RNA干擾在鱗翅目昆蟲中的應(yīng)用研究進(jìn)展

張秋朗，劉建宏，徐 進(jìn),2*，葉 輝

RNA干擾在鱗翅目昆蟲中的應(yīng)用研究進(jìn)展

張秋朗1，劉建宏1，徐 進(jìn)1,2*，葉 輝3*

（1. 西南林業(yè)大學(xué) 云南生物多樣性研究院，云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；3. 云南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650091）

鱗翅目（Lepidoptera）是昆蟲綱中的第二大目，現(xiàn)已經(jīng)記載的鱗翅目昆蟲多達(dá)18萬(wàn)個(gè)種。鱗翅目昆蟲中的許多成員是重要的全球性農(nóng)業(yè)害蟲。多數(shù)鱗翅目害蟲具有繁殖快、危害重、抗藥性強(qiáng)及長(zhǎng)距離遷飛等特性，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成巨大威脅。RNA干擾（RNAi）技術(shù)是指通過將目的基因特異性同源雙鏈RNA（dsRNA）導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，引起與其同源的mRNA特異性降解，從而達(dá)成目標(biāo)基因表達(dá)沉默的一種分子技術(shù)。目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于鱗翅目昆蟲的基因功能研究和綠色害蟲防治策略探索，并在近年來(lái)取得了顯著成效和進(jìn)展。基于此，對(duì)RNAi在昆蟲中的作用機(jī)理進(jìn)行了歸納和概括，并重點(diǎn)總結(jié)和探討了近年來(lái)RNAi技術(shù)在鱗翅目昆蟲基因功能研究以及鱗翅目害蟲防治新方法探索方面取得的新進(jìn)展，以期為鱗翅目昆蟲相關(guān)科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。

鱗翅目昆蟲；RNA干擾；基因功能；害蟲防治

鱗翅目（Lepidoptera）是昆蟲綱（Insecta）中的第二大目，現(xiàn)已記載的鱗翅目昆蟲約有18萬(wàn)種，分屬于47個(gè)總科和128個(gè)科[1]。鱗翅目昆蟲包括蛾類（moths）、蝴蝶（butterflies）和弄蝶（skippers）3大類群，但蛾類占了絕大多數(shù)（約90%）。

鱗翅目昆蟲多以幼蟲取食植物，有許多是全球性的重要農(nóng)林業(yè)害蟲，例如棉鈴蟲（）、小菜蛾（）、舞毒蛾（）、煙青蟲（）、玉米螟（）、二化螟（）、甜菜夜蛾（）、斜紋夜蛾（）和草地貪夜蛾（）等。許多鱗翅目害蟲具有寄主范圍廣、繁殖快、危害重、抗藥性強(qiáng)及長(zhǎng)距離遷飛能力等特性，每年對(duì)農(nóng)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。以近年來(lái)正在全世界發(fā)生的重大遷飛性農(nóng)業(yè)害蟲草地貪夜蛾為例，該害蟲原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，主要危害玉米、水稻等糧食作物[2-3]。自2016年開始，該害蟲入侵了非洲、亞洲、大洋洲等60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)[4]，并于2019年初經(jīng)由云南入侵我國(guó)[5]。之后迅速擴(kuò)散至我國(guó)大部分地區(qū)，其中包括長(zhǎng)江流域、黃河流域和東北玉米、小麥等重要糧食作物主產(chǎn)區(qū)[6]。除了長(zhǎng)距離遷飛能力，草地貪夜蛾還具有較強(qiáng)的繁殖能力和抗藥性[7]。在非洲，草地貪夜蛾可造成玉米年產(chǎn)量減少21%～53%，經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)為24.81～61.87億美元[8]。在我國(guó)，草地貪夜蛾每年對(duì)玉米及小麥造成的經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)分別為172.86～521.43億美元[9]及155.71～901.43億美元[10]。另一些鱗翅目昆蟲也能對(duì)倉(cāng)儲(chǔ)糧食造成巨大損失，例如地中海粉螟（，印度谷螟（，粉斑螟（及葡萄干果斑螟（等，是世界性廣泛分布的重要倉(cāng)儲(chǔ)害蟲[11-12]。而一些鱗翅目昆蟲，例如家蠶（和蟲草蝙蝠蛾（，卻是重要的經(jīng)濟(jì)性昆蟲。許多蝶類不僅具有較高的藝術(shù)觀賞價(jià)值，在生物多樣性保護(hù)及全球氣候變化生物效應(yīng)研究領(lǐng)域也有重要價(jià)值。此外，大部分鱗翅目昆蟲的成蟲在植物傳粉方面也起著不可忽視的作用。

