山羊Hoxa5基因克隆及表達特性

陳定雙，王瑞龍，林亞秋，王 永，朱江江，李 鑫，張 浩，李艷艷

(1.西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部 四川省重點實驗室，四川 成都 610041；2.西南民族大學 畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041)

同源框基因(Homeobox genes，HOX)最早由McGinnis等[1]在果蠅中鑒定出，之后在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)，該基因是一個轉錄因子超家族。它們被分為幾個類別，其中Ⅰ類同源框基因是39種包含183個核苷酸序列(同源異型盒)的胚胎發(fā)育的轉錄調節(jié)因子，編碼61個氨基酸結構域(同源蛋白)[2]。同源結構域起到轉錄調節(jié)的作用，識別以5′-TATA-3′為核心的DNA序列，調控下游基因的轉錄活性。在哺乳動物中HOX家族的39個基因成簇分布于7，17，12，2號染色體上，構成了4簇并由此命名為HOXA、HOXB、HOXC和HOXD簇[3]。HOX基因與女性生殖道發(fā)育、神經元發(fā)育、急性髓系白血病、造血過程、乳腺癌、肺癌[4-7]等的發(fā)生發(fā)展有關。除此之外，也有研究表明，HOX基因與脂肪發(fā)育有關，例如Hoxa1、Hoxa5、Hoxa10、Hoxc4和Hoxc8存在于棕色脂肪組織中。除Hoxa1和Hoxc4外，這些基因也在白色脂肪組織中表達[8]。

Hoxa5基因屬于HOX基因家族，它位于人類7號染色體HOXA簇的中間位置[3]。人Hoxa5基因編碼含270個氨基酸的ANTP類同源結構域蛋白[9]。該基因廣泛存在于哺乳動物和嚙齒動物中，并被鑒定出在小鼠內臟脂肪組織的表達高于皮下脂肪組織[10-11]。據報道，肥胖患者在接受胰膽分流-十二指腸轉位(BPD-DS)減脂手術后皮下脂肪組織的Hoxa5表達被上調[12]；過表達Hoxa5可促進小鼠前體脂肪細胞的分化[13]；在3T3-L1脂肪細胞中敲低處理Hoxa5會使脂質積累減少[14]；在大鼠斷奶后生長期的運動訓練中顯著提高Hoxa5的表達，Hoxa5很可能在產后早期運動訓練引起的棕色脂肪標志物變化中發(fā)揮作用[15]。目前，該基因在乳腺癌和肺癌的生物學功能研究比較深入，在反芻動物脂肪代謝的研究甚少，且在山羊脂代謝上的研究尚未見報道。

因此，本試驗以簡州大耳羊為研究對象，在克隆山羊Hoxa5基因cDNA序列的基礎上，擬通過在線工具分析山羊Hoxa5基因的生物學特征，并通過實時熒光定量PCR技術分析Hoxa5基因在山羊不同組織和誘導分化不同階段的皮下脂肪細胞中的表達水平，同時構建了pEGFP-Hoxa5融合表達載體轉染山羊皮下脂肪細胞，觀察該基因發(fā)揮生物學功能的具體位置。本研究將為Hoxa5基因生物學功能的進一步研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗動物與組織采集

選用四川省簡陽市大哥大牧業(yè)有限公司種羊場1周歲的健康簡州大耳羊(n=4)作為試驗對象，早晨空腹屠宰后迅速采集其試驗所需的組織，用DEPC水清洗除去血漬后立即用錫箔紙包裹好分裝入凍存管中(材料器材均先經過去RNA酶處理)，置入液氮罐中凍存，帶回實驗室進行后續(xù)試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉錄 利用TRIzol法提取山羊組織總RNA，檢測RNA濃度合格后參考Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，美國)說明書進行反轉錄合成cDNA。cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設計及合成 根據GenBank中牛的Hoxa5基因mRNA序列(登錄號：NM_001077098.1)，利用Primer premier 5設計引物，擴增Hoxa5基因的完整CDS區(qū)序列(本研究所用引物序列見表1)。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

