昆蟲金屬硫蛋白的研究進(jìn)展

張佳麗，周小草，羅 妹，魏洪義

昆蟲金屬硫蛋白的研究進(jìn)展

張佳麗，周小草，羅 妹，魏洪義*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 江西 南昌 330045）

金屬硫蛋白（metallothioneins, MT）具有清除自由基、調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微量元素濃度、參與重金屬的解毒等作用。介紹了MT生物學(xué)特性、表達(dá)調(diào)控生理功能，并對已發(fā)表的昆蟲MT氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過分析發(fā)現(xiàn)昆蟲MT結(jié)構(gòu)保守，序列較短，同一物種不同MT之間同源性低，分類系統(tǒng)不夠完善。討論了昆蟲MT研究的難點和不足，并展望了昆蟲MT解毒的應(yīng)用前景。

金屬硫蛋白；表達(dá)調(diào)控；分子特性

1957年，美國學(xué)者M(jìn)argoshes等[1]首次從馬腎皮質(zhì)中分離出一種鎘蛋白；隨后，K?gi等[2]再從馬腎皮質(zhì)中分離和鑒定一種蛋白質(zhì)，其每克干質(zhì)量蛋白質(zhì)包含鎘2.9％、鋅0.6％和硫4.1％，并將其命名為“metallothionein”（MT，金屬硫蛋白）。之后，MT相繼從其它動物和人的腎臟及其它組織中分離出來，而MT的分子特性已成為近十多年來的研究熱點。

昆蟲是自然界種類最多、數(shù)量最大、分布最廣的動物，最容易接觸到重金屬。對昆蟲MT的研究能更深入地了解昆蟲在受到重金屬脅迫下的響應(yīng)機(jī)制，為研究其它動物對重金屬的解毒和排毒作用提供參考。

1 MT概述

1.1 MT的分類

MT一般可根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)分為三大類：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型MT[3]。Ⅰ型MT包括哺乳動物的各種MT，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同，可分為MT-1、MT-2、MT-3和MT-4四大亞型。Ⅱ型MT中半胱氨酸（Cys）的位置與Ⅰ型MT有相似之處，但序列差異較大。Ⅲ型MT主要存在于植物中，是一些具有類似Ⅰ型金屬硫蛋白的含Cys序列結(jié)構(gòu)的化合物和多肽。隨著更多MT序列的獲得，第四屆國際金屬硫蛋白大會上研究者們提出新的分類系統(tǒng)[2]。將MT定義為一個超家族（Superfamily），并引入家族（Family），再進(jìn)一步劃分為亞家族（Subfamily）、亞群（Subgroup）和異構(gòu)型（Isoforms）。其中I類和II類MT進(jìn)一步被分成脊椎動物、軟體動物、甲殼動物、棘皮動物、昆蟲、線蟲、纖毛蟲、真菌Ⅰ-Ⅵ、原核生物和植物等15個家族，第Ⅲ類特殊的MT則單獨列為99家族（Family 99）[4-5]。

1.2 MT的生理功能

1.2.1 清除自由基 MT清除自由基的功能使其在抗衰老、抗氧化壓力及細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用。MT通過清除多余的自由基，發(fā)揮抗氧化、抗輻射作用。研究發(fā)現(xiàn)，MT對接受紫外線輻射的晶狀體上皮細(xì)胞有保護(hù)作用[6]。

1.2.2 參與體內(nèi)微量元素的儲存、運(yùn)輸和代謝 在金屬元素的代謝中，MT具有維護(hù)生物體內(nèi)金屬離子相對穩(wěn)定的作用。MT能調(diào)節(jié)小腸對Cu和Zn等金屬的吸收，對Zn和Cu代謝起著細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)的控制作用[7]。

1.2.3 重金屬解毒 MT是富含Cys的金屬結(jié)合蛋白，其巰基能螯合重金屬形成金屬復(fù)合物，并將之排出體外，從而實現(xiàn)解毒功能[8]。但是MT對重金屬解毒和調(diào)節(jié)作用是有限的，一旦環(huán)境中重金屬元素含量超過這個閾值，該物種就會出現(xiàn)病理狀態(tài)。MT是目前臨床上最理想的生物螯合解毒劑。

1.2.4 參與應(yīng)激反應(yīng) MT可在應(yīng)激保護(hù)方面發(fā)揮作用，如低溫和高溫、藥物中毒、創(chuàng)傷、細(xì)菌感染等，都可促進(jìn)MT的合成。研究證實，MT能提高應(yīng)激生物體的抗氧化酶的活性，從而降低應(yīng)激對細(xì)胞的損傷作用[9]。