Fire等[12]首次在秀麗隱桿線蟲（）中發(fā)現(xiàn)外源性雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）可以引起內(nèi)源同源基因沉默的現(xiàn)象，并將其命名為RNA干擾（RNA interference，RNAi）。自首次發(fā)現(xiàn)，RNAi被證明存在于絕大部分真核生物中，包括原生動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、真菌、藻類和植物[13]。由于其簡(jiǎn)單高效等特性，RNAi自發(fā)現(xiàn)后便迅速成為基因功能研究的強(qiáng)大反向遺傳學(xué)工具[14-16]。與此同時(shí)，RNAi在害蟲防治方面也顯示出巨大的潛力，在這方面的里程碑式進(jìn)展是成功培育了表達(dá)雙鏈RNA的抗病及抗蟲轉(zhuǎn)基因作物[17-18]。當(dāng)前有效目標(biāo)基因的快速鑒定和新型 dsRNA 遞送系統(tǒng)的開發(fā)將有助于進(jìn)一步推進(jìn)基于RNAi技術(shù)的病蟲害防治研究和應(yīng)用。

2002年，Bettencourt等[19]首次將RNAi技術(shù)用于鱗翅目昆蟲刻克羅普斯蠶蛾（）上。到目前為止，已有超過100篇文獻(xiàn)報(bào)道了在鱗翅目昆蟲中成功應(yīng)用RNAi技術(shù)的實(shí)例，這些研究涵蓋了10個(gè)科25種鱗翅目昆蟲（表1～3）?；诖?，本文總結(jié)了RNAi內(nèi)在機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)，并重點(diǎn)總結(jié)和探討了近年來(lái)應(yīng)用RNAi技術(shù)研究鱗翅目昆蟲基因功能以及探索鱗翅目害蟲防治新方法方面取得的新進(jìn)展。

1 RNAi作用機(jī)理

1.1 RNAi相關(guān)小 RNA

小RNA是一類<200 nt（核苷酸）的核糖核酸短鏈，它們一般是非編碼小RNA分子，目前已知3種不同類別的小RNA可觸發(fā)相應(yīng)的RNAi途徑[20]：（1）PIWI interacting RNAs（piRNAs）：?jiǎn)捂淩NA，通常長(zhǎng)度約為23～36 nt單鏈，與PIWI（P-element induced wimpy testis）亞家族蛋白結(jié)合抑制基因轉(zhuǎn)錄過程并維持生殖細(xì)胞中基因組的穩(wěn)定性和完整性，保證正常的配子發(fā)生和生殖過程[18,21]；（2）microRNAs（miRNAs）：為21～24 nt的單鏈RNA，主要調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)[22-23]；（3）small interfering RNAs（siRNAs）：siRNA是dsRNA，通常長(zhǎng)度為19～21 bp，由外源或內(nèi)源的長(zhǎng)dsRNA分子加工而成，分為外源siRNAs（exo-siRNAs）和內(nèi)源siRNAs（endo-siRNAs）。參與生物體抵抗病毒的侵入、抑制轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)展或是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)等機(jī)制[21-22]。

雖然siRNA和miRNA進(jìn)入RNAi途徑的方式不同，但兩者都是dsRNA被核糖核酸酶RNase III（Dicer酶）切割形成的[24]。siRNA和miRNA通過與Argonaut（AGO）家族蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）。

1.2 昆蟲細(xì)胞攝取dsRNA的機(jī)制

在昆蟲中，dsRNA攝取可能存在2種主要機(jī)制：（1）基于SID-1和SID-2蛋白的跨膜通道介導(dǎo)（transmembrane channel-mediated）的dsRNA攝取機(jī)制[25]；在線蟲（）中，SID-1是一種多跨膜蛋白，在線蟲的系統(tǒng)性RNAi（systemic RNAi）過程中起到至關(guān)重要的作用，其功能是形成一個(gè)多聚體將dsRNA被動(dòng)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。SID-2蛋白主要存在于線蟲的腸道組織中，在線蟲的環(huán)境RNAi（environmental RNAi）過程中發(fā)揮作用[25]。SID同源蛋白同樣存在于鱗翅目昆蟲中，例如在家蠶（中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)SID同源蛋白，在甜菜夜蛾（）體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了1個(gè)SID同源蛋白[26]。（2）內(nèi)吞作用介導(dǎo)（endocytosis-mediated）的dsRNA攝取機(jī)制[27]。黑腹果蠅（）中沒有SID同源基因，其dsRNA攝取與囊泡（vesicles）、清除劑受體（scavenger receptors）以及其它直接或間接參與內(nèi)吞作用的蛋白有關(guān)，RNAi 途徑由內(nèi)吞作用介導(dǎo)[27]。

