四倍體水稻蛋白質(zhì)含量和谷蛋白基因表達(dá)研究

隆艷喜，羅雁茹，竺正航，廖芷依，王 蘭

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東省植物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

水稻是我國最主要的糧食作物之一，其播種面積約占總種植面積的30%[1]。隨著生產(chǎn)的發(fā)展、人民生活水平的提高，以及農(nóng)產(chǎn)品對(duì)外貿(mào)易的需要，人們不只是關(guān)注水稻的產(chǎn)量，水稻的品質(zhì)也成為關(guān)注的熱點(diǎn)[2-3]。水稻的品質(zhì)包括淀粉含量、蛋白質(zhì)和氨基酸的含量及組成等[4]。水稻胚乳中的淀粉是通過幾種酶的協(xié)同活性合成的，水稻基因組至少攜帶8個(gè)功能性α-淀粉酶基因[5]。淀粉通常由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，直鏈淀粉含量決定了淀粉的回生和糊化[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，OsNAC20和OsNAC26雙突變可以降低淀粉和貯藏蛋白含量，導(dǎo)致直鏈淀粉含量較低[7-8]。水稻胚乳蛋白位于淀粉體附近，影響淀粉的消化率[9]。水稻種子中的蛋白質(zhì)主要以貯藏蛋白的形式存在于胚乳中，根據(jù)各貯藏蛋白的溶解性不同，分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等4個(gè)組分。清蛋白、球蛋白主要儲(chǔ)存于糊粉層和胚中，醇溶蛋白出現(xiàn)在PB-Ⅰ中，而谷蛋白儲(chǔ)存于胚乳PB-Ⅱ中[10]。PB-Ⅰ和PB-Ⅱ有不同的起源；PB-Ⅰ起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)膜，PB-Ⅱ起源于液泡；這說明水稻醇溶蛋白和谷蛋白的合成場所和形成過程是不同的[11]。在胚乳蛋白中谷蛋白占70%以上，它對(duì)稻米品質(zhì)的優(yōu)劣及營養(yǎng)價(jià)值起著重要作用。就其氨基酸結(jié)構(gòu)而言，大米蛋白質(zhì)是所有其他谷物蛋白質(zhì)中最優(yōu)選的蛋白質(zhì)。谷蛋白富含賴氨酸，其含量在谷物中位居第二，是谷物中的限制性氨基酸[12]。

同源四倍體水稻是由二倍體水稻經(jīng)過染色體組加倍獲得的種質(zhì)，具有生長勢強(qiáng)、生物學(xué)產(chǎn)量高、籽粒大、米質(zhì)好和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，被列為21世紀(jì)水稻育種新戰(zhàn)略之一[2]。同源四倍體水稻胚乳蛋白各組分含量與相應(yīng)的二倍體相比，同源四倍體水稻胚乳蛋白含量大部分呈增加趨勢，各組分分布與其二倍體水稻相一致，即趨同于二倍化[13-14]。因此，基因組多倍化對(duì)同源四倍體水稻重復(fù)基因組進(jìn)化最主要的影響是在蛋白質(zhì)表達(dá)量上的差異，這種差異對(duì)水稻育種有著積極的意義[11]。由于同源四倍體水稻減數(shù)分裂時(shí)期同源染色體聯(lián)會(huì)及分離沒有規(guī)律性，導(dǎo)致同源四倍體水稻育性偏低、結(jié)實(shí)率下降[15]。但在胚乳發(fā)育過程中，同源四倍體水稻及其二倍體原種胚乳發(fā)育的基本過程無差異，發(fā)育進(jìn)程存在差異[16]。同源四倍體的胚乳蛋白隨著基因劑量的增加而增加，主要表現(xiàn)在谷蛋白上，胚乳蛋白亞基無變化，一些胚乳差異蛋白也被找到[13-14，17]。四倍體雜種是由2個(gè)同源四倍體水稻雜交而來，具有更強(qiáng)的生物學(xué)優(yōu)勢與雜種優(yōu)勢[18]。肖波等[19]研究發(fā)現(xiàn)，同源四倍體水稻廣陸矮4號(hào)與L202-4x雜交，其自交后代連續(xù)多年結(jié)實(shí)率都保持在80%左右。Guo 等[20]通過對(duì)同源四倍體水稻及其雜種F1不同組織的轉(zhuǎn)錄組差異進(jìn)行研究，找到了影響四倍體水稻育性和雜種優(yōu)勢的相關(guān)基因[21]。對(duì)多倍化水稻DNA甲基化變異與基因組的研究表明，二倍體水稻和四倍體水稻的大部分基因的表達(dá)水平?jīng)]有差異[22]。迄今，現(xiàn)有的對(duì)胚乳蛋白的研究多局限在低結(jié)實(shí)率的同源四倍體水稻上，在生產(chǎn)上的應(yīng)用價(jià)值不高，而對(duì)于高產(chǎn)四倍體雜種的胚乳蛋白的研究還處于空白。