1.3 金屬離子對MT的調(diào)控

重金屬鎘可誘導(dǎo)MT的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其主要調(diào)控過程是：鎘與MT轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（metal-responsive transcription factor，MTF-1）結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子識別MT啟動子區(qū)金屬反應(yīng)原件（metal response element，MRE）并與細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)合，啟動基因的轉(zhuǎn)錄[10]。同時，鎘脅迫促使生物體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，介導(dǎo)MT的表達(dá)，此過程可能與MRE有協(xié)同作用[11]。重金屬鎘誘導(dǎo)MT的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，MT大量合成，并與重金屬鎘形成Cd-MT復(fù)合物，同時通過自身疏基還原態(tài)氧化態(tài)的轉(zhuǎn)換來清除由鎘誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧化基（reactive oxygen species，ROS），減輕鎘對生物體的損傷。

2 哺乳動物的MT

哺乳動物的MT-1和MT-2廣泛存在于所有動物組織細(xì)胞中；MT-3主要在動物神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)；MT-4主要在皮膚和上呼吸道表皮細(xì)胞中表達(dá)[12-14]。典型的哺乳動物MT分子量為6 000～7 000 Da，由60～68個氨基酸殘基組成，其中Cys含量為20%～30%，且位置非常保守[15]。MT與金屬離子結(jié)合形成兩個大小相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)域和，彼此單獨呈球形，中間通過氨基酸殘基連接，使整個分子呈啞鈴狀[16]。

3 植物的MT

植物的MT在根、莖、葉、花、果實和種子中的表達(dá)存在組織特異性[17]。Ⅰ亞型MT在根中表達(dá)比較豐富，Ⅱ亞型主要表達(dá)在葉中，Ⅲ亞型MT的RNAs在成熟的肉質(zhì)果或葉中高表達(dá)，Ⅳ亞型MT在發(fā)育著的種子中表達(dá)受到抑制[18-20]。植物MT蛋白兩端富含Cys的區(qū)域相互接近和金屬離子結(jié)合形成一個結(jié)構(gòu)域。目前植物MT有hairpin、Dumbbell和double dumbbell等3種結(jié)合模型[21]。

4 昆蟲的MT

4.1 昆蟲MT的分布

昆蟲體內(nèi)的MT主要存在于消化道，尤其在中腸。經(jīng)解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大約90%的Cd存在于麻蠅幼蟲（）的消化道[22]，而這些Cd主要與蛋白質(zhì)結(jié)合以MT的形式存在。通過109Cd2+放射性原子示蹤試驗，檢測到黑腹果蠅（）幼蟲攝入體內(nèi)的95%以上放射性物質(zhì)分布在幼蟲中腸[23]。

4.2 昆蟲MT的結(jié)構(gòu)

目前，已知昆蟲的MT分子量為5 000 Da左右，編碼45個左右氨基酸，部分昆蟲中含有1%～2%的芳香族氨基酸和組氨酸[24]。果蠅金屬硫蛋白的2個基因MTA和MTB分別編碼40和43個氨基酸，其中僅11個氨基酸殘基是相同的，只有25%的同源性，這顯然不同于哺乳動物[25]。

4.3 昆蟲MT的功能

4.3.1 重金屬解毒 重金屬可誘導(dǎo)昆蟲MT合成，從而保護(hù)機(jī)體免受重金屬毒害。中華稻蝗（）基因沉默后，昆蟲對重金屬的耐受性明顯下降，表明金屬硫蛋白可提高昆蟲對重金屬的耐受性[26]。家蠅（）幼蟲在不同濃度的鎘誘導(dǎo)24 h后，在半致死濃度脅迫下家蠅基因的表達(dá)量顯著高于對照，說明金屬硫蛋白能結(jié)合鎘并將其排出體外[27]。

4.3.2 生物標(biāo)志物 當(dāng)生物體暴露于重金屬時，都能很明顯地監(jiān)測到MT的變化，因此MT可作為監(jiān)測環(huán)境重金屬污染的標(biāo)志物。黑水虻（）MT的表達(dá)量在一定范圍內(nèi)隨著鎘濃度的升高而升高，表明它在廢物處理過程中可能具有作為生物標(biāo)志物監(jiān)測鎘的潛力，可應(yīng)用于環(huán)境污染檢測[28]。

5 昆蟲MT的序列分析研究

5.1 已發(fā)表的昆蟲MT

雖然MT在多種哺乳動物中得到了分離和鑒定，但昆蟲基因的研究僅在少數(shù)種類中有公布，其中以果蠅的MT研究最為深入，其它昆蟲中已鑒定的基因序列均不超過3條，如近期進(jìn)行序列鑒定的直翅目昆蟲中華稻蝗。已經(jīng)發(fā)表的昆蟲MT序列信息見表1（屬以黑腹果蠅為代表）。金屬硫蛋白序列下載自GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）。