2 外源dsRNA導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)的方法

dsRNA導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)的方法包括微量注射、飼喂、浸泡、電穿孔、病毒轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)基因等（表1～3）。dsRNA導(dǎo)入效率可因方法和物種的不同有很大差異，同一方法用在不同物種也可能產(chǎn)生很大差異[26,28]。

2.1 微量注射法

將適量的dsRNA溶液直接注射到昆蟲胚胎或昆蟲體內(nèi)[29]。顯微注射是將dsRNA導(dǎo)入生物體內(nèi)并進(jìn)入RNAi途徑最直接有效的手段。1998年，Kennerdell和Carthew首次用顯微注射法將黑腹果蠅（）目標(biāo)基因的dsRNA導(dǎo)入到果蠅的胚胎中，從而得到目標(biāo)基因的缺陷型[30]。許多研究已經(jīng)成功地在不同種的鱗翅目昆蟲中成功建立RNAi的微量注射體系（表1）。但是，通過顯微注射在鱗翅目昆蟲中導(dǎo)入dsRNA進(jìn)行RNA干擾的效率相差很大，并不如在其它目的昆蟲中直接[31-32]。此外，dsRNA顯微注射導(dǎo)入法僅適用于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開展，無(wú)法在害蟲防治中應(yīng)用。

2.2 飼喂法

通過取食dsRNA的方式進(jìn)入到生物體內(nèi)并引發(fā)RNAi的過程。Timmon等[33]最早在線蟲（）證明通過取食表達(dá)dsRNA的大腸桿菌可以導(dǎo)致靶基因沉默。在隨后的研究中，無(wú)論是喂食表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)菌還是直接喂食人工合成的dsRNA，基于飼喂dsRNA的RNAi技術(shù)在各種昆蟲類群包括鱗翅目昆蟲中獲得了廣范的應(yīng)用（表2）。相比于微量注射，飼喂是dsRNA引入到昆蟲體內(nèi)的一種更自然的方法，它不僅造成的損傷小，此方法可以應(yīng)用到基于RNAi的害蟲防治中，可將人工合成的dsRNA或表達(dá)dsRNA的細(xì)菌噴灑到植物表面，害蟲通過取食這些植物導(dǎo)致死亡，或害蟲直接取食表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物而引起滯育和死亡（表3）。

2.3 浸泡法

基于浸泡的dsRNA導(dǎo)入方法適用于昆蟲細(xì)胞和組織，以及昆蟲的特定發(fā)育階段，如昆蟲的卵期和新生幼蟲[34]。最早報(bào)告使用浸泡處理導(dǎo)入dsRNA成功進(jìn)行RNAi是在線蟲（）中[35]。浸泡方法也已在鱗翅目昆蟲中得到成功應(yīng)用，包括細(xì)胞[36-37]，卵[38]和幼蟲[39]（表2）。

2.4 轉(zhuǎn)基因

轉(zhuǎn)基因能使昆蟲穩(wěn)定持續(xù)地產(chǎn)生dsRNA，同時(shí)可以傳給下一代，有利于研究基因在昆蟲一生乃至幾代中的功能。最早應(yīng)用于黑腹果蠅（）中，利用GAL4/ UAS轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達(dá)發(fā)夾RNA從而導(dǎo)致目的基因的沉默[40]，隨后在鱗翅目昆蟲家蠶（）中獲得成功應(yīng)用[41]。這種技術(shù)同樣適用于害蟲防治，例如通過釋放攜帶有可以引起雄性或雌性不育的dsRNA的轉(zhuǎn)基因昆蟲到田間，轉(zhuǎn)基因昆蟲與野生昆蟲進(jìn)行交配從而導(dǎo)致野生個(gè)體不育和生殖力下降[42]。

2.5 細(xì)菌介導(dǎo)

