延邊牛UCP1基因CDS區(qū)克隆、生物信息學(xué)分析及組織mRNA表達(dá)

孫 斌，唐 琳，張軍芳，孫建富，崔 巖，王 英，王恩澤，李 強，李香子

(延邊大學(xué)，東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，吉林省肉?？茖W(xué)與產(chǎn)業(yè)技術(shù)重大需求協(xié)同創(chuàng)新中心，吉林 延吉 133002)

延邊牛屬寒溫帶山區(qū)的役肉兼用品種，適應(yīng)性較強。在延邊等地溫度極低的冬季，延邊牛同樣可正常生產(chǎn)、生存，且體現(xiàn)出遺傳穩(wěn)定性與較高生產(chǎn)性能。在-26 ℃時才出現(xiàn)明顯的不安[1]，但依然能保持正常食欲和反芻，因此，延邊牛既是我國東北部寶貴的抗寒品種又是研究大型哺乳動物抗寒不可多得的優(yōu)秀模型。

恒溫動物面臨的一個重要挑戰(zhàn)是在冷應(yīng)激期間對產(chǎn)熱的需求增加。當(dāng)保溫機制(例如蜷縮行為、血管收縮、立毛)不足以抵抗外界溫度過低時，則機體需要通過震顫和非震顫產(chǎn)熱機制來維持恒定的體溫。然而持續(xù)震顫產(chǎn)熱會影響到動物的運動、睡眠反而會出現(xiàn)適得其反的效果，出生于寒冷環(huán)境的動物肌肉沒有充分發(fā)育，無法有效地通過震顫產(chǎn)熱[2]，所以處于寒冷環(huán)境中的哺乳動物震顫產(chǎn)熱逐漸被非震顫產(chǎn)熱所替代。眾所周知，棕色脂肪是非震顫產(chǎn)熱的主要部位，通過其產(chǎn)熱可以維持機體核心體溫、促進在冬眠中動物的蘇醒。棕色脂肪產(chǎn)熱受中樞神經(jīng)所控制，其機理是中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放去腎上腺素以激活β-腎上腺受體和細(xì)胞內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)信號，從而增加線粒體底物的供應(yīng)和呼吸能力，使機體內(nèi)的甘油三酯分解為游離的脂肪酸并作為線粒體氧化的燃料，同時誘導(dǎo)解偶聯(lián)蛋白-1的活性。在棕色脂肪線粒體中，豐富的UCP1活性加速了高氧化能力，這是發(fā)熱過程的核心[3]。解偶聯(lián)蛋白是位于線粒體內(nèi)膜上的蛋白質(zhì)家族的成員，這些蛋白質(zhì)與能量消耗、生熱、游離脂肪酸的調(diào)節(jié)和活性氧的減少有關(guān)[4]。UCP屬于一類線粒體內(nèi)膜(IMM)蛋白，在其作用下，IMM兩側(cè)可無跨膜質(zhì)子濃度差，下調(diào)由質(zhì)子濃度差介導(dǎo)的氧化磷酸化(OXPHOS)速度，對三磷酸腺苷(ATP)的生成造成干擾，UCP釋放效能的本質(zhì)在于解除局部正常呼吸鏈內(nèi)應(yīng)有的電子傳遞和磷酸化雙方的偶聯(lián)性，導(dǎo)致OXPHOS過程呈空轉(zhuǎn)狀態(tài)[5]。根據(jù)其功能分為：UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5[6]。解偶聯(lián)蛋白-1(Uncoupling protein-1,UCP1以前稱為Thermogenin)是線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運離子載體，由于UCP1在非顫動產(chǎn)熱(NST)中的作用而被稱之為熱生成素。大多數(shù)研究認(rèn)為，UCP1基因主要在脂肪組織中表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)線粒體通過UCP1蛋白的激活從而使能量代謝增加，該蛋白將質(zhì)子原動力作為熱量散發(fā)。作為一種解偶聯(lián)蛋白，UCP1在長鏈脂肪酸(FA)的存在下通過線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運H+，這使棕色脂肪線粒體產(chǎn)生熱量[7]。延邊牛在抗寒適應(yīng)性上有著較好表現(xiàn)，現(xiàn)今還未明確UCP1參與延邊牛體溫調(diào)節(jié)與否。

