌種表達(dá)時(shí)，還應(yīng)加入2%的已滅菌50×5052母液(25%甘油，2.5%葡萄糖，10% α-半乳糖)。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的發(fā)掘與序列分析 通過(guò)NCBI基因庫(kù)從F.agariphilaKMM 3901中找到一段芳基硫酸酯酶編碼基因ouc-fars6，使用Expasy在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)該序列的蛋白大小，使用SignalP 5.0在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)該序列是否存在信號(hào)肽，使用SMART在線網(wǎng)站對(duì)該序列翻譯的蛋白可能存在的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用TMHMM Server v.2.0在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)該序列翻譯的蛋白是否存在跨膜結(jié)構(gòu)域，使用MEGA 6.06軟件制作進(jìn)化樹(shù)，使用clustalx軟件對(duì)該基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并用ESPript 3.0在線網(wǎng)站將多序列比對(duì)結(jié)果輸出。

1.2.2 產(chǎn)芳基硫酸酯酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建 使用2216E海水培養(yǎng)基培養(yǎng)F.agariphilaKMM 3901，利用試劑盒提取菌株基因組。根據(jù)目的基因序列和pET-28a(+)質(zhì)粒圖譜，分別設(shè)計(jì)上下游引物，如表1所示，分別以F.agariphilaKMM 3901和pET-28a(+)質(zhì)粒為模板，用各自上下游引物進(jìn)行目的基因和載體的PCR擴(kuò)增和同源臂的構(gòu)建。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer names and sequences

PCR結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行分離驗(yàn)證，分別用PCR回收試劑盒和膠回收試劑盒回收條帶大小正確的擴(kuò)增目的基因和擴(kuò)增載體。用無(wú)縫拼接試劑盒連接目的基因和載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-OUC-FARS6，并采用熱激法，將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中，經(jīng)抗性平板篩選后，進(jìn)行陽(yáng)性克隆驗(yàn)證及相應(yīng)的序列測(cè)序。

1.2.3 產(chǎn)芳基硫酸酯酶重組質(zhì)粒在E.coliBL21(DE3)中的表達(dá) 用質(zhì)粒提取試劑盒從測(cè)序結(jié)果正確的E.coliDH5α中提取重組質(zhì)粒，重新轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)中，將轉(zhuǎn)化成功的工程菌活化后，接種至ZYP-5052培養(yǎng)基中，20 ℃，220 r/min，培養(yǎng)48 h進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)酵結(jié)束后，4 ℃，8 000 r/min冷凍離心15 min分離菌體和上清液。加入15 mL PBS緩沖液(pH=8.0)，懸浮菌體，超聲破碎30 min后，在4 ℃，12 000 r/min冷凍離心15 min去除不可溶成分，即可得到含目的蛋白的粗酶液。

1.2.4 芳基硫酸酯酶OUC-FARS6的純化 將上述步驟得到的粗酶液用鎳柱進(jìn)行純化，使用含有不同濃度咪唑(10～500 mol/L)PBS緩沖液溶液進(jìn)行蛋白的梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫至無(wú)蛋白洗下。分別收集洗脫后的溶液，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析，并使用超濾濃縮管對(duì)有酶活的洗脫液進(jìn)行濃縮脫鹽，即可得到純酶。

1.2.5 芳基硫酸酯酶OUC-FARS6的酶活測(cè)定 測(cè)定芳基硫酸酯酶酶活的體系為25 μL芳基硫酸酯酶酶液、50 μL 25 mmol/LpNPS溶液以及100 μL 50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液(pH=9.0)，總體積為175 μL。將上述混合溶液置于45 ℃反應(yīng)90 min，最后加入75 μL 1 mol/L NaOH終止反應(yīng)。取200 μL上述反應(yīng)液于96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定410 nm下的吸光值，共3組平行。其反應(yīng)原理是芳基硫酸酯酶可以斷裂pNPS的硫酸酯鍵，釋放對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)，使溶液由無(wú)色變?yōu)辄S色。芳基硫酸酯酶OUC-FARS6酶活單位(U/mg)定義為1 min產(chǎn)生1 μmolpNP所需的酶量。