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物種質(zhì)創(chuàng)新與細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)矮腳南特四倍體(AJNT-4x)連續(xù)自交52代，選育出結(jié)實(shí)率比較高的同源四倍體水稻；同時(shí)對(duì)同源四倍體水稻Jackson-4x(T45)和96025-4x(T44)雜交，再連續(xù)自交25代，選育出結(jié)實(shí)率接近二倍體水稻的新型四倍體水稻華多1號(hào)(H1)[23]。本研究選用高結(jié)實(shí)率的同源四倍體水稻AJNT-4x與新型四倍體水稻H1為研究對(duì)象，對(duì)四倍體水稻的氨基酸、直鏈淀粉、蛋白含量以及谷蛋白相關(guān)基因表達(dá)等進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，旨在了解不同染色體組成與品質(zhì)的關(guān)系，為四倍體水稻優(yōu)質(zhì)育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻材料為新型四倍體華多1號(hào)(H1)、美香占2號(hào)(MXZ2)、象牙香占(XYXZ)、矮腳南特二倍體(AJNT-2x)，自交選育52代的矮腳南特同源四倍體(AJNT-4x)。于2019年晚季種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場，正常田間管理。從水稻幼穗發(fā)育期開始，對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行標(biāo)記和觀察。用記號(hào)筆標(biāo)記當(dāng)天開花的材料，連續(xù)標(biāo)記一個(gè)月。摘取標(biāo)記開花后5，6，7，8，9，10，11，12，15，18，20，21，24，27，30 d的材料，將其迅速裝入冰盒，然后切胚，液氮速凍，放置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查

試驗(yàn)材料于2019年晚季種植在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場。田間試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組，株行距18 cm×21 cm，單株種植，每小區(qū)種植100株。田間管理同一般大田，力求均勻一致。成熟期各小區(qū)去除邊行，測量20株的結(jié)實(shí)率、粒長、粒寬、千粒質(zhì)量，均為3次重復(fù)[24]。

1.3 品質(zhì)分析及氨基酸測定

參照鄭明等[25]的方法，用近紅外谷物分析儀InfratecTM1241對(duì)試驗(yàn)材料H1、MXZ2、XYXZ、AJNT-2x、AJNT-4x進(jìn)行品質(zhì)分析，每份樣品重復(fù)取樣3次，每次取樣掃描3次，記錄數(shù)據(jù)。用德國Sykam全自動(dòng)氨基酸分析儀S-433D對(duì)AJNT-2x、H1、AJNT-4x花后15，20，30 d的17種氨基酸含量進(jìn)行測定，參考周夢怡等[26]的方法。

1.4 胚乳蛋白的逐級(jí)提取和總蛋白提取

參照Kumamaru等[4]的水稻全蛋白和胚乳蛋白的提取方法，略做修改。將準(zhǔn)備好的AJNT-2x、AJNT-4x及H1花后5，6，7，8，9，10，11，12，15，18，20，21，24，27，30 d切胚的胚乳分別磨成粉，準(zhǔn)確稱取100 mg干粉于1.5 mL離心管中，加入1.0 mL試劑(50 mmol/L Tris-HCl(pH 值6.8)+0.5 mol/L NaCl)，劇烈振蕩5 min，使樣品懸浮混勻。在低溫?fù)u床4 ℃振蕩6 h后，于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min；重復(fù)上述步驟2次，合并3次上清即為清蛋白和球蛋白組分。在沉淀中加入1.0 mL試劑B(60%正丙醇)，劇烈振蕩5 min，使樣品充分混勻。在低溫?fù)u床4 ℃振蕩6 h后，于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min；重復(fù)上述步驟2次，合并3次上清即為醇溶蛋白組分。在沉淀中加入1.0 mL試劑C(1%乳酸)，劇烈振蕩5 min，使樣品充分混溶。在低溫?fù)u床4 ℃振蕩6 h后，于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min；重復(fù)上述步驟2次，合并3次上清即為谷蛋白成分。