20世紀(jì)70年代David nichollis和Daninel Ricquier 首先發(fā)現(xiàn)了UCP1基因[8]，且成功克隆并定位于4號染色體上，基因大小為13 kb，有6個外顯子，并發(fā)現(xiàn)其在人體內(nèi)主要表達(dá)于棕色脂肪組織內(nèi)。但現(xiàn)今已有學(xué)者證實，部分其他組織內(nèi)同樣表達(dá)UCP1，諸如胰腺、白色脂肪組織、胸腺、縱向平滑肌與骨骼肌[9]；目前，經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)各物種的基因長度、外顯子數(shù)目、編碼區(qū)長度、表達(dá)區(qū)域都有一定的差異，小鼠的UCP1基因位于8號染色體中且長度為8 109 bp、外顯子數(shù)目有6個、CDS區(qū)長度為924 bp。山羊的UCP1位于17號染色體中且基因長度為6 899 bp、外顯子數(shù)目有6個、CDS區(qū)長度為918 bp。在進一步探究UCP1基因下，其基因序列不斷在其他哺乳動物內(nèi)被檢出。研究家畜領(lǐng)域，通過分析牛UCP1基因的多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，(C+G)%的含量水平正向相關(guān)于動物適應(yīng)環(huán)境溫度，可見UCP1和牛抗寒性相關(guān)[10]。因此，本研究以延邊牛皮下脂肪組織為研究對象，克隆測序得到其UCP1的CDS區(qū)序列，同時針對此序列特征開展生物信息學(xué)研究，了解UCP1基因在延邊牛不同組織中的表達(dá)變化，為延邊牛UCP1基因功能分析提供了新的數(shù)據(jù)，可有效指導(dǎo)延邊牛UCP1功能的深入研究。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

于2020年11月，在延邊德海牧場選取3頭為20月齡的雌性延邊牛，借助無菌剪刀逐一提取其心、腿部肌肉、肝、皮下組織、脾、腎與肺作為組織樣品放入冷凍管中，至冷凍管內(nèi)，同時馬上移至液氮內(nèi)，放于實驗室，存儲于冰箱(-80 ℃)內(nèi)。

1.2 主要試劑

核酸裂解液(Life)、GoldView I 型核酸染劑(Solarbio)、pMD18-T(TaKaRa)、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑(TIANGEN)、熒光定量試劑盒(TIANGEN)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、T4DNA Ligase、普通質(zhì)粒提取試劑盒、氨芐青霉素、瓊脂糖、引物(均購自與上海生工)。

1.3 儀器與設(shè)備

干式恒溫器(GL-1800)購自海門其林貝爾儀器制造有限公司，小型臺式冷凍型離心機(5417R)購自Eppendorf公司，超微量分光光度計(NanoDrop 2000)購自Thermo公司，電泳儀(Model 300 V)購自LABNET公司，qRT-PCR儀(Mx3005P)購自Agilent公司，梯度PCR儀(TC-5000)購自TECHNE公司，多功能分子成像系統(tǒng)(型號Azure 600)購自Azure Biosystems公司。

1.4 引物設(shè)計合成

使用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)GenBank中已公布的牛UCP1基因(登錄號：KR711477.1)序列設(shè)計普通PCR(擴增UCP1基因的CDS區(qū))及實時熒光定量PCR引物，將管家基因GAPDH(登錄號NM_001034034.2)當(dāng)作內(nèi)參。表1所示為引物詳情，上海生工負(fù)責(zé)合成引物。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 延邊牛組織總RNA的提取及cDNA的合成