1.2.6 芳基硫酸酯酶OUC-FARS6的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.2.6.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 將按1.2.4中方法純化后的酶液、pNPS溶液與pH=9.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液混合，分別放置于25、30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃中反應(yīng)90 min，最后加入1 mol/L NaOH終止反應(yīng)，測(cè)定OD410 nm，具體測(cè)定方法如1.2.5中所述。

將上述純化后的酶液與pH=9.0 50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液混合，置于4、25、35、45、50和55 ℃分別孵育0、2、10、24、36、48、60和72 h后，加入底物pNPS溶液后反應(yīng)90 min，最后加入1 mol/L NaOH終止反應(yīng)，測(cè)定OD410 nm，確定該酶在各溫度下的穩(wěn)定性，具體測(cè)定方法如1.2.5中所述。

1.2.6.2 最適pH和pH穩(wěn)定性 將上述純化后的酶液、pNPS溶液分別與pH為3.0～6.0的50 mmol/L檸檬酸緩沖液、pH為6.0～8.0的50 mmol/L PB緩沖液、pH為7.0～9.0的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液及pH為9.0～10.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液混合，置于45 ℃反應(yīng)90 min，最后加入1 mol/L NaOH終止反應(yīng)。測(cè)定OD410 nm，具體測(cè)定方法如1.2.5中所述。

將上述純化后的酶液分別與pH為3.0～6.0的50 mmol/L檸檬酸緩沖液、pH為7.0～8.0的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液及pH為9.0～10.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液混合，置于4 ℃分別孵育0、2、10、24、36、48、60和72 h后，加入底物pNPS溶液后反應(yīng)90 min，最后加入1 mol/L NaOH終止反應(yīng)，測(cè)定OD410 nm，確定該酶在各個(gè)pH下的穩(wěn)定性，具體測(cè)定方法如1.2.5中所述。

1.2.6.3 金屬離子對(duì)酶活的影響 向原有反應(yīng)體系中加入不同金屬離子Na+(NaCl)、K+(KCl)、Mg2+(MgCl2)、Ni2+(NiCl2)、Mn2+(MnCl2)、Ba2+(BaCl2)、Ca2+(CaCl2)、Zn2+(ZnCl2)、Co2+(CoCl2)、Co2+(CoCl2)、Fe3+(FeCl3)、SDS及Na2EDTA，使其終濃度為1.4和14 mmol/L，具體測(cè)定方法如1.2.5中所述。對(duì)照組為未加金屬離子、SDS及Na2EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)的反應(yīng)體系，探究不同濃度、不同金屬離子條件下酶活的變化。

1.2.6.4 OUC-FARS6酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 用50 mmol/L pH=9.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液配制濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、22.5和25.0 mmol/L的pNPS底物，45 ℃溫育10 min后，分別將10 μL純酶與140 μL上述不同濃度的底物混合，45 ℃下反應(yīng)30 min后，加入100 μL 1 mol/L NaOH終止反應(yīng)，測(cè)定OD410 nm。利用米氏方程將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸擬合，計(jì)算Km和Vmax的值。

1.2.7 芳基硫酸酯酶OUC-FARS6在脫除瓊膠硫酸基上的應(yīng)用 稱取0.2 g瓊脂粉，加入19 mL pH=9.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液形成懸濁液，并加入1 mL純化后(純化方法見(jiàn)1.2.4)的芳基硫酸酯酶OUC-FARS6(0.014 U)，混合完全(總體積為20 mL)，置于磁力攪拌鍋中，于35 ℃分別反應(yīng)6和24 h。反應(yīng)完畢后，置于70 ℃保持30 min終止反應(yīng)。此外還探究了經(jīng)35 ℃孵育10 h后的純酶液與0.2 g瓊脂粉在pH=9.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液中按上述過(guò)程共同反應(yīng)24 h的效果。以上3組反應(yīng)的對(duì)照組為滅活的芳基硫酸酯酶，其他反應(yīng)條件均與實(shí)驗(yàn)組相同。用DNS法和TLC法測(cè)量體系中是否有還原糖生成。將酶解后的瓊脂粉清洗后凍干，用電子天平稱量?jī)龈森傊圪|(zhì)量，并加入10 mL 1 mmol/L HCl形成懸濁液，置于滅菌鍋中115 ℃高溫高壓酸解4 h。結(jié)束后，酸解液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，用離子色譜法測(cè)定溶液中游離硫酸根的含量(由菲優(yōu)特檢測(cè)公司完成)，可得到脫硫后瓊膠上剩余的硫含量。對(duì)照組為未處理的瓊脂粉，其他條件均與實(shí)驗(yàn)組相同，經(jīng)離子色譜法測(cè)定后，可得到瓊膠本身的硫含量，二者結(jié)合即可得到瓊膠脫硫率。取部分作為樣品用于掃描電鏡(SEM)，觀察芳基硫酸酯酶OUC-FARS6脫除瓊膠硫酸基前后瓊膠的微觀變化。同時(shí)進(jìn)行脫硫前后瓊膠的傅里葉紅外變換光譜(FI-IR)測(cè)定，用干燥的溴化鉀與瓊膠樣品粉末一起研磨壓片，波長(zhǎng)400～4 000 cm-1內(nèi)掃描光譜吸收值。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