1.5 蛋白含量測定

將逐級(jí)提取的蛋白樣品進(jìn)行1∶3稀釋(樣品∶磷酸緩沖鹽溶液(1×PBS))，4種蛋白的含量采用BCA法進(jìn)行測定，具體測定方法采用BCA 法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(生工生物公司)說明書進(jìn)行操作，使用BioTek公司的Epoch2微孔板分光光度計(jì)酶標(biāo)儀測定。

1.6 不同時(shí)期RNA的提取

選取H1開花后第5，7，9，10，12，15，18，20，24，30天的胚乳籽粒，對(duì)谷蛋白基因GluA-1、GluA-2、GluA-3、GluB-1、GluB-2、GluB-4和GluB-6、GluC-1、GluD的RNA表達(dá)水平進(jìn)行研究(表1)。籽?？俁NA的提取參照杜何為等[27]方法。

1.7 谷蛋白基因的qRT-PCR分析

反轉(zhuǎn)錄用翌圣生物公司第一鏈cDNA合成試劑盒Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)，熒光定量用翌圣生物公司Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix(High Rox Plus)，擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 10 s，退火/延伸60 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

用Graph pad整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖，利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分析各組顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AJNT-4x與H1的遺傳組成與產(chǎn)量相關(guān)性狀分析

AJNT-4x為AJNT-2x加倍并連續(xù)自交52代選育而成的高產(chǎn)同源四倍體水稻。華多1號(hào)(H1)為Jackson-4x(T45)和96025-4x(T44)雜交，再連續(xù)自交25代選育而成的高產(chǎn)新型四倍體水稻雜種。由表2可以看出：AJNT-4x的粒長明顯比AJNT-2x的增長且差異顯著，粒寬、粒厚與AJNT-2x的也存在顯著差異；AJNT-4x的千粒質(zhì)量比AJNT-2x的明顯增加，且差異顯著；AJNT-4x的結(jié)實(shí)率為49.94%，比自交第一代同源四倍體水稻的結(jié)實(shí)率明顯提高，但仍然不及其原種AJNT-2x(71.18%)；H1的粒長、粒寬、粒厚、千粒質(zhì)量均不及AJNT-4x，但其結(jié)實(shí)率為74.29%，與AJNT-4x差異顯著，與AJNT-2x接近，達(dá)到二倍體水平。

表2 AJNT-4x與H1的粒形性狀分析Tab.2 The grain shape traits analyses for AJNT-4x and H1

2.2 AJNT-4x與H1的營養(yǎng)品質(zhì)和食用品質(zhì)分析

以國家級(jí)優(yōu)質(zhì)品種美香占2號(hào)(MXZ2)、象牙香占(XYXZ)，以及矮腳南特二倍體(AJNT-2x)為對(duì)照，對(duì)AJNT-4x與H1的蛋白質(zhì)含量與直鏈淀粉含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明：AJNT-4x糙米蛋白含量最高，為182.70 mg/g,優(yōu)于國家優(yōu)質(zhì)品種MXZ2、XYXZ及其二倍體原種AJNT-2x，且差異顯著；H1糙米蛋白含量比國家優(yōu)質(zhì)品種MXZ2、XYXZ略高，但不及AJNT-2x且差異顯著。AJNT-4x的精米蛋白含量為115.70 mg/g，優(yōu)于國家優(yōu)質(zhì)品種MXZ2、XYXZ，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于二倍體原種AJNT-2x且差異顯著；H1的精米蛋白含量最低，僅71.30 mg/g，不及國家優(yōu)質(zhì)品種MXZ2、XYXZ(表3)。在直鏈淀粉含量方面，AJNT-4x精米直鏈淀粉含量為265.30 mg/g，優(yōu)于二倍體原種AJNT-2x，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國家優(yōu)質(zhì)品種MXZ2、XYXZ，且差異均顯著；H1的精米直鏈淀粉含量高于國家優(yōu)質(zhì)品種MXZ2、XYXZ，但不及AJNT-2x(表3)。在堿硝值方面，AJNT-4x與H1的堿硝值相接近，分別為5.00，5.08，均低于國家優(yōu)質(zhì)品種XYXZ、MXZ2及AJNT-2x；在膠稠度方面，AJNT-4x的膠稠度為44.7 mm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家優(yōu)質(zhì)品種MXZ2、XYXZ、及二倍體原種AJNT-2x，差異顯著；H1的膠稠度為112.7 mm，介于國家優(yōu)質(zhì)品種MXZ2與XYXZ之間(表3)。