1.2.3Hoxa5基因克隆及測序 以反轉錄得到的山羊皮下脂肪組織cDNA作為目的基因擴增模板，利用RT-PCR法擴增山羊Hoxa5基因。RT-PCR反應總體系(25 μL)為：2×Super Pfx MasterMix 酶12.5 μL(終濃度1×)；上、下游引物各1 μL(10 pmol/μL)；皮下脂肪組織cDNA 1 μL(200～600 ng/μL)；ddH2O 9.5 μL。PCR擴增程序：預變性(98 ℃，3 min)；變性(98 ℃，10 s)，退火(58℃，10 s)，延伸(72 ℃，15 s)，35個循環(huán)；延伸(72 ℃，2 min)，4 ℃保溫。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用DNA回收試劑盒(天根生化科技有限公司，中國)對目的片段進行回收和純化，將純化產物連接至pMD-19T載體，轉化至熱激后的DH5α感受態(tài)細胞，隨后接種到含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取菌落于干凈的EP管中，加入含有Amp的LB液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)4～6 h，進行菌落PCR鑒定后送至成都擎科生物技術有限公司測序。

1.2.4Hoxa5基因的生物信息學分析 使用相應生物信息分析軟件及在線網站對Hoxa5基因進行生物信息學分析，具體生物信息學分析及方法見表2。

表2 序列分析工具及相應分析內容Tab.2 Sequence analysis tools and corresponding analysis content

1.2.5 山羊Hoxa5基因組織表達譜的構建 采用qPCR的方法，檢測Hoxa5基因在山羊心、肝、脾、肺、腎、背、股、臂等10個組織的表達差異，根據克隆所得到的CDS區(qū)基因序列設計特異性引物，以TBP為內參基因矯正基因的相對表達水平[16](引物序列見表1)，qPCR反應體系：10 μmol/L上、下游引物各1 μL ，SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL，總體系為20 μL，每個組織樣本設置3個重復。qPCR反應條件：預變性(95 ℃ 3 min)；變性(95 ℃ 10 s),退火(60 ℃ 10 s),延伸(72 ℃ 15 s)，共38個循環(huán)。

1.2.6 山羊Hoxa5基因時序表達譜的構建 取山羊脂代謝研究實驗室保存的山羊皮下前體脂肪細胞進行復蘇，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細胞傳至F3，將山羊皮下脂肪細胞進行細胞計數并均勻接種于12孔板。當細胞融合度達到80%，將完全培養(yǎng)基更換為油酸誘導液(50 μmol/L)，在0，12，24，36，48，60，72 h收集細胞樣品用于后續(xù)qPCR方法檢測Hoxa5基因在分化過程中的表達情況。qPCR內參為UXT[17]，引物序列見表1，反應條件同1.2.5。

1.2.7 融合表達載體 pEGFP-Hoxa5的構建及轉染 根據克隆成功的Hoxa5序列和pEGFP-N1序列，選擇XhoⅠ和KpnⅠ作為上下游酶切位點并設計亞克隆引物，引物序列見表1。將亞克隆獲得的完整的山羊Hoxa5基因CDS區(qū)序列與pEGFP-N1載體分別進行雙酶切后純化回收，使用T4連接酶將純化后的目的片段與pEGFP-N1載體16 ℃過夜連接，連接產物轉化至DH5α感受態(tài)細胞過夜培養(yǎng)。將陽性菌落擴大培養(yǎng)并提取質粒，對重組質粒進行雙酶切鑒定后送測序。

將F3山羊皮下前體脂肪細胞經計數后均勻接種至24孔板細胞培養(yǎng)板中，待細胞融合度達到80%時，使用脂質體介導法進行轉染，轉染48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察pEGFP-Hoxa5在山羊皮下脂肪細胞亞細胞定位情況。

1.2.8 數據分析 定量PCR數據用2-ΔΔCt法對其CT值進行分析。顯著性檢驗通過SPSS 17軟件中One-way ANOVA分析的Games-Howell檢驗，利用GraphPad Prism 9.0繪制山羊Hoxa5基因的組織表達譜。

2 結果與分析

2.1 山羊Hoxa5基因克隆

以山羊皮下脂肪組織為模板，RT-PCR法進行擴增，用1%的瓊脂糖進行電泳檢測，獲得的條帶與預測的目的片段大小一致(圖1-A)，并測序進一步驗證獲得山羊Hoxa5基因序列。通過使用NCBI中的序列分析工具ORF尋找山羊Hoxa5基因開放閱讀框序列，發(fā)現(xiàn)該基因的編碼區(qū)序列為813 bp，編碼270個氨基酸(圖1-B)。將獲得的序列提交GenBank獲得基因序列登錄號為：MZ004987。通過與牛Hoxa5基因(NM_001077098.1)的編碼區(qū)序列比對發(fā)現(xiàn)該基因有1個突變位點，第444位G>A導致第148位氨基酸Ala>Thr(圖1-C)。