上傳該酶的氨基酸序列，經(jīng)SignalP 5.0在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)，該序列第1～21個(gè)氨基酸為一段信號(hào)肽，信號(hào)肽在胞內(nèi)異源表達(dá)中無(wú)用，因此在后續(xù)質(zhì)粒構(gòu)建中會(huì)將信號(hào)肽去除。SMART在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果表明該序列確實(shí)存在信號(hào)肽，這與SignalP 5.0預(yù)測(cè)一致，除此之外該序列還存在一個(gè)硫酸酯酶特定功能域，表明該酶屬于硫酸酯酶并具有斷裂硫酸酯鍵的特性。TMHMM Server v.2.0在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果表明該序列不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。使用MEGA 6.06軟件制作的進(jìn)化樹(shù)如圖1a所示，結(jié)果表明OUC-FARS6與已報(bào)道的來(lái)源于Pyrococcusfuriosus[12]的芳基硫酸酯酶處于同一分支。多序列比對(duì)結(jié)果如圖1b所示，結(jié)果表明OUC-FARS6與已報(bào)道芳基硫酸酯酶具有相同的保守氨基酸殘基位點(diǎn)(C/S)-X-(A/P)-X-R-X4-T-G[13]。以上結(jié)果表明，該編碼序列確實(shí)具有芳基硫酸酯酶的序列特征。

(a：OUC-FARS6進(jìn)化樹(shù)分析；b：多序列比對(duì)結(jié)果。WP_097046647.1，來(lái)自Flagellimonas pacifica的芳基硫酸酯酶；WP_034043253.1，來(lái)自Flavira-mulus ichthyoenteri的芳基硫酸酯酶；CDF79639.1，來(lái)自Formosa agariphila KMM 3901的芳基硫酸酯酶；WP_084182146.1，來(lái)自Maribacter ulvicola的芳基硫酸酯酶；WP_126160703.1，來(lái)自Arenibacter aquaticus的芳基硫酸酯酶；WP_084812086.1，來(lái)自Flammeovirga pacificaa的芳基硫酸酯酶。a：Phylogenetic analysis of OUC-FARS6 with other arylsulfatases; b: Results of multiple sequence alignment. WP_097046647.1, arylsulfatase of Flagellimonas pacifica; WP_034043253.1, arylsulfatase of Flaviramulus ichthyoenteri; CDF79639.1, arylsulfatase of Formosa agariphila KMM 3901; WP_084182146.1, arylsulfatase of Maribacter ulvicola; WP_126160703.1, arylsulfatase of Arenibacter aquaticus; WP_084812086.1, arylsulfatase of Flammeovirga pacificaa.)

2.2 產(chǎn)芳基硫酸酯酶OUC-FARS6重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以F.agariphilaKMM 3901基因組和pET-28a(+)質(zhì)粒為模板，利用表1所述上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，去除該芳基硫酸酯酶片段上的信號(hào)肽，用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增出的目的片段和載體進(jìn)行驗(yàn)證純化，如圖2a和圖2b所示，目的基因條帶單一，大小在1 000～2 000 bp之間，載體條帶也單一，大小介于5 000～7 000 bp之間。將目的基因和載體回收后，使用無(wú)縫拼接的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中，之后挑取抗性篩選平板上生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆驗(yàn)證，結(jié)果如圖2c所示，條帶大小正確，且測(cè)序后序列正確，證明該目的基因已成功連接在質(zhì)粒上并轉(zhuǎn)入細(xì)菌體內(nèi)。

(a：目的片段核酸電泳結(jié)果；b：載體核酸電泳結(jié)果；c：陽(yáng)性克隆驗(yàn)證結(jié)果。a: Results of fragment nucleic acid electrophoresis; b: Results of carrier nucleic acid electrophoresis; c: Results of positive clones verification.)