表3 AJNT-4x與國家優(yōu)質(zhì)品種MXZ2、XYXZ、二倍體原種AJNT-2x及新型四倍體H1 的品質(zhì)分析Tab.3 Quality analysis for AJNT-4x，and national quality varieties of MXZ2，XYXZ，and AJNT-2x，and neo-tetraploid H1

這些結(jié)果說明，AJNT-4x的蛋白含量很高，但其膠稠度很低，其營養(yǎng)品質(zhì)很高，高于國家優(yōu)質(zhì)品種，但食用品質(zhì)卻很差；H1的蛋白含量最低，但其膠稠度卻很高，其營養(yǎng)品質(zhì)偏低，但食用品質(zhì)接近國家優(yōu)質(zhì)品種，口感好。

2.3 AJNT-4x與H1氨基酸積累的動(dòng)態(tài)分析

比較分析AJNT-2x、AJNT-4x和H1花后15，20，30 d的17種氨基酸含量及人體必需氨基酸含量，結(jié)果表明：花后15 d，AJNT-4x與AJNT-2x、H1的17種氨基酸含量總量基本一致，但隨著胚乳的發(fā)育，AJNT-4x和AJNT-2x 的總氨基酸含量逐漸升高，花后20 d達(dá)到最大值，且差異顯著，AJNT-4x為91.70 mg/g，AJNT-2x為79.0 mg/g，然后略有下降并趨向穩(wěn)定；而H1在花后15 d達(dá)到最大值，為65.60 mg/g，然后略有下降并趨向穩(wěn)定，花后30 d為61.20 mg/g，與AJNT-2x(72.70 mg/g)差異顯著(圖1-A)。在花后15 d，H1的17種氨基酸總含量達(dá)到最大值，而AJNT-4x和AJNT-2x繼續(xù)積累，直到授粉后20 d達(dá)到最大值。H1的17種氨基酸含量在發(fā)育過程中的變化趨勢與總氨基酸含量的變化趨勢基本一致(圖1-B)。在氨基酸積累的動(dòng)態(tài)過程中，人體必需氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、賴氨酸)總量的變化趨勢與17種氨基酸總量的變化趨勢一致?；ê?0 d，AJNT-4x的17種氨基酸總量與人體必需氨基酸總量高于AJNT-2x與H1，H1的最低。由此推知，氨基酸含量積累過早停止導(dǎo)致H1在成熟期的總氨基酸含量下降，甚至低于AJNT-2x。

A.AJNT-2x、AJNT-4x和H1花后15，20，30 d的總氨基酸含量分析；B.H1花后15，20，30 d的17種氨基酸含量分析。不同字母表示在P =0.05水平的差異顯著。A.Analysis for the total amino acid content of AJNT-2x,AJNT-4x and H1 on 15，20，30 days after flowering；B.Analysis for the seventeen amino acids′contents of H1 on 15，20，30 days after flowering. Different letters indicate significant differences at P =0.05.

2.4 胚乳蛋白含量積累的動(dòng)態(tài)分析

花后5 d開始連續(xù)取材，直到花后30 d籽粒成熟，比較分析AJNT-4x、AJNT-2x及H1 4種胚乳蛋白含量積累的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明：AJNT-4x與AJNT-2x、H1的醇溶蛋白與谷蛋白在胚乳整個(gè)發(fā)育過程中的積累趨勢基本一致，都是在花后5 d已經(jīng)積累?；ê?0 d，H1的清-球蛋白、醇溶蛋白含量都介于AJNT-2x與AJNT-4x之間，AJNT-4x的清-球蛋白、醇溶蛋白含量最高；而H1的谷蛋白含量(9.69 mg/g)卻低于AJNT-2x(14.62 mg/g)與AJNT-4x(17.66 mg/g)，差異顯著，導(dǎo)致H1胚乳總蛋白含量(28.09 mg/g)低于AJNT-2x(31.04 mg/g)和AJNT-4x(37.76 mg/g)(圖2)。說明H1總蛋白含量下降主要由胚乳谷蛋白含量下降引起。