即通過飼喂或注射利用重組共生菌表達(dá)的dsRNA完成RNAi，最常用的是利用重組大腸桿菌表達(dá)相關(guān)基因的dsRNA。Tian等[43]最早利用重組大腸桿菌表達(dá)幾丁質(zhì)酶（）基因的dsRNA，甜菜夜蛾（）幼蟲食用表達(dá)dsRNA的菌液后死亡率顯著上升。細(xì)菌介導(dǎo)可以利用活體細(xì)菌表達(dá)dsRNA，也可以通過熱滅活細(xì)菌表達(dá)[44]。使用細(xì)菌表達(dá)的dsRNA比使用試劑盒在體外生產(chǎn)dsRNA更具成本效益，特別是在大規(guī)?；蚬δ芊治龊秃οx防治應(yīng)用中[45]。

2.6 病毒轉(zhuǎn)染

病毒轉(zhuǎn)染原理是將目標(biāo)基因dsRNA通過病毒的侵染復(fù)制途徑導(dǎo)入寄主體內(nèi)進(jìn)行RNAi過程。病毒介導(dǎo)RNAi的研究還不多，該種方法利用病毒的侵染復(fù)制途徑，相較于轉(zhuǎn)基因RNAi無(wú)需建立轉(zhuǎn)基因昆蟲品系，花費(fèi)的時(shí)間更短，去除了轉(zhuǎn)基因昆蟲個(gè)體或者組織的選育過程[46]。

續(xù)表1 應(yīng)用dsRNA微量注射法研究鱗翅目昆蟲基因功能的實(shí)例

續(xù)表1 應(yīng)用dsRNA微量注射法研究鱗翅目昆蟲基因功能的實(shí)例

3 RNAi在鱗翅目昆蟲基因功能分析中的應(yīng)用

RNAi 技術(shù)目前已經(jīng)成為分析鱗翅目昆蟲基因功能廣泛應(yīng)用的工具。應(yīng)用于闡明與鱗翅目昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的調(diào)控基因，為鱗翅目昆蟲發(fā)育、生物學(xué)研究、分子調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)（表1和表2）。

Xiang等[80]通過RNAi研究了家蠶（）節(jié)段性身體發(fā)育過程，發(fā)現(xiàn)同源異型復(fù)合體（homeotic complex，Hox）基因，和是家蠶幼蟲節(jié)足發(fā)育的抑制器。Kontogiannatos等[81]通過RNAi研究玉米秸稈螟（）發(fā)現(xiàn)保幼激素酯酶（juvenile hormone esterase，JHE）是控制昆蟲從幼蟲到成蟲轉(zhuǎn)變的重要調(diào)節(jié)因子。Shukla等[75]研究發(fā)現(xiàn)在柞蠶（）中，的RNAi完全抑制了和基因的表達(dá)，導(dǎo)致不規(guī)則性腺分化現(xiàn)象。前人使用RNAi技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)許多基因在昆蟲胚胎發(fā)育以及卵黃生成素和信息素合成的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。Wang等[82]在棉鈴蟲（）中使用RNAi沉默3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme，HMGR），證實(shí)基因影響棉鈴蟲雌蟲的繁殖能力，有效降低了雌蛾的產(chǎn)卵量，同時(shí)抑制卵黃蛋白原的表達(dá)水平。Kotwica等[83]利用RNAi技術(shù)沉默非洲棉葉蛾（）中的（）基因發(fā)現(xiàn)雄蟲的精子釋放高峰期推遲12 h，證明基因具有調(diào)節(jié)精子晝夜釋放節(jié)律的功能。Li等[84]使用RNAi技術(shù)研究斜紋夜蛾（）的sex-peptide receptor（SPR）基因功能發(fā)現(xiàn)，基因在調(diào)節(jié)雌蛾交配行為和交配后的生理過程中起到重要作用。