表1 已發(fā)表的昆蟲MTs

5.2 昆蟲MT的氨基酸序列比對分析

采用Mega 6.0和Genedoc軟件對這些昆蟲的氨基酸序列進(jìn)行比對，這7種昆蟲Cys含量為25%左右（圖1），大多數(shù)位于保守位點上，說明MT蛋白在昆蟲中高度保守。通過7種昆蟲的MT對比發(fā)現(xiàn)，不同物種的金屬硫蛋白在氨基酸數(shù)量及組成等方面存在差異，Cys的分布和排列方式是非常保守的，多為-C-X-C-（C為半光氨酸，X是除半胱氨酸以外的其他氨基酸），說明Cys對金屬硫蛋白的功能極其重要。

黑腹果蠅Drosophila melanogaster (DmMTA, NP524299; DmMTB, NP524413; DmMTC, NP650882; DmMTD, NP788695; DmMTE, NP001189254); 中華稻蝗Oxya chinensis (OcMT1, AHN91823; OcMT2, AHN91824); 家蠅Musca domestica (MdMT1, ADB44079; MdMT2, AEO50699); 岡比亞按蚊Anopheles gambiae (AgMT1, AAX86006; AgMT2, AAX86007); 搖蚊Chironomus riparius (CrMT, ADZ54163); 姚虻Tabanus yao (TyMT1, ABX80078; TyMT2, ABX80079); 黑水虻Hermetia illucens (HiMT1, MK933779; HiMT2A, MK933780; HiMT2B, MK933781); 環(huán)帶長角長蟲兆Orchesella cincta (OcMT1, AAD10193)。

5.3 昆蟲MTs的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

采用Mega 6.0軟件基于NJ法建立MT分子系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），從進(jìn)化樹上可以看出，黑水虻MT1，黑腹果蠅MTA，中華稻蝗MT1和家蠅MT1聚在一起。中華稻蝗的兩個基因的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，黑腹果蠅中的MTB、MTC、MTD和MTE的進(jìn)化關(guān)系較近。

圖2 昆蟲MTs的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

6 小結(jié)與展望

MT作用廣泛，其重金屬解毒等生物活性功能越來越多的被開發(fā)出來。例如，MT可作為生物標(biāo)志物，水生無脊椎動物和魚暴露于重金屬中時，能很明顯地監(jiān)測到MT的變化[29]，能有效地表征水體中重金屬對生物的影響，多應(yīng)用于環(huán)境污染研究；MT還應(yīng)用于治療疾病、作為向?qū)幬镙d體開發(fā)生物藥劑等，實驗證明心肌缺血再灌注損傷時，金屬硫蛋白2A能發(fā)揮保護(hù)心肌的作用，從臨床研究、動物實驗和體外實驗等多個層面揭示金屬硫蛋白2A在心腦血管疾病中的可能作用[30]。

本文根據(jù)序列同源性和進(jìn)化關(guān)系研究昆蟲MT的分子特征，這種特征研究是基于已有序列歸納的特征，因此，合理的特征分類體系的建立依賴于更多MT序列的獲得。目前已知種類和數(shù)量有限，昆蟲基因序列較短不易克隆；另一方面，MT蛋白分離純化后，其自然活性不易維持，而且可能存在重金屬污染，不適合用于大規(guī)模的產(chǎn)品開發(fā)。昆蟲MT的研究領(lǐng)域主要集中在MT的分離純化、理化特性等方面，對昆蟲MT功能和體外表達(dá)方面的研究并不全面。因此，今后的研究中應(yīng)整合昆蟲的生物學(xué)相關(guān)技術(shù)和方法，從基因、蛋白、以及體外表達(dá)方面進(jìn)行研究，為昆蟲MT的表達(dá)調(diào)控和相互作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提高理論與實驗依據(jù)，最終實現(xiàn)穩(wěn)定的體外表達(dá)并應(yīng)用到實際中。

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Research Progress of Insect Metallothionein

ZHANG Jiali, ZHOU Xiaocao, LUO Mei, WEI Hongyi*

(School of Agronomy Science, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

Metallothioneins (MT) play roles in scavenging free radicals, regulating the concentration of trace elements in organisms, and participating in the detoxification of heavy metals. This article introduced the biological characteristics, expression regulations and physiological functions of MT, and conducted bioinformatic analysis of the published amino acid sequence of insect MT. It was found that insect MT structure was conservative, but the sequence was short, the homology between different MTs of the same species was low, and the classification system was not perfect. The article also discussed the difficulties and shortcomings of insect MT researches, and looked forward to the application prospects of insect MT detoxification.

metallothionein; expression regulation; molecular characteristics

Q965

A

2095-3704（2021）04-0391-06

張佳麗, 周小草, 羅妹, 等. 昆蟲金屬硫蛋白的研究進(jìn)展[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2021, 44(4): 391-396.

2021-11-06

2021-12-13

國家自然科學(xué)基金項目(31760637，31640064)

張佳麗（1996—），女，碩士生, 主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治研究，Zhangjiali622@outlook.com；

通信作者：魏洪義，教授，hywei@jxau.edu.cn。