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    外周血單核細(xì)胞PD- L2 分子在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的應(yīng)用

    2022-01-11 12:41:34柳毓文葛洪亮彭雨薇
    中國當(dāng)代醫(yī)藥 2021年34期
    關(guān)鍵詞:期組活動期配體

    柳毓文 劉 萍 胡 娜 葛洪亮 彭雨薇

    江西省萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,江西萍鄉(xiāng) 337000

    系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)屬于自身免疫性疾病,患者多伴有發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、蝶形紅斑等癥狀,若未得到及時治療,可能會累及多個系統(tǒng),引起多種并發(fā)癥[1-2]。SLE 疾病活動指數(shù)(SLE disease activity index,SLEDAI)為臨床評估 SLE 患者病情嚴(yán)重程度的常用方法, 可將SLE 分為活動期與緩解期,但SLEDAI 容易受評估人主觀意識影響,且評估內(nèi)容較多, 導(dǎo)致其在臨床中應(yīng)用存在一定局限性。而臨床對于不同病情的SLE 患者其治療方法也不盡相同,緩解期患者經(jīng)臨床積極治療后預(yù)后良好,病情容易控制,但活動期患者臨床治療難度較高,且病情復(fù)雜,極易引發(fā)狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN),嚴(yán)重?fù)p傷腎臟功能,影響疾病預(yù)后[3-4]。因此,采取有效的手段積極評估SLE 患者病情具有重要意義。 程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1,PD-L1)、程序性死亡配體-2(programmed death ligand-2,PD-L2)均為程序性死亡受體1(programmed death receptor 1,PD-1)的配體,研究指出,PD-1 與其配體組成的信號途徑具有負(fù)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)作用,且在免疫活化與耐受中具有重要作用[5]。 以往,臨床對PD-1 的配體PD-L1關(guān)注度較高,而有關(guān)PD-1 的另一個配體PD-L2 關(guān)注度較低。 基于此,本研究旨在分析外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的 PD-L2 分子在SLE 中的應(yīng)用價值。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    回顧性分析 2019 年 1 月至 2020 年 1 月萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院收治的 30 例 SLE 患者臨床資料,將SLEDAI[6]評分>5 分的15 例活動期狼瘡性腎炎患者納入活動期組,將SLEDAI 評分≤5 分的15 例緩解期狼瘡患者納入緩解期組,并選取同期于萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院接受治療的10 例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者作為活動期陽性對照病例納入RA 組及接受體檢的10 例健康志愿者納入正常對照組。 活動期組中,男 3 例,女 12 例;年齡 46~74 歲,平均(58.69±2.36)歲;病程 2~6 個月,平均(4.04±0.52)個月;體重指數(shù)(body mass index,BMI) 21~27 kg/m2,平均(22.89±1.25)kg/m2。 緩解期組中,男 5 例,女 10 例;年齡 46~75 歲,平均(58.73±2.08)歲;病程 2~6 個月,平均(4.02±0.55) 個月;BMI I21~27 kg/m2, 平均 (22.92±1.19)kg/m2。RA 組中,男 4 例,女 6 例;年齡 44~72 歲,平均(58.91±2.15)歲;病程 1~5 個月,平均(4.03±0.32)個月;BMI 22~27 kg/m2,平均(23.10±1.06)kg/m2。 正常對照組中,男 6 例,女 4 例;年齡 45~73 歲,平均(59.02±2.10)歲;BMI 21~27kg/m2,平均(22.96±1.20)kg/m2。 納入標(biāo)準(zhǔn):①患者符合《系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷及治療指南》[7]內(nèi)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn),LN:尿蛋白定量>0.5 g/d;②年齡18~75 歲者;③活動期組患者未用過激素和免疫抑制劑或停藥后復(fù)發(fā)。 排除標(biāo)準(zhǔn):①妊娠期或哺乳期婦女;②伴有其他系統(tǒng)性結(jié)締組織病者;③合并腫瘤性疾病者。 四組患者性別、年齡、BMI 比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。 本研究經(jīng)萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.2 方法