表2 其他dsRNA導(dǎo)入方法在鱗翅目昆蟲基因功能研究中的應(yīng)用

4 RNAi在鱗翅目害蟲防治中的應(yīng)用

在RNAi被發(fā)現(xiàn)并開發(fā)出其基因沉默方法后不久，昆蟲學(xué)家就開始研究將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治管理。RNAi可以沉默昆蟲關(guān)鍵基因的表達(dá)導(dǎo)致昆蟲發(fā)育停滯或死亡，使其成為一種有巨大發(fā)展?jié)摿Φ暮οx防治新策略。突破性進(jìn)展是開發(fā)了表達(dá)雙鏈RNA（dsRNA）的轉(zhuǎn)基因玉米，以保護(hù)玉米根系免受鞘翅目昆蟲西方玉米根蟲（）幼蟲的取食造成的傷害[17]。之后Mao等[92]成功獲得能夠特異表達(dá)基因的dsRNA轉(zhuǎn)基因棉花，給鱗翅目害蟲棉鈴蟲（）喂食該轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲幼蟲對(duì)棉酚耐受下降，死亡率明顯增高。目前目標(biāo)基因鑒定速度的加快以及新dsRNA遞送系統(tǒng)的不斷發(fā)掘提高了RNAi技術(shù)在害蟲防治中的使用頻率?；赗NAi技術(shù)的害蟲防治方法已經(jīng)在7科16種鱗翅目害蟲中開展（表3）。

表3 RNAi在鱗翅目害蟲防治中的應(yīng)用

續(xù)表3 RNAi在鱗翅目害蟲防治中的應(yīng)用

4.1 RNAi防治害蟲原理

在害蟲防治中使用RNAi的基本原理是將外源dsRNA導(dǎo)入目標(biāo)昆蟲的體內(nèi)，沉默與昆蟲發(fā)育和存活有重要關(guān)系的關(guān)鍵基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致目標(biāo)害蟲發(fā)育停滯和死亡。外源dsRNA介導(dǎo)的RNAi過程包括4個(gè)步驟：（1）dsRNA通過跨膜通道介導(dǎo)的通路（transmembrane channel-mediated pathway）或內(nèi)吞介導(dǎo)的通路（endocytosis-mediated pathway）進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)；（2）進(jìn)入細(xì)胞的dsRNA被Dicer酶消化成小雙鏈siRNAs；（3）siRNAs解開螺旋、引導(dǎo)鏈被裝載到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）上；（4）該RISC通過引導(dǎo)鏈定向，以引導(dǎo)鏈互補(bǔ)性定位含有特定核苷酸序列的mRNA，然后結(jié)合到這些特定的mRNA序列，并最終阻止這些靶mRNA的翻譯。

4.2 RNAi在鱗翅目害蟲防治中的進(jìn)展

4.2.1 取食dsRNA農(nóng)藥 用人工合成的乙酰膽堿酯酶基因的siRNA滲入到人工飼料中喂食棉鈴蟲（）幼蟲，可導(dǎo)致幼蟲死亡率顯著增高（增加了15％）、幼蟲的生長(zhǎng)受到抑制、蛹質(zhì)量明顯減少、成蟲較容易產(chǎn)生畸形并且繁殖力顯著降低（與對(duì)照相比降低58%～100％，取決于不同的siRNA濃度）[99]。在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中，將siRNA以3 μg/cm2的濃度均勻涂抹在卷心菜葉的一側(cè)上并飼喂小菜蛾（）幼蟲，使幼蟲死亡率顯著升高（增加了65％）[97]。在田間試驗(yàn)中，在噴施了200 μg/mLsiRNA的甘藍(lán)上放養(yǎng)小菜蛾幼蟲，也導(dǎo)致幼蟲死亡率顯著升高（死亡率與對(duì)照相比增加了53.4％）[97]。

4.2.2 表達(dá)dsRNA的細(xì)菌 在鱗翅目昆蟲中首先開發(fā)了重組共生菌表達(dá)dsRNA介導(dǎo)進(jìn)行RNAi效應(yīng)，2009年，Tian等[43]在甜菜夜蛾（）中利用重組大腸桿菌（Escherichia coli）表達(dá)幾丁質(zhì)酶（）基因的dsRNA，飼喂幼蟲表達(dá)dsRNA的菌液進(jìn)行RNAi，導(dǎo)致幼蟲死亡率顯著上升。將表達(dá)基因的熱滅活轉(zhuǎn)基因大腸桿菌飼喂給粘蟲（）幼蟲5 d后，其死亡率約16%[107]。而將表達(dá)基因dsRNA的活體大腸桿菌喂食給粘蟲幼蟲5 d后，導(dǎo)致幼蟲蛻皮受到抑制和40%的幼蟲非正常死亡[108]。喂食小菜蛾（）和棉鈴蟲（）幼蟲表達(dá)dsRNA的活體細(xì)菌直接導(dǎo)致幼蟲蛻皮困難，幼蟲死亡率高達(dá)50%，喂食成蟲使雌蟲的產(chǎn)卵量和卵的孵化率顯著下降[103]。共生菌介導(dǎo)的RNAi在理論上具有雙重特異性，一是dsRNA序列的特異性，二是寄主和共生菌協(xié)同進(jìn)化的特異性。腸道共生菌能夠持續(xù)生產(chǎn)靶向寄主特異基因dsRNA，從而誘導(dǎo)RNAi進(jìn)行。因此，細(xì)菌介導(dǎo)的RNAi效應(yīng)可以通過種群水平傳播或者垂直傳播途徑實(shí)現(xiàn)鱗翅目害蟲的種群的防治[123]。