在胚乳整個(gè)發(fā)育過程中，AJNT-4x與AJNT-2x、H1的清蛋白和球蛋白的波動(dòng)一直比較平緩(圖2-B)。AJNT-4x與AJNT-2x、H1的醇溶蛋白積累存在一個(gè)快速增長期，H1與AJNT-2x 都是從花后12 d開始快速積累，到花后15 d結(jié)束(H1為2.01 mg/g，AJNT-2x為1.77 mg/g)，而AJNT-4x從花后12 d開始快速積累，到花后18 d結(jié)束(3.10 mg/g)，含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于H1與AJNT-2x，差異顯著(圖2-C)。AJNT-4x與AJNT-2x、H1的谷蛋白積累，從花后6～21 d，都存在快速增長期，但3種材料谷蛋白積累增長的時(shí)間和幅度略有差異。AJNT-4x、AJNT-2x存在3個(gè)快速增長期，AJNT-4x為花后6～7 d，9～11 d，18～21 d，AJNT-2x為花后7～8 d，9～12 d，20～21 d為快速增長期；H1從花后8～15 d持續(xù)緩慢增長，花后15～18 d為快速增長期(圖2-D)。由于H1的谷蛋白積累稍為平緩，快速積累的時(shí)間比較短，導(dǎo)致成熟期H1的谷蛋白含量最少；AJNT-4x快速積累的時(shí)間稍早，導(dǎo)致AJNT-4x的蛋白含量比AJNT-2x高。由此推知，AJNT-4x的谷蛋白快速積累的時(shí)間比AJNT-2x、H1早，且快速積累的時(shí)間長，導(dǎo)致AJNT-4x的蛋白含量最高。

2.5 不同時(shí)期谷蛋白相關(guān)基因的表達(dá)分析

選取3個(gè)GluA、4個(gè)GluB、1個(gè)GluC和1個(gè)GluD共9個(gè)谷蛋白亞家族基因(表1)，對(duì)AJNT-4x與AJNT-2x、H1在胚乳不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：花后5 d，AJNT-4x與AJNT-2x、H1的9個(gè)谷蛋白亞家族基因都有表達(dá)；隨著胚乳的發(fā)育，各谷蛋白基因的表達(dá)量逐漸升高、再逐漸下降并趨于穩(wěn)定，表達(dá)趨勢基本一致，但不同的亞家族基因在相同的時(shí)間表達(dá)的豐度有差異。AJNT-4x中GluC-1表達(dá)最活躍，花后20 d達(dá)到峰值3 810.37，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他幾個(gè)基因的表達(dá)峰值；成熟期花后30 d，AJNT-4x的9個(gè)基因的表達(dá)量均高于AJNT-2x和H1，尤其是GluC-1，在AJNT-4x中的表達(dá)量為1 404.12，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AJNT-2x和H1。H1的3個(gè)谷蛋白基因GluA-1、GluA-2、和GluA-3的表達(dá)量的最大值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AJNT-2x和AJNT-4x的最大值；達(dá)到最大值的時(shí)間也早于AJNT-2x和AJNT-4x，H1為花后12 d達(dá)到最大值，而AJNT-2x和AJNT-4x均為花后18 d達(dá)到最大值 (圖3)。

A.BCA法的標(biāo)曲；B.清-球蛋白；C.醇溶蛋白；D.谷蛋白。以AJNT-2x為對(duì)照。每種蛋白不同的字母表示在P=0.05水平的差異顯著。A.The standard curve of the BCA method；B.Albumin and globulin；C.Prolamin；D.Glutelin. AJNT-2x was used as control.Different letters in each protein indicate significant differences at P=0.05.

對(duì)于GluB基因而言，在AJNT-4x與AJNT-2x、H1 3個(gè)材料中，不同的基因在相同的時(shí)間表達(dá)豐度不同。GluB-1和GluB-4在H1中表達(dá)很活躍，GluB-1

每個(gè)基因不同的字母表示在P=0.05水平的差異顯著。Different letters in each gene indicate significant differences at P=0.05.