借助TRIzol Reagent試劑盒，同時遵循此試劑盒說明，完成小塊脂肪組織標(biāo)本總RNA的提取，由超微量分光光度計輔助，對此RNA質(zhì)量(OD260/280)完成測定，對與要求相符的總RNA實施逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，存放于-20 ℃環(huán)境中，待用。逆轉(zhuǎn)錄采用天根FastKing一步法試劑盒，反轉(zhuǎn)錄體系為50 μL：Total RNA 5 μL,5×FastKing-RT SuperMIX 10 μL，RNase-free water 35 μL。

1.6 延邊牛UCP1基因CDS區(qū)克隆

將cDNA當(dāng)作模板，通過上述引物(表1)，并借助PCR法，對延邊牛UCP1基因CDS區(qū)實施擴增。設(shè)定0.02 mL的PCR反應(yīng)總體系：cDNA模板(1 μg/μL)、正向引物(10 μmol/L)、負(fù)向引物(10 μmol/L)、2×Taq PCR MasterMixⅡ、RNase-free water 依次為2.0，0.5，0.5，10.0，7.0 μL。以下為擴增步驟：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性0.5 min，58 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35次；72 ℃ 5 min；4 ℃ 1 min。待反應(yīng)結(jié)束，對0.01 mL反應(yīng)產(chǎn)物，開展瓊脂糖凝膠電泳檢測。經(jīng)由瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，完成與預(yù)期大小相符的PCR產(chǎn)物的回收。將回收所得目標(biāo)DNA片段連接pMD18-T載體，制備0.01 mL的連接反應(yīng)體系：目標(biāo)DNA片段4 μL(0.1 μmol/L)，pMD18-T載體1 μL(0.01 μmol/L)，10×T4DNA Ligase Buffer 4 μL，以及1 μL 的T4DNA連接酶于4 ℃下進行一整夜連接，轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞，通過含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基實施涂布，經(jīng)由單菌落開展擴繁，再提取質(zhì)粒，同時PCR鑒定，生工生物(上海)負(fù)責(zé)對鑒定出的陽性質(zhì)粒進行測序。

1.7 延邊牛UCP1基因生物信息學(xué)分析

采用Blast對印度牛(Bosindicus，登錄號：XM_019977126.1)、普通牛(Bostaurus,登錄號：NM_001166528.1)、綿羊(Ovisaries，登錄號：NM_001280694.1)、古猿(Odocoileusvirginianustexanus，登錄號：XM_020891215.1)、美洲草原野牛(Bisonbison，登錄號：XM_010830300.1)、南美羊駝(Vicugnapacos，登錄號：XM_031692232.1)、白犀(Ceratotheriumsimum，登錄號：XM_004426473.1)、東北虎(Pantheratigrisaltaica，登錄號：XM_007091783.2)進行同源性對比分析，針對延邊牛UCP1對應(yīng)序列，借助表2所示在線軟件實施生物信息學(xué)分析。

表2 生物信息學(xué)軟件Tab.2 Bioinformatics software

1.8 延邊牛各組織相對表達(dá)量分析

將GAPDH當(dāng)作內(nèi)參基因，借助qRT-PCR對延邊牛每組織樣品內(nèi)UCP1基因相對表達(dá)水平展開測定，反應(yīng)體系為20 μL：2×SuperReal Premixplus 10 μL，50×Rox Reference Dye 0.3 μL，正向、負(fù)向引物皆為0.6 μL(10 μmol/L)，另有1 μL 的cDNA模板(1 μg/μL)以及7.5 μL 的RNase-free ddH2O。各待檢樣品皆安排3個重復(fù)，以下為反應(yīng)步驟：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 0.5 min，72 ℃ 32 s，循環(huán)35次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。借助2-ΔΔCT法，對所得數(shù)據(jù)開展分析，將脾當(dāng)作對比組織。利用Graphpad軟件對UCP1基因在延邊牛不同組織中的表達(dá)水平進行單因素方差分析(ANOVA)，差異具顯著水平的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