4.2.3 表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物 可連續(xù)產(chǎn)生足夠dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物被認(rèn)為是RNAi介導(dǎo)害蟲防治的最佳外源dsRNA導(dǎo)入方式。Mamta等[119]最近的一項(xiàng)研究表明，棉鈴蟲（）幼蟲取食表達(dá)幾丁質(zhì)酶基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草和番茄導(dǎo)致幼蟲死亡率顯著增高。Zhang等[118]研究發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲（）幼蟲取食表達(dá)基因的煙草死亡率高到70%。因其高效、便利和低成本的特性，使得表達(dá)dsRNA轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)RNAi體系在未來(lái)農(nóng)業(yè)重要性害蟲和病媒害蟲防治領(lǐng)域中不可或缺，也為綠色環(huán)保的新型植物保護(hù)策略提供了新的思路。

4.2.4 通過表皮滲透介導(dǎo)的RNAi 通過浸泡介導(dǎo)的RNAi體系具有節(jié)省勞力同時(shí)可以應(yīng)用于基因高通量篩選的優(yōu)點(diǎn)，在防治多種農(nóng)業(yè)重要性害蟲中成功應(yīng)用。Wang等[38]將表達(dá)糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶C3的dsRNA噴涂到亞洲玉米螟（）幼蟲體表，使其40%～50%的幼蟲死亡，同時(shí)通過熒光標(biāo)記確認(rèn)dsRNA能夠成功滲透表皮并在體腔內(nèi)傳導(dǎo)。

4.2.5 通過納米粒子介導(dǎo)的RNAi 納米粒子（Nanoparticles，NPs）包含陽(yáng)離子聚合物、肽類、糖類、脂質(zhì)和金屬等大小為1～500 nm的分子。具有穩(wěn)定性、可修飾性、生物降解性和對(duì)環(huán)境安全等特點(diǎn)，不僅可以作為分子載體促進(jìn)dsRNA跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，還可以延緩dsRNA在昆蟲消化系統(tǒng)中被極端PH以及各種核酸酶降解，提高細(xì)胞對(duì)dsRNA的吸收率，顯著提高對(duì)RNAi有耐受性昆蟲的干擾效率，特別是許多鱗翅目昆蟲。Parsons等[112]研發(fā)的含胍陽(yáng)離子聚甲基丙烯酸酯聚合物的納米粒子可以保護(hù)dsRNA免受草地貪夜蛾（）中腸核酸酶和極端PH的降解，提高細(xì)胞對(duì)基因dsRNA的攝入量，得到高效基因敲除的結(jié)果。表達(dá)基因dsRNA單獨(dú)處理甜菜夜蛾（）的死亡率只有16%，而聚合鳥苷酸納米粒子與基因dsRNA混合溶液飼喂使其死亡率增加53%。另外，dsRNA聚合物納米粒子復(fù)合體對(duì)甜菜夜蛾腸液耐受時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30 h[111]。絕大多數(shù)納米粒子具有生物降解和生物相容性的優(yōu)點(diǎn)，因此，通過納米粒子介導(dǎo)的RNAi是一種環(huán)境友好型的害蟲防治措施。

5 小結(jié)與展望

在昆蟲中，RNAi 是一種對(duì)抗外源病毒的天然免疫方式，基于生物體中的這種內(nèi)在機(jī)制而建立的 RNAi 技術(shù)已經(jīng)被廣泛用來(lái)研究多種昆蟲基因的功能。近年的研究結(jié)果表明 RNAi 技術(shù)在抵御害蟲和防治益蟲疾病方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，有可能對(duì)農(nóng)業(yè)有害生物的控制起到巨大的推動(dòng)作用。