A：M.DL2000 DNA Marker；1.Hoxa5基因；B：星形.絲氨酸磷酸化位點；圓形.蘇氨酸磷酸化位點；三角形.酪氨酸磷酸化位點；實線框.同源結構域；ATG.起始密碼子；TGA.終止密碼子；C：Hoxa5部分核苷酸序列(NM_001077098.1)與本研究推導氨基酸的比較，潛在的多肽位(A444G)顯示在方框中，推導出的氨基酸相應變化。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 Hoxa5一級結構及理化性質的分析 利用ExPASy-ProParam軟件分析Hoxa5一級結構及理化性質，其各種氨基酸含量如圖2-A所示，其中絲氨酸的含量最高(14.4%)，色氨酸和半胱氨酸的含量最低(1.1%)；該蛋白的分子式為C1262H1929N391O399S10，相對分子質量為29.283 ku，等電點為9.42，該蛋白的GRAVY值和不穩(wěn)定系數分別為66.01，-0.864，說明該蛋白是不穩(wěn)定的親水性蛋白。其他理化性質見表3。

A.山羊Hoxa5蛋白的氨基酸組成預測；B.山羊Hoxa5蛋白的亞細胞定位預測；C.山羊Hoxa5蛋白信號肽序列的預測。A.The predicted amino acid composition in Hoxa5 protein of goat；B.The predicted subcellular localization in Hoxa5 protein of goat；C.The predicted signal peptide in Hoxa5 protein of goat.

表3 Hoxa5理化性質分析Tab.3 Analysis of physical and chemical properties of Hoxa5

2.2.2 Hoxa5蛋白的磷酸化位點、跨膜結構、亞細胞定位和信號肽的分析 通過NetPhos-3.1在線軟件對該蛋白的磷酸化位點進行預測，結果表明，該蛋白可能有30個絲氨酸磷酸化位點(Ser)，9個蘇氨酸磷酸化位點(The)和7個酪氨酸磷酸化(Tyr)(圖1-B)?？缒そY構域預測結果顯示，Hoxa5蛋白無跨膜結構域。山羊Hoxa5蛋白序列亞細胞定位的預測結果顯示，該蛋白主要在細胞核內(95.7%)發(fā)揮生物學功能，少部分在細胞質內(4.3%)發(fā)揮生物學功能(圖2-B)。利用Signalp 4.1在線軟件對Hoxa5氨基酸序列進行預測分析，結果表明，Hoxa5是非分泌蛋白，無信號肽(圖2-C)。

2.2.3 Hoxa5蛋白的結構特征及互作蛋白的預測 Conserved Domains結構域預測表明，山羊Hoxa5蛋白具有HOX家族典型的同源結構域(圖3-A)。使用SOPMA預測二級結構顯示，Hoxa5蛋白中無規(guī)卷曲(Random coil)含量最高，占總氨基酸殘基的60.74%，其次是α螺旋(Alpha helix)占總氨基酸殘基的22.96%，延伸鏈(Extended strand)和β轉角(Beta turn)分別占總氨基酸數的11.48%，4.81%(圖3-B)。通過SWISS-MODEL軟件預測建立山羊與其他物種Hoxa5蛋白的空間結構模型，結果表明，山羊Hoxa5蛋白與綿羊、牛和小鼠具有高度相似性(圖4-A)。利用STRING交互式數據庫對山羊Hoxa5的互作蛋白進行預測，結果顯示，山羊HOXA5可能與HOXD4、HOXB6、HOXA6、PBX1等蛋白質間存在相互作用關系，繪制蛋白質相互作用網絡見圖4-B。

2.3 氨基酸序列同源性分析

利用NCBI對不同物種Hoxa5基因所編碼的氨基酸序列進行比對，顯示與綿羊(XP_014950589.2)、牛(NP_001070566.1)、馬(XP_001499628.2)、豬(NP_001182161.1)、黑鼠(XP_032762393.1)、豚鼠(XP_003468003.2)、小鼠(NP_034583.1)及人(NP_061975.2)的Hoxa5氨基酸序列相似性依次為100%，99.63%，99.26%，99.26%，98.89%，98.89%，98.89%和98.15%，說明該基因在不同的物種間具有較高的保守性(圖4-C)。

A.山羊Hoxa5氨基酸序列生物學功能預測；B.Hoxa5氨基酸序列二級結構預測。A.Prediction of biological function of goat Hoxa5 amino acid sequence；B.The predicted secondary structure of the Hoxa5 amino acid sequence.