借助超微量分光光度計，對RNA質(zhì)量(OD260/280之比)展開測定，發(fā)現(xiàn)此項指標(biāo)處于1.8～2.0，RNA結(jié)構(gòu)具良好完整性，未見DNA與蛋白污染，能夠參與后續(xù)研究。對PCR擴增產(chǎn)物實施瓊脂糖凝膠(1%)電泳分析，顯示出1條約750 bp的DNA片段(圖1)，在長度上基本相符于預(yù)期DNA片段(長度為749 bp)。

2.2 UCP1基因序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1 序列分析結(jié)果 通過NCBI中Blast對延邊牛UCP1基因CDS區(qū)核苷酸序列與印度牛、普通牛、綿羊、古猿、美洲草原野牛、南美羊駝、白犀、東北虎的基因核苷酸序列進行同源性比對發(fā)現(xiàn)，延邊牛UCP1基因與印度牛的同源性為99.47%、普通牛97.40%、綿羊96.72%、古猿95.56%、美洲草原野牛97.40%、南美羊駝90.11%、白犀90.12%、東北虎88.29%。基于各物種的UCP1基因編碼區(qū)核苷酸(Nt)序列，借助軟件MEGA 7.0完成系統(tǒng)發(fā)育樹的制作，結(jié)果顯示，在親緣關(guān)系上，延邊牛和印度牛親緣關(guān)系最近，和南美羊駝最遠(yuǎn)(圖2)。

2.2.2 UCP1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 借助ProtParam在線工具分析延邊牛UCP1的理化屬性，發(fā)現(xiàn)此蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為27.065 61 ku，理論等電點是8.92，蛋白分子式是C1206H1938N320O350S17，總原子數(shù)為3 831。UCP1基因共編碼249個氨基酸，氨基酸組成如表3所示，其中Val(V)最多，且不含Pyl(O)，氨基酸構(gòu)成為攜負(fù)電殘基(Asp+Glu)、正電殘基(Arg+Lys)的個數(shù)各為19，25個，不穩(wěn)定指數(shù)與消光系數(shù)依次是48.24，13 450，可見，此蛋白缺乏穩(wěn)定性，脂溶系數(shù)是91.53，網(wǎng)狀紅細(xì)胞(RBC)于體外的半衰期是30 h，總平均親水性(GRAVY)等于0.212，可見此蛋白具備一定親水性。

表3 UCP1蛋白的氨基酸組成Tab.3 Composition of amino acid of UCP1

借助在線軟件ProtScale，對延邊牛UCP1的疏水性展開預(yù)測，獲得圖3所示結(jié)果，在UCP1所含氨基酸中，占比較高的為親水性殘基，總體顯示具親水性，此結(jié)果相符于軟件Protparam預(yù)測結(jié)果。

2.2.3 延邊牛UCP1蛋白的磷酸化位點與糖基化位點 在蛋白質(zhì)的功能與活性中，蛋白質(zhì)翻譯后修飾發(fā)揮著十分關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，其中最為廣泛的翻譯后修飾為蛋白質(zhì)的糖基化與磷酸化。借助Net Phos 3.1分析UCP1潛在的磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)UCP1所含磷酸位點總計21個，其中絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)與酪氨酸(Y)依次占11，9，1個(圖4)。分別借助NetNGlyc 1.0與NetOGlyc 4.0，對UCP1潛在的N-糖基化、O-糖基化位點展開分析，發(fā)現(xiàn)O-糖基化位點有4個，所處位置為第5，7，104，241位氨基酸；N-糖基化潛在位點有3個，所處位置為第113，121位氨基酸。