    PBMC 的PD-L2 分子表達(dá)水平檢測:①實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR) 檢測 PDL2 分子表達(dá)水平方法如下: 應(yīng)用淋巴細(xì)胞分層液(Ficoll)梯度分離 PBMC,使用 TRIzol 抽提 PBMC 中總 RNA(TaKaRa,大連),Oligo-dT 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后置于-20oC 下備用。 內(nèi)參引物為 β-actin,序列為:正向 5′-ATCTGCCACCACACCTTCTACC-3′; 反向 5′-GATAGCACAGCCTGGATAGCAA3′。 PD-L2 引物序列為:正向 5′-GTCAGATGGAACCCAGGACC-3′;反向5′-TAGGCTCCAGAGGTGAGTCC-3′。 Real-time PCR使用德國QIGEN 公司提供的SYBR,采用PCR 兩步法進(jìn)行試驗,具體為 60℃、30 s,90℃、10 s,45 個循環(huán),結(jié)果應(yīng)用循環(huán)閾值(cycle threshold,CT)表示,基因表達(dá)量為目的基因PD-L2 的CT 值-內(nèi)參引物CT 值得到的△CT。 ②流式細(xì)胞術(shù)檢測PD-L2 分子表達(dá)水平方法如下: 使用流式細(xì)胞術(shù)評估外周血T 細(xì)胞、B 細(xì)胞與PBMC 中 PD-L2 的表達(dá)。 使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline solution,PBS) 對方法①中得到的PBMC 進(jìn)行洗滌, 并制成1×106單細(xì)胞懸液,提取50 μl 單細(xì)胞混懸液與3 μl 德國美天旎公司提供的異硫氰酸熒光素標(biāo)記CD14 抗體及美國BD 公司提供的抗原呈遞細(xì)胞標(biāo)記PD-L2 抗體共孕0.5 h,經(jīng)PBS 洗滌后避光保存待檢,使用美國BD 公司提供的Accuri C6 型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

    1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

    記錄患者PD-L2 分子表達(dá)水平、比較各組PD-L2分子表達(dá)水平、分析SLEDAI 評分與PD-L2 分子表達(dá)水平的相關(guān)性、 及PD-L2 分子對SLE 患者病情活動程度的預(yù)測價值。 ①記錄不同性別、年齡、體重患者PD-L2 分子表達(dá)水平。 ②比較四組患者PD-L2 分子表達(dá)水平。 ③分析SLE 患者SLEDAI 評分與PD-L2分子表達(dá)水平的相關(guān)性。 ④分析PD-L2 分子表達(dá)水平對SLE 患者病情活動程度的預(yù)測價值。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD-t 檢驗;計數(shù)資料用率表示, 組間比較采用 χ2檢驗;SLEDAI 評分與PD-L2 分子表達(dá)水平的相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)性檢驗;繪制受試者工作曲線(receiver operating curve,ROC),得到曲線下面積(area under the curve,AUC),分析PD-L2 分子表達(dá)水平對SLE 患者病情嚴(yán)重程度的預(yù)測價值,以P<0.05 為差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同性別、年齡、體重SLE 患者PD-L2 分子表達(dá)水平的比較

    不同性別、年齡、體重的SLE 患者PD-L2 分子表達(dá)水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表 1)。

    表1 不同性別、年齡、體重SLE 患者PD-L2 分子表達(dá)水平的比較()

    表1 不同性別、年齡、體重SLE 患者PD-L2 分子表達(dá)水平的比較()

    組別 例數(shù) PD-L2 t 值 P 值性別(例)0.6880.497男女8 22 10.26±2.13 10.85±2.06年齡(歲)<60≥60體重(kg/m2)<24≥24 0.9280.361 23 7 11.03±1.89 11.74±1.25 0.1190.906 21 9 10.11±1.76 10.03±1.49

    2.2 四組患者PD-L2 分子表達(dá)水平的比較

    活動期組PD-L2 分子表達(dá)水平高于緩解期組與正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);活動期組PD-L2 分子表達(dá)水平與RA 組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表 2)。

    表2 四組患者PD-L2 分子表達(dá)水平的比較(%,)

    表2 四組患者PD-L2 分子表達(dá)水平的比較(%,)

    與活動期比較,aP<0.05

    組別 例數(shù) PD-L2活動期組緩解期組RA 組正常對照組F 值P 值15 15 10 10 14.02±3.12 9.79±1.02a 17.02±4.36 6.16±1.05a 33.502<0.001