2.3 芳基硫酸酯酶OUC-FARS6的異源表達(dá)及純化

按上述條件發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體，超聲破碎再次離心后，得到的上清液即是芳基硫酸酯酶OUC-FARS6的粗酶液，該粗酶液與pNPS反應(yīng)后會(huì)變黃，證明OUC-FARS6成功表達(dá)且有酶活。破碎后的上清粗酶液通過(guò)鎳柱純化法分離純化目的蛋白，其原理是表達(dá)目的蛋白時(shí)也會(huì)表達(dá)一段His-tag標(biāo)簽蛋白，該蛋白可以與鎳柱結(jié)合，而不同濃度咪唑也可以與鎳柱結(jié)合且結(jié)合親和力不同，從而用不同濃度咪唑可將目的蛋白從鎳柱上洗脫下來(lái)，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的分離純化。收集不同濃度咪唑鎳柱洗脫液，并通過(guò)SDS-PAGE蛋白電泳觀察條帶大小，來(lái)確定目的蛋白的濃度和純度，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)用100 mmol/L以上濃度咪唑洗脫時(shí)，蛋白條帶單一且測(cè)定有酶活，為目的蛋白，分子量大小在63 kDa左右，與Expasy在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)的58.7 kDa相差不大，說(shuō)明該酶可以成功表達(dá)且可以成功純化。經(jīng)超濾濃縮置換后備用，用于測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)。

(M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道1：粗酶液；泳道2：過(guò)Ni柱后的溶液；泳道3：10 mmol/L咪唑洗脫液；泳道4：20 mmol/L咪唑洗脫液；泳道5：50 mmol/L咪唑洗脫液；泳道6：80 mmol/L咪唑洗脫液；泳道7：100 mmol/L咪唑洗脫液；泳道8：200 mmol/L咪唑洗脫液；泳道9：500 mmol/L咪唑洗脫液。M: Molecular mass marker of proteins; Lane 1: Crude enzyme liquid; Lane 2: Through the column penetration fluid; Lane 3: 10 mmol/L imidazole eluent; Lane 4: 20 mmol/L imidazole eluent; Lane 5: 50 mmol/L imidazole eluent; Lane 6: 80 mmol/L imidazole eluent; Lane 7: 100 mmol/L imidazole eluent; Lane 8: 200 mmol/L imidazole eluent; Lane 9: 500 mmol/L imidazole eluent.)

2.4 芳基硫酸酯酶OUC-FARS6的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

2.4.1 最適溫度和溫度對(duì)OUC-FARS6酶活穩(wěn)定性的影響 如圖4a所示，芳基硫酸酯酶以pNPS為底物時(shí)的最適溫度為45 ℃(pH=9.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液，反應(yīng)90 min)，溫度在25～45 ℃時(shí)，酶活會(huì)隨著溫度的升高而逐漸升高，40～45 ℃時(shí)酶活維持在最高酶活的70%以上。之后隨著溫度繼續(xù)升高，酶活會(huì)快速下降，60 ℃及以上溫度，該酶失去活性。該酶在最適pH(pH=9.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液)下溫度對(duì)OUC-FARS6酶活穩(wěn)定性影響如圖4b所示，可知該酶在4和25 ℃時(shí)，以pNPS為底物時(shí)的酶活較為穩(wěn)定，孵育72 h仍存在100%和54%以上酶活。且35 ℃及以下溫度，該酶會(huì)出現(xiàn)酶活上升的趨勢(shì)，35 ℃孵育10 h后酶活可提升2倍多。為了驗(yàn)證是否是緩沖液中Na+對(duì)酶活的影響，分別在pH=9.0的Tris-HCl緩沖液和含1.4 mmol/L NaCl pH=9.0的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液中測(cè)定該酶的溫度穩(wěn)定性，結(jié)果分別如圖4c和4d所示，可知該酶在Tris-HCl緩沖液中也會(huì)出現(xiàn)酶活上升的現(xiàn)象，加了Na+后這種效果并沒(méi)有明顯提升，故酶活的上升應(yīng)該不是緩沖液中Na+的影響。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[14]后發(fā)現(xiàn)，部分酶和芳基硫酸酯酶確實(shí)會(huì)出現(xiàn)與緩沖液孵育后酶活上升現(xiàn)象。