2.2.4 延邊牛UCP1蛋白跨膜區(qū)預(yù)測及信號肽、亞細(xì)胞定位預(yù)測 借助在線軟件TMHMM 2.0Server，對跨膜結(jié)構(gòu)域展開分析，發(fā)現(xiàn)此基因的編碼產(chǎn)物無跨膜螺旋(TMHs)結(jié)構(gòu)，跨膜螺旋氨基酸殘基數(shù)量的預(yù)測值19.008 57，蛋白質(zhì)前60個氨基酸的跨膜螺旋數(shù)預(yù)測值為10.980 09，位于膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的總概率22.995%(圖5)。

利用SignalP 4.1 Server在線軟件進行分析，區(qū)分信號肽和非信號肽臨界值為D=0.450，UCP1預(yù)測D=0.158。參考信號肽假說，判斷UCP1編碼蛋白無信號肽分布，是一類非分泌蛋白(圖6)。

借助TargetP 1.1 Server與PSORT，對UCP1的亞細(xì)胞定位進行分析的結(jié)果顯示，線粒體靶向肽(mTP)占比為0.029%，分泌通路信號位點(SP)占比為0.171%，同時不存在信號肽，故判斷其合成后未出現(xiàn)轉(zhuǎn)運；UCP1的分布以細(xì)胞核為主(表4)。

表4 UCP1蛋白亞細(xì)胞定位Tab.4 Subcellular localization of UCP1 protein

2.2.5 UCP1蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測 借助SOPMA軟件，對UCP1的二級結(jié)構(gòu)展開預(yù)測，該序列主要是由α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角組成的混合型蛋白(圖7)。α-螺旋的氨基酸含量為134個，占比為54.03%；無規(guī)卷曲的氨基酸含量為68個，占比為27.42%；延伸鏈的氨基酸含量為32個，占比為12.90%；β-轉(zhuǎn)角的氨基酸含量為14個，占比為5.65%。利用ExPASy中 Swiss-model平臺構(gòu)建延邊牛UCP1蛋白可能的三級結(jié)構(gòu)模型(圖8)，全局模型質(zhì)量估計值為0.53，與模板相似性為65.45%。

2.3 UCP1基因在延邊牛不同組織間的差異表達(dá)

如圖9所示，對8個組織部位進行UCP1基因表達(dá)水平的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UCP1基因在延邊牛的小腸和脂肪組織中表達(dá)量最高。在脾、腎臟中也有較高的相對表達(dá)量且差異顯著(P<0.05)，腿部肌肉和心臟表達(dá)量相對較低，且無顯著差異(P>0.05)。

3 討論與結(jié)論

解偶聯(lián)蛋白1在棕色脂肪和白色脂肪中[11],它是屬于線粒體陰離子轉(zhuǎn)運蛋白家族的解偶聯(lián)蛋白亞家族中研究最多的載體[12]。UCP1是20世紀(jì)70年代中期在倉鼠、大鼠和豚鼠棕色脂肪的線粒體中發(fā)現(xiàn)的[13]。UCP1被多項研究視為唯一的“真正的”解偶聯(lián)蛋白[14-15]，因為如果在寒冷的環(huán)境下在哺乳動物中上調(diào)其質(zhì)子梯度，則會耗散線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子梯度，從而產(chǎn)生大量熱量。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，UCP1活性在褐色脂肪細(xì)胞中得到很好的調(diào)節(jié)，在寒冷環(huán)境暴露或過量喂養(yǎng)時，UCP1活性被誘導(dǎo)，從而促進了適應(yīng)性生熱作用[16]。Riley等[17]證明了去甲腎上腺素誘導(dǎo)的產(chǎn)熱依賴于UCP1的存在，當(dāng)下丘腦中傳遞冷感時，兒茶酚胺會從交感神經(jīng)系統(tǒng)釋放出來，從而激活褐色脂肪細(xì)胞的腎上腺素受體，進而刺激依賴cAMP的蛋白激酶PKA，從而導(dǎo)致三酰甘油脂肪酶的活化，從而增加脂解作用。經(jīng)由脂解效應(yīng)釋放的游離脂肪酸(FFA)激活UCP1。激活后，UCP1使ATP合成的電化學(xué)質(zhì)子梯度短路，從而刺激電子傳輸并增強呼吸作用?？衫玫牡孜锶紵a(chǎn)生熱量并通過血液循環(huán)散發(fā)到身體的其他部位[18-19]。