RNAi技術(shù)在鱗翅目昆蟲分子生物學(xué)研究及病蟲害防治領(lǐng)域同樣得了到廣泛應(yīng)用并取得了前所未有的進(jìn)展。但是，RNAi技術(shù)在鱗翅目昆蟲中的應(yīng)用同樣存在著一些特別或共性的問題。首先，RNAi通常不能完全阻斷靶基因的表達(dá)，不同靶標(biāo)基因的干擾效果并不相同，不同部位組織的RNAi效率也不一致（表1～3）。其次，由于RNAi機(jī)制在鱗翅目昆蟲中的特殊性，其RNAi效率與其他類群昆蟲相比相對(duì)較低。

RNAi在病蟲害防治應(yīng)用方面也面臨諸多問題，例如dsRNA的導(dǎo)入方法及可靠性和穩(wěn)定性，防治效率與成本權(quán)衡問題，脫靶和非靶標(biāo)效應(yīng)問題等。對(duì)于dsRNA施用的穩(wěn)定性問題，目前采用納米材料包埋技術(shù)已經(jīng)得到了較好的解決，但在成本控制方面又引入了新問題。目前認(rèn)為較為可行并極具應(yīng)用潛力的技術(shù)是細(xì)菌介導(dǎo)的RNAi及表達(dá)靶基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因作物，然而兩者由于涉及細(xì)菌載體及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可能存在生物安全問題，因此在應(yīng)用上也存在諸多限制。此外，由于昆蟲多具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗藥性快速進(jìn)化能力，許多害蟲已經(jīng)對(duì)一些抗性轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生抗性[7,124-125]。

盡管RNA干擾技術(shù)的效率和應(yīng)用受到各種因素的制約，但不能否認(rèn)該技術(shù)已經(jīng)成為研究昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育、生理和分子過程中強(qiáng)有力的科研工具。由于其環(huán)境友好、安全以及對(duì)非靶標(biāo)昆蟲影響小等優(yōu)點(diǎn)，RNAi在害蟲綠色防控方面也顯現(xiàn)了巨大潛力。未來(lái)，隨著該領(lǐng)域的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，RNAi技術(shù)仍將在基因功能等分子生物學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，并將進(jìn)一步推進(jìn)基于RNAi技術(shù)的害蟲防治新策略的探索及應(yīng)用。

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The Mechanism and Application of RNA Interference in Lepidopteran Insects

ZHANG Qiulang1, LIU Jianhong1, XU Jin1,2*, YE Hui3*

(1. Yunnan Academy of Biodiversity, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2. Key Laboratory of Ministry of Education for Forest Resources Conservation and Utilization in the Southwest Mountains of China, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 3. School of Ecology and Environment, Yunnan University, Kunming 650091, China)

Lepidoptera is the second largest order in the class of Insecta. About 180 000 species of Lepidoptera have been recorded so far. Lepidopteran insects mostly feed on plants, and many of its members are important global agricultural pests. Many Lepidopteran pests have the characteristics of rapid reproduction, heavy damage, strong resistance to pesticides and long-distance migration, which pose a huge threat to agricultural production. RNA interference (RNAi) technology refers to a molecular technology that introduces target gene-specific homologous double-stranded RNA (dsRNA) into cells to cause specific degradation of the homologous mRNA, thereby achieving target gene expression silencing. At present, this technology has been widely used in the study of the gene function of Lepidopteran insects and the exploration of green pest control strategies, which has achieved remarkable progress in recent years. Based on this, this article summarized the mechanism of RNAi in insects, and then reviewed and discussed the recent progress on gene function study and control strategy exploration in Lepidopteran insects by using RNAi techniques, which may contribute to scientific research and pest management related to Lepidopteran insects.

Lepidoptera; RNA interference; gene function; pest control

Q965

A

2095-3704（2021）04-0363-16

張秋朗, 劉建宏, 徐進(jìn), 等. RNA干擾在鱗翅目昆蟲中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2021, 44(4): 363-378.

2021-10-19

2021-11-08

云南省重點(diǎn)領(lǐng)域科技計(jì)劃項(xiàng)目（202001BB050002）、云南省農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（2018FG001-002）和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31760635）

張秋朗（1996—），女，碩士生，主要從事農(nóng)林昆蟲學(xué)研究，qiulangzhang@126.com；

通信作者：徐進(jìn)，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，xujin2798@126.com；葉輝，教授，博士，博士生導(dǎo)師，huiye196@163.com。