(a：最適溫度的研究；b：在pH=9.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液中的溫度穩(wěn)定性；c：在pH=9.0的50 mmol/L Tris-HCl的緩沖液中的溫度穩(wěn)定性；d：在含1.4 mmol/L NaCl pH=9.0的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液中的溫度穩(wěn)定性。a: Effects of temperature on the activity of OUC-FARS6; b: Temperature stability in Glycine-NaOH buffer at pH=9.0; c: Temperature stability in a Tris-HCl buffer at pH=9.0; d: Temperature stability in a Tris-HCl buffer containing 1.4 mmol/L NaCl at pH=9.0.)

2.4.2 最適pH和pH對(duì)OUC-FARS6酶活穩(wěn)定性的影響 如圖5a所示，芳基硫酸酯酶以pNPS為底物時(shí)的最適pH體系為pH=9.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液，根據(jù)pH對(duì)OUC-FARS6酶活穩(wěn)定性影響(見(jiàn)圖5b)可看出，該酶在中性和堿性條件下(pH為8.0～10.0)穩(wěn)定性很好，孵育72 h后仍能保持90%以上酶活，而在酸性條件下(pH為3.0～6.0)則快速失活。

(a：最適pH的研究；b：不同pH緩沖液對(duì)OUC-FARS6酶活穩(wěn)定性的影響。a: Effects of pH on the activity of OUC-FARS6; b: Effects of pH on the stability of OUC-FARS6 in different pH buffers.)

2.4.3 金屬離子對(duì)酶活的影響 如表2所示，大部分金屬離子在低濃度和高濃度下都對(duì)該酶有強(qiáng)烈的抑制作用，如Ca2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Mn2+。Ba2+和Mg2+在低濃度時(shí)對(duì)該酶活性有稍微弱的抑制作用，隨金屬離子濃度升高，這種抑制作用不斷增強(qiáng)。僅Na+和K+兩種一價(jià)陽(yáng)離子對(duì)該酶的酶活有促進(jìn)作用，在反應(yīng)體系中添加1.4 mmol/L的Na+可以提高62.1%的酶活，而高濃度的Na+對(duì)酶活有抑制作用。而低濃度(1.4 mmol/L)和高濃度(14 mmol/L)的K+都對(duì)該芳基硫酸酯酶的酶活有促進(jìn)作用，但是其促進(jìn)效果不如低濃度Na+。此外，F(xiàn)ARS6的活性可被Na2EDTA抑制，說(shuō)明有金屬離子存在于該酶催化位點(diǎn)附近，Na2EDTA可螯合金屬離子從而進(jìn)一步影響酶活。表面活性劑SDS在低濃度時(shí)可抑制94%的酶活，在高濃度時(shí)可抑制99%以上酶活。

2.4.4 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù) 利用米式方程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，得出該酶的Km值為32.63 μmol/L，Vmax值為9.25 μmol/(L·min)。相比于來(lái)源于Pseudoalteromonascarrageenovora[15]和Sphingomonassp. AS6330[10]的芳基硫酸酯酶的Km值來(lái)說(shuō)(Km值分別為54.9和1 150 μmol/L)，該酶的Km值較小，對(duì)底物pNPS的親和力較好，但是比來(lái)源于Marinomonassp. FW-1[9]的芳基硫酸酯酶的Km值略大(Km值為13.73 μmol/L)。經(jīng)計(jì)算FARS6的比酶活為0.19 U/mg，相比于其他芳基硫酸酯酶來(lái)說(shuō)比酶活偏低[16-17]。