在AJNT-4x與AJNT-2x、H1中分別為花后18，18，12 d達(dá)到最大值，在H1中表達(dá)峰值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過AJNT-2x和AJNT-4x，差異顯著；而GluB-4在花后20 d，H1中的表達(dá)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過AJNT-2x和AJNT-4x，差異顯著。GluB-2和GluB-6在胚乳不同的發(fā)育時(shí)期，在H1中的表達(dá)量均低于AJNT-2x和AJNT-4x，且在花后15 d達(dá)到最大值，而在AJNT-2x中為花后20 d達(dá)到最大值，在AJNT-4x中為花后18 d達(dá)到最大值。

相對(duì)于GluA、GluB、GluC而言，GluD的基因唯一，因此家族內(nèi)不存在個(gè)別基因的差異。在表達(dá)高峰期，GluD在H1中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AJNT-2x和AJNT-4x，差異顯著。在3個(gè)材料中，GluD均在花后18 d達(dá)到最大值。

在胚乳發(fā)育過程中，不同的谷蛋白基因在相同的材料中達(dá)到峰值的時(shí)間不一樣，相同的谷蛋白基因在不同的材料中達(dá)到峰值的時(shí)間也不一樣。對(duì)于AJNT-4x而言，GluA-1、GluA-2和GluA-3均為花后18 d達(dá)到最大值，GluB-1、GluB-2和GluB-6均為花后18 d達(dá)到最大值，GluB-4為花后15 d達(dá)到最大值，GluC-1為花后20 d達(dá)到最大值，GluD為花后18 d達(dá)到最大值；對(duì)于H1而言，GluA-1、GluA-2和GluA-3均為花后12 d達(dá)到最大值，而GluB-1為花后12 d，GluB-2和GluB-6均為花后15 d達(dá)到最大值，GluB-4為花后20 d達(dá)到最大值，GluC-1為花后12 d達(dá)到最大值，GluD為花后18 d達(dá)到最大值。這些基因在不同的時(shí)期表達(dá)豐度的不同，導(dǎo)致谷蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化，并出現(xiàn)多個(gè)峰值。在不同的發(fā)育時(shí)期所檢測的9個(gè)谷蛋白基因中，7個(gè)基因在H1中的表達(dá)峰值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AJNT-2x和AJNT-4x，導(dǎo)致H1谷蛋白含量下降；而它們?cè)贏JNT-4x中表達(dá)峰值均高于AJNT-2x和H1，導(dǎo)致AJNT-4x的蛋白含量最高。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同遺傳組成與品質(zhì)的關(guān)系

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近幾年國內(nèi)外育種家利用多倍體雜交及連續(xù)自交多代選育技術(shù)，成功培育出一批高育性的四倍體水稻，其產(chǎn)量接近于二倍體水稻，克服了四倍體水稻育性低的問題[28-29]。但產(chǎn)量增加的同時(shí)，其品質(zhì)有沒有受到影響，值得探究。王成瑗等[30]通過對(duì)吉林省優(yōu)質(zhì)型、高產(chǎn)型和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)型共12個(gè)水稻品種的產(chǎn)量與稻米品質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)稻米品質(zhì)與產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)，產(chǎn)量提高后，除稻米的加工品質(zhì)提高外，其他品質(zhì)，如外觀品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)及食用品質(zhì)均下降。葉定池等[31]通過對(duì)產(chǎn)量構(gòu)成因子每穗總粒數(shù)、實(shí)粒數(shù)、千粒質(zhì)量等進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)大部分的產(chǎn)量構(gòu)成因子都明顯地影響稻米的品質(zhì)，如實(shí)粒數(shù)與蛋白質(zhì)含量呈顯著的負(fù)相關(guān)。本研究對(duì)AJNT-4x及H1的品質(zhì)進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)AJNT-4x的結(jié)實(shí)率不及其二倍體原種AJNT-2x，僅49.94%，由此推知其產(chǎn)量明顯下降，但其糙米與精米蛋白質(zhì)含量分別為182.70，115.7 mg/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其二倍體原種AJNT-2x，營養(yǎng)品質(zhì)大大提高，而其膠稠度只有44.70 mm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于二倍體原種，食用品質(zhì)明顯下降。而H1的結(jié)實(shí)率達(dá)到74.29%，接近二倍體水稻，由此可知其產(chǎn)量明顯提高，但其糙米與精米的營養(yǎng)品質(zhì)明顯下降，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AJNT-4x及AJNT-2x，而其食用品質(zhì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AJNT-4x及AJNT-2x，接近國家優(yōu)質(zhì)品種。所以不能籠統(tǒng)地評(píng)價(jià)產(chǎn)量與品質(zhì)的關(guān)系，因?yàn)槠焚|(zhì)分營養(yǎng)品質(zhì)、加工品質(zhì)、外觀品質(zhì)與食用品質(zhì)等多方面，應(yīng)該從不同的層次去評(píng)價(jià)產(chǎn)量與品質(zhì)的關(guān)系。