A.不同物種中Hoxa5蛋白的三級結構；B.山羊Hoxa5蛋白相互作用分析；C.Hoxa5氨基酸同源性比對。A.The tertiary structure of Hoxa5 protein in different species；B.Interaction analysis of Hoxa5 protein in goat；C.Comparison of amino acid homlogy of goat Hoxa5.

2.4 山羊Hoxa5系統(tǒng)進化樹的構建

使用MEGA 5.0軟件比較獲得的山羊Hoxa5氨基酸序列與綿羊、牛、小鼠等動物氨基酸序列的差異，以確定物種間的進化關系，并用NJ法構建進化樹。進化樹結果表明，山羊與綿羊屬于一個單獨的分支，進化關系最近，人與山羊的進化關系最遠(圖5)。

圖5 NJ法構建Hoxa5氨基酸系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree constructed based on Hoxa5 amino acid with Neighbor-joining method

2.5 組織表達譜的鑒定

本研究以TBP為內參基因，通過熒光定量PCR技術檢測Hoxa5基因在山羊不同組織中表達模式，結果顯示，該基因在山羊的各個組織中均存在廣泛表達，其中在腎臟中的表達量顯著高于其他各組織(P<0.05)，該基因在心、肺、股二頭肌、臂三頭肌中也具有較高的表達水平，顯著高于肝、脾和皮下脂肪這3個組織(P<0.05)(圖6)。

1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.腎；6.背最長?。?.股二頭?。?.臂三頭?。?.腹部脂肪；10.皮下脂肪。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖7同。

2.6 時序表達譜的鑒定

為探究Hoxa5基因在山羊皮下前體脂肪細胞分化過程中的表達情況，通過時序表達譜可知，山羊Hoxa5基因在經油酸誘導分化的皮下脂肪細胞中表達量有明顯的變化，在誘導分化后的第60小時表達量上調最為顯著(圖7)。

圖7 山羊Hoxa5基因在皮下前體脂肪細胞分化過程中的相對表達量Fig.7 Relative expression of Hoxa5 gene in goat during subcutaneous adipocyte differention

2.7 融合表達蛋白pEGFP-Hoxa5的亞細胞定位

為了探究該基因在皮下脂肪細胞中發(fā)揮功能的具體位置，在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染48 h后的山羊皮下前體脂肪細胞，發(fā)現(xiàn)轉染pEGFP-N1的皮下脂肪細胞，綠色熒光均勻分布于整個細胞；而在轉染pEGFP-Hoxa5的皮下脂肪細胞中，綠色熒光分布于細胞核(圖中白色箭頭指示處)，細胞質中無綠色熒光分布(圖8)。

圖8 Hoxa5蛋白的亞細胞定位Fig.8 The predicted subcellular localization of Hoxa5 protein in goat

3 討論與結論

同源框(HOX)基因在哺乳動物中具有高度的保守性，它們在發(fā)育中起著核心作用。目前HOX基因的研究主要集中在控制胚胎模式、器官的發(fā)育和癌癥的發(fā)生發(fā)展[18-23]。最近研究指出，HOX家族的Hoxa5與小鼠脂肪組織的發(fā)育及重塑有關，Hoxa5通過激活Fabp4并阻遏PKA/HSL通路來促進小鼠脂肪細胞分化和線粒體生物合成[24]；Hoxa5通過抑制小鼠白色脂肪細胞中的Akt/mTORC1信號通路來增加細胞凋亡[25]，然而對Hoxa5基因在家畜動物脂肪細胞的研究甚少，且對山羊脂肪細胞的作用尚未見報道。