    2.3 SLE 患者SLEDAI 評分與PD-L2 分子表達(dá)水平的相關(guān)性分析

    活動期組患者 SLEDAI 評分為(8.45±2.13)分,緩解期組患者 SLEDAI 評分為(3.01±0.54)分。 經(jīng) Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),SLE 患者SLEDAI 評分與 PDL2 分子表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.946,P=0.000)。

    2.4 PD-L2 分子表達(dá)水平對SLE 患者病情活動程度的預(yù)測價值

    將SLE 患者病情活動程度作為狀態(tài)變量(1=活動期,0=緩解期), 將PD-L2 分子表達(dá)水平作為檢驗變量,繪制 ROC 曲線(圖 1),結(jié)果顯示,PD-L2 分子表達(dá)水平預(yù)測SLE 患者處于活動期的 AUC 為0.820,AUC 的 95%置信區(qū)間為 0.662~0.978, 標(biāo)準(zhǔn)誤為0.081,P 值為 0.003,最佳閾值為12.17%,靈敏度為0.800,特異度為0.800,約登指數(shù)為0.600,具有較高的預(yù)測價值。

    圖1 PD-L2 分子表達(dá)水平對SLE 患者病情活動程度的預(yù)測價值的ROC 曲線圖

    3 討論

    SLE 發(fā)生后可能會累及腎臟、血液、呼吸道、淋巴等臟器與系統(tǒng),以腎臟損傷最為常見,且該疾病發(fā)生與發(fā)展均與免疫功能紊亂有關(guān),并且免疫功能情況與疾病活動情況及器官損傷具有密切聯(lián)系[8]。 而PBMC的PD-L2 分子表達(dá)與免疫功能有關(guān)[9]。

    已有大量研究顯示,SLE 患者 PBMC 中 PD-1、PD-L1 表達(dá)異常,且提出PD-1 受體表達(dá)降低會嚴(yán)重影響機(jī)體免疫耐受功能, 進(jìn)而生成大量自身抗體,而關(guān)于PD-1 另一個配體PD-L2 在SLE 患者中的生物學(xué)功能機(jī)制尚未明確[10-12]。本研究結(jié)果顯示,活動期組PD-L2 分子表達(dá)水平高于緩解期組與正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);活動期組 PD-L2 分子表達(dá)水平與 RA 組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),SLE 患者 SLEDAI 評分與PD-L2 分子表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.946,P=0.000),提示PBMC 的PD-L2 分子表達(dá)水平可能與SLE 患者病情活動程度存在一定關(guān)聯(lián),且表現(xiàn)為正相關(guān)。 分析其原因為,PD-1/PD-L 為CD28/B7 家族重要成員,可通過抑制T 細(xì)胞活化與增殖發(fā)揮調(diào)控免疫應(yīng)答作用,而近年來,也有研究指出其對T 細(xì)胞活化也具有一定作用[13-14]。已有研究發(fā)現(xiàn),一系列正性與負(fù)性刺激信號共同介導(dǎo)了T 細(xì)胞活化, 而PD-L2 分子是一種重要的負(fù)性共刺激分子,故其對T 細(xì)胞活化也可能具有一定作用[15-16]。 根據(jù)上述研究結(jié)果,本研究推測,PD-L2 分子高表達(dá)可能是SLE 患者病情嚴(yán)重程度的預(yù)測因子。為證實(shí)這一推測,最后繪制ROC 曲線,結(jié)果顯示,PD-L2 分子表達(dá)水平預(yù)測SLE 患者處于活動期的AUC 為0.820,具有較高的預(yù)測價值,表明PD-L2 可作為SLE 患者病情嚴(yán)重程度的預(yù)測因子。 鑒于本研究樣本量較少,若條件允許,后期工作可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本來以證實(shí)本研究結(jié)果,此工作可能為探索PD-L2分子生物學(xué)功能, 為研究SLE 發(fā)病機(jī)制及預(yù)后評估中提供參考依據(jù)。

    綜上所述,PBMC 的PD-L2 分子表達(dá)水平與SLE患者病情活動程度密切相關(guān),臨床可通過檢測PBMC的PD-L2 分子表達(dá)水平及時評估SLE 患者病情狀況,以制定有效的治療方案。

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