營養(yǎng)品質(zhì)包括蛋白質(zhì)含量、氨基酸含量等，不同的研究材料，稻米蛋白質(zhì)含量與產(chǎn)量的關(guān)系也不一樣。目前存在2種觀點(diǎn)，一種認(rèn)為稻米產(chǎn)量與蛋白質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，即產(chǎn)量高蛋白質(zhì)含量低；另一種認(rèn)為稻米的產(chǎn)量與蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)，即產(chǎn)量高蛋白質(zhì)含量也高。本研究通過比較研究發(fā)現(xiàn)：H1的產(chǎn)量雖然提高了，接近AJNT-2x，但其精米中的蛋白質(zhì)含量卻下降了，低于AJNT-2x；AJNT-4x雖然產(chǎn)量不高，但其蛋白含量卻提高了，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于H1及其二倍體原種AJNT-2x。由此推知，產(chǎn)量與蛋白質(zhì)含量不存在正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，產(chǎn)量或品質(zhì)由材料本身的遺傳組成決定。

3.2 胚乳蛋白的組成與含量，及谷蛋白相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)稻米品質(zhì)的影響

水稻的貯藏蛋白質(zhì)主要存在于胚乳中，根據(jù)溶解性的不同，分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。清蛋白與球蛋白主要集中在米糠與精糠中，在稻米加工碾磨過程中大部分丟失。精米中的蛋白質(zhì)主要為醇溶蛋白和谷蛋白，所以這2種蛋白決定了稻米的食用品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)[32]。醇溶蛋白不能被腸胃消化，導(dǎo)致稻米的食味品質(zhì)下降，而谷蛋白容易被人體消化和吸收，且富含賴氨酸、精氨酸等人體必需氨基酸，谷蛋白在水稻的品質(zhì)改良中具有重大意義[12]。

花后30 d，與AJNT-2x、AJNT-4x相比，H1的胚乳清-球蛋白、醇溶蛋白含量位于AJNT-2x、AJNT-4x之間，而谷蛋白含量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AJNT-2x、AJNT-4x。谷蛋白含量的顯著下降，導(dǎo)致H1的蛋白含量下降。也就是說H1蛋白含量下降是由于谷蛋白含量下降引起的。通過對(duì)胚乳的整個(gè)發(fā)育過程進(jìn)行谷蛋白積累的動(dòng)態(tài)分析，H1谷蛋白快速積累的時(shí)間比AJNT-2x、AJNT-4x均短，H1谷蛋白積累比較平緩，最終導(dǎo)致谷蛋白含量偏低。

谷蛋白是多基因家族，根據(jù)序列的相似性，分成GluA、GluB、GluC和GluD 4個(gè)亞家族[33]?？偣?5個(gè)基因，其中12個(gè)已被注釋到這4個(gè)亞家族中，3個(gè)基因未命名但屬于谷蛋白家族。谷蛋白基因的表達(dá)具有時(shí)空特異性，不同的材料在籽粒中表達(dá)的時(shí)期也有不同。孫紅正等[34]對(duì)稻米貯藏蛋白的生物信息學(xué)分析，認(rèn)為GluA-1與GluA-2在花后10 d的籽粒中表達(dá)量最高。Zhao等[35]的研究表明，GluA-3在種子發(fā)育前期開始表達(dá)，并于花后10～16 d達(dá)到峰值，其他谷蛋白成員在花后6 d才能檢測到相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本，花后14～16 d達(dá)到峰值。牛洪斌等[36]認(rèn)為GluB-6在花后10～15 d達(dá)到峰值。本研究對(duì)AJNT-4x與AJNT-2x、H1的9個(gè)谷蛋白基因在胚乳的不同的發(fā)育時(shí)期進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)各谷蛋白基因在花后5 d均有表達(dá)。隨著胚乳的發(fā)育，各基因的表達(dá)量均逐漸升高，達(dá)到峰值后，再逐漸下降并保持穩(wěn)定。但各基因達(dá)到峰值的時(shí)間略有差異，與前人的研究相似。GluA和GluB、GluB-4、GluC亞族的8個(gè)基因均在花后12～20 d達(dá)到峰值，GluD在花后18 d達(dá)到峰值。谷蛋白基因的表達(dá)時(shí)空特異性，導(dǎo)致谷蛋白的含量在胚乳發(fā)育過程中出現(xiàn)多個(gè)峰值。李文靜和孫艷香[37]對(duì)GluC-1的啟動(dòng)子進(jìn)行研究，認(rèn)為GluC-1是胚乳特異表達(dá)基因。本研究谷蛋白各基因的表達(dá)中，GluC-1在各時(shí)期的表達(dá)量最高，可能與GluC-1的胚乳特異啟動(dòng)子有關(guān)。在成熟期花后30 d，所研究的9個(gè)谷蛋白基因中，H1中谷蛋白基因的表達(dá)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AJNT-2x、AJNT-4x，這也是導(dǎo)致H1胚乳谷蛋白質(zhì)含量下降的原因之一，最終導(dǎo)致稻米蛋白含量下降，影響稻米的營養(yǎng)品質(zhì)。