本研究以延邊牛皮下脂肪組織為材料成功克隆出UCP1基因，并對其生物信息學(xué)進行分析。結(jié)果顯示，延邊牛UCP1蛋白理化性質(zhì)不穩(wěn)定，且親水性殘基多于疏水性殘基，所以該蛋白是親水性蛋白。參考信號肽假說，判斷UCP1編碼蛋白無信號肽分布，是一類非分泌蛋白。UCP1蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、無規(guī)卷曲構(gòu)成，此相符于其轉(zhuǎn)錄模式。蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTM)過程很復(fù)雜，其中羥基化、磷酸化、泛素化、甲基化與乙?；容^為常見[20]。蛋白質(zhì)PTM是指，在mRNA翻譯后形成蛋白質(zhì)環(huán)節(jié)的一類化學(xué)修飾。具體可理解為，在蛋白質(zhì)合成環(huán)節(jié)，受到修飾酶的作用，部分生化功能性基團(碳水化合物、磷酸基、脂類、乙?；c糖類等)和蛋白質(zhì)骨架(或側(cè)鏈)共價結(jié)合。蛋白質(zhì)PTM可使蛋白質(zhì)的生理活性、成熟度、物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)類型增多，功能更完善、結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、作用更專一、調(diào)控更精準(zhǔn)，對于細(xì)胞活動發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用。經(jīng)預(yù)測延邊牛UCP1蛋白PTM，發(fā)現(xiàn)潛在磷酸化位點有 21個，O端糖基化位點有4個，這些修飾能夠經(jīng)由將新基團連接上特定氨基酸側(cè)鏈途徑，使蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

大部分研究顯示，UCP1在棕色脂肪(BAT)的線粒體內(nèi)特異表達(dá)，為成熟BAT特異性的產(chǎn)熱基因[21]。本試驗通過Real-time PCR定量分析延邊牛不同組織中UCP1基因相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，UCP1基因表達(dá)卻在小腸較多。孫國權(quán)等[22]研究發(fā)現(xiàn)，UCP1基因在西門塔爾牛各組織內(nèi)皆存在表達(dá)，但就表達(dá)水平而言，背膘相較其他組織皆偏高，同時發(fā)現(xiàn)，UCP1與產(chǎn)熱同維持體溫相關(guān)。趙丹等[23]的研究結(jié)果顯示，UCP1基因于牦牛腎內(nèi)表達(dá)水平相較其他組織顯著偏高。說明UCP1基因不僅在不同物種中表達(dá)規(guī)律有所差異，而且在不同品種間表達(dá)規(guī)律也有差異。這可能由于UCP1基因的表達(dá)受能量、動物年齡、暴露溫度、胰島素等因素的影響[24-26]。因現(xiàn)今僅有少量研究涉及延邊牛UCP1基因分析，未找到其確切的功能與調(diào)控機制，需開展更為深入的探究。

此項研究以延邊牛脂肪組織為材料，進行UCP1完整CDS區(qū)的克隆，其呈749 bp大小，編碼氨基酸量為249個，為親水性蛋白，所含磷酸化、O-糖基化、N-糖基化潛在位點的量依次為21，4，3個，無信號肽。預(yù)測UCP1蛋白高級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其屬于混合型蛋白，構(gòu)成以α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈與無規(guī)卷曲為主。RT-PCR結(jié)果表明，延邊牛小腸組織內(nèi)的UCP1基因表達(dá)水平最高，其次為脂肪和脾組織。此研究發(fā)現(xiàn)可為延邊牛UCP1蛋白性質(zhì)與更為深入分析此基因功能給予指導(dǎo)。