2.5 對(duì)瓊膠的脫硫作用

瓊膠粉末與芳基硫酸酯酶共同攪拌孵育24 h后(溫度為35 ℃、pH=9.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液)，將瓊膠粉末與體系分離、清洗后冷凍干燥，作為SEM和FT-IR的樣品。SEM的結(jié)果如圖6所示，從不同放大倍數(shù)的圖中均可看出，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)芳基硫酸酯酶作用后的樣品內(nèi)部空隙變小，呈現(xiàn)出較好的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)更大的放大倍數(shù)也可以觀察到其表面從光滑變得粗糙。由于OUC-FARS6在35 ℃孵育10 h后酶活會(huì)出現(xiàn)上升的趨勢(shì)，因此也補(bǔ)充了一組先將芳基硫酸酯酶pH=9.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液孵育10 h后再與瓊膠共孵育酶解的實(shí)驗(yàn)組。通過(guò)SEM結(jié)果可以看出，直接酶解組比先孵育再酶解組瓊膠樣品內(nèi)部空隙更小，效果更好，DNS法和TLC法測(cè)定結(jié)果表明，瓊膠經(jīng)OUC-FARS6孵育24 h后未有還原糖產(chǎn)生，因此證明瓊膠微觀結(jié)構(gòu)的變化并不是瓊膠降解，而是因?yàn)榄偰z上硫酸基的脫除。

表2 金屬離子對(duì)酶活的影響Table 2 Effect of metal ions on OUC-FARS6

圖6 經(jīng)芳基硫酸酯酶OUC-FARS6處理后瓊膠的SEM結(jié)果Fig.6 SEM results of agar after treated with OUC-FARS6

查閱文獻(xiàn)[18]得出，850 cm-1處的吸收峰表示4-硫酸基-D-半乳糖C4位上存在硫酸基。由FT-IR的結(jié)果(見(jiàn)圖7)可知，芳基硫酸酯酶酶解瓊膠6 h組和24 h組在850 cm-1處峰值減小，表明OUC-FARS6可用于脫除瓊膠4-硫酸基-D-半乳糖C4位上的硫酸基。但由于所使用的瓊膠原料本身的含硫量較低(0.66%)，同時(shí)加酶量較低，反應(yīng)條件還需優(yōu)化等問(wèn)題，使得峰值變化不是特別明顯，脫除效果有待提升，經(jīng)芳基硫酸酯酶酶解瓊膠24 h后脫硫率僅為15.6%。

圖7 經(jīng)芳基硫酸酯酶處理后瓊膠的FT-IR圖譜Fig.7 FT-IR spectra of agar after treated with OUC-FARS6

3 結(jié)語(yǔ)

本研究通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-OUC-FARS6，并以大腸桿菌為宿主成功異源表達(dá)出來(lái)源于嗜瓊膠華美菌KMM 3901的芳基硫酸酯酶OUC-FARS6。該芳基硫酸酯酶以pNPS為底物時(shí)的最適溫度為45 ℃(pH=9.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液，反應(yīng)90 min)，在4 ℃和常溫下酶活穩(wěn)定。在pH=9.0的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液中酶活最高，在中性和堿性環(huán)境(pH為8.0～10.0)中酶活穩(wěn)定，在酸性條件下(pH為3.0～6.0)則快速失活。大部分金屬離子、SDS和Na2EDTA都可抑制該酶酶活，低濃度的Na+和K+對(duì)酶活有促進(jìn)作用。該酶的Km值為32.63 μmol/L，Vmax值為9.25 μmol/(L·min)，對(duì)底物pNPS的親和力較好。該酶可應(yīng)用于脫除瓊膠的硫酸基，SEM檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)芳基硫酸酯酶孵育后的瓊膠內(nèi)部空隙變小，呈現(xiàn)出較好的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；FT-IR檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)芳基硫酸酯酶孵育后，瓊膠上4-硫酸基-D-半乳糖上C4位硫酸基被脫除，這些都是瓊膠凝膠強(qiáng)度增強(qiáng)的有利條件，能夠提高瓊膠的品質(zhì)和價(jià)值。該酶相對(duì)于之前已經(jīng)報(bào)道的芳基硫酸酯酶來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定性更好，表達(dá)量較高，純化效果更好，可用于制作酶制劑，適合應(yīng)用于酶法脫除瓊膠硫酸基的工業(yè)化生產(chǎn)。但目前仍存在酶活較低、脫硫率不高、以瓊膠為底物時(shí)反應(yīng)溫度低于瓊膠凝固溫度等問(wèn)題，后續(xù)應(yīng)繼續(xù)通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件提高瓊膠脫硫率，通過(guò)更科學(xué)的改造，獲得催化活性與熱穩(wěn)定性均大幅提高的改造酶，將酶法瓊膠脫硫從實(shí)驗(yàn)室推向產(chǎn)業(yè)化。