因此，本研究以簡州大耳羊的皮下脂肪組織為模板，以近緣物種牛的Hoxa5基因mRNA序列為參照，設計引物并克隆得到了山羊的Hoxa5基因序列，該基因的編碼區(qū)序列為813 bp，編碼270個氨基酸。Odenwald等[9]通過對小鼠Hoxa5基因克隆分析表明，該基因編碼一種270個氨基酸ANTP類同源結構域蛋白，本研究的結果與此一致。通過與牛Hoxa5基因的編碼區(qū)序列比對發(fā)現(xiàn)，該基因有1個突變位點位于ORF區(qū)，第444位G>A導致第148位氨基酸Ala>Thr，推測突變可能造成Hoxa5蛋白某些功能的改變。該蛋白具有多個磷酸化位點，猜測這些位點可能有助于山羊Hoxa5蛋白質磷酸化的發(fā)生。磷酸化作為蛋白翻譯后修飾的方式之一，涉及各種細胞活動，調節(jié)許多細胞功能，如細胞生長、分化、凋亡[26]，因此，這些磷酸化位點可能是調控山羊Hoxa5蛋白行使功能的重要位點。HOX家族含有特有的結構域，此結構域由180～183個核苷酸構成高度保守的DNA序列，該序列編碼的60～61個氨基酸組成了同源結構域[27-28]。通過Conserved Domains在線工具預測分析發(fā)現(xiàn)山羊Hoxa5核酸與蛋白預測的整體結構與上述一致，因此，該蛋白可通過同源結構域識別并調節(jié)靶基因的轉錄[29]。通過對山羊Hoxa5蛋白進行氨基酸序列多重比對發(fā)現(xiàn)，各種動物間氨基酸序列保守性高，猜測Hoxa5蛋白作為一個具有重要功能的蛋白家族成員之一，在不同物種中具有結構和功能的一致性。進化樹分析表明，山羊與綿羊親緣關系最近，屬于一個單獨的分支，其中人與山羊的進化關系最遠。

Hoxa5基因在人、小鼠上的研究較為深入，在家畜動物上的研究甚少。為了探究該基因是否在山羊各個組織中存在廣泛表達，本試驗采集了山羊的10個組織并構建了山羊Hoxa5基因的組織表達譜，試驗結果表明，Hoxa5基因在所選的組織中均存在廣泛表達，但其mRNA表達水平在各個組織中存在差異。比如Hoxa5在腎中表達水平較高，在脾和皮中表達最低。王艷[30]的研究表明，Hoxa5基因在豬的腎臟和子宮的表達量最高，在肝臟和脂肪中表達量中等，在心臟、脾臟和肌肉中的表達量較低。這與本研究存在相似及差異之處，推測這種不同可能因為該基因在不同物種中具有組織表達差異性。

此外，本研究還檢測了Hoxa5基因在山羊皮下脂肪細胞分化過程中的表達模式，發(fā)現(xiàn)該基因在分化過程中表達水平明顯改變，12～72 h的表達水平高于0 h且在第60小時表達水平達到最大值。因此，推測該基因在山羊皮下脂肪細胞分化中可能發(fā)揮正向調控作用，然而本研究與曹瑋娜[24]在小鼠脂肪細胞上的研究結果存在差異，研究結果表明，Hoxa5基因在小鼠脂肪細胞分化前一天到分化第1天增加，然后隨著分化時間的推移表達量逐漸降低并低于分化前一天，結果的差異可能是因為試驗動物、檢測時間不同所導致的?；谠摶蛟谏窖蚱は轮炯毎械谋磉_模式以及該基因是轉錄因子超家族的成員，推測Hoxa5可能調控山羊皮下脂肪細胞的分化，因此，本研究想進一步確認Hoxa5蛋白在山羊皮下脂肪細胞中發(fā)揮功能的具體位置，通過構建pEGFP-Hoxa5融合蛋白表達載體，轉染山羊皮下脂肪細胞后發(fā)現(xiàn)該蛋白主要定位于細胞核中，這與軟件預測及Odenwald等[9]在小鼠上的研究結果一致，表明Hoax5蛋白主要在細胞核中行使生物學功能。

本研究成功克隆得到包含完整開放閱讀框的山羊Hoxa5基因序列，其中CDS區(qū)為813 bp，共編碼270個氨基酸，該蛋白的分子量為29.283 ku，是不穩(wěn)定的、親水的非分泌蛋白。預測發(fā)現(xiàn)該蛋白具有30個絲氨酸磷酸化位點(Ser)，9個蘇氨酸磷酸化位點(The)和7個酪氨酸磷酸化位點(Tyr)，具有HOX基因典型的同源結構域，高級結構由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲組成。Hoxa5廣泛表達于各個組織，其中在腎中表達最高。亞細胞定位表明，該蛋白主要在細胞核中發(fā)揮生物學功能。本研究結果為今后深入研究Hoxa5基因在山羊脂肪細胞中發(fā)揮的具體生物學功能奠定了基礎。