3.3 氨基酸組成及含量對(duì)稻米品質(zhì)的影響

稻米營養(yǎng)品質(zhì)的高低，不僅取決于蛋白質(zhì)含量，還與氨基酸的組成與含量，尤其是必需氨基酸含量有關(guān)[38]。人體攝取蛋白質(zhì)主要是以氨基酸的形式進(jìn)行吸收，必需氨基酸是人體自身不能合成或合成速度不能滿足人體需求，必須從食物中攝取的，所以必需氨基酸是評(píng)價(jià)稻米營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)。張順等[39]通過對(duì)28個(gè)精白米樣品的必需氨基酸、總氨基酸及蛋白質(zhì)含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量與總氨基酸含量、必需氨基酸呈顯著的正相關(guān)，總氨基酸含量與必需氨基酸含量也呈顯著的正相關(guān)。本研究表明，必需氨基酸含量與17種氨基酸含量呈正相關(guān)，它們?cè)谂呷榘l(fā)育過程中的變化趨勢基本一致。花后15 d，H1必需氨基酸積累達(dá)到峰值，而AJNT-2x與AJNT-4x的必需氨基酸繼續(xù)積累，花后20 d達(dá)到峰值。AJNT-4x的氨基酸總量與必需氨基酸總量高于AJNT-2x，是由于基因劑量的增加引起的；但H1的含量低于AJNT-4x，是由于H1的必需氨基酸積累過早，最終導(dǎo)致H1的總蛋白含量下降。牛洪斌等[40]認(rèn)為，谷蛋白B亞族成員的賴氨酸等人體必需氨基酸含量普遍比A亞族的高，對(duì)增加稻米中GluB亞族成員含量有利于提高賴氨酸含量，改良稻米的品質(zhì)。在本研究中，花后30 d，H1的GluB亞族成員4個(gè)中有3個(gè)成員(GluB-1、GluB-2、GluB-4)的表達(dá)均高于AJNT-2x，且與其他谷蛋白基因相比，H1與AJNT-4x的表達(dá)差距也最小。所以H1的蛋白含量雖與AJNT-2x、AJNT-4x差異顯著，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AJNT-2x、AJNT-4x，但H1的賴氨酸含量卻與AJNT-2x、AJNT-4x相接近。說明雖然H1的營養(yǎng)品質(zhì)下降，但不影響它的營養(yǎng)價(jià)值。

3.4 結(jié)論

通過對(duì)同源四倍體水稻AJNT-4x及其原種AJNT-2x、國家優(yōu)質(zhì)品種MXZ2、XYXZ，以及新型四倍體H1進(jìn)行蛋白含量、直鏈淀粉含量、堿硝值、膠稠度等品質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)AJNT-4x精米與糙米的蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于二倍體原種AJNT-2x、新型四倍體水稻H1、和國家優(yōu)質(zhì)品種MXZ2、XYXZ，AJNT-4x的營養(yǎng)品質(zhì)明顯提高，但其膠稠度卻最低，食用品質(zhì)最差；H1精米蛋白含量下降，低于國家優(yōu)質(zhì)品質(zhì)，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AJNT-4x，營養(yǎng)品質(zhì)下降，但其膠稠度接近國家優(yōu)質(zhì)品種，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AJNT-4x，食用品質(zhì)接近國家優(yōu)質(zhì)品種。以AJNT-2x為對(duì)照，對(duì)AJNT-4x和H1的胚乳蛋白質(zhì)含量、人體必需氨基酸及谷蛋白基因的表達(dá)進(jìn)行研究，深入探討四倍體水稻的營養(yǎng)品質(zhì)差異。在胚乳發(fā)育過程中，AJNT-4x的清-球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白含量最高，而H1的清-球蛋白、醇溶蛋白介于AJNT-2x與AJNT-4x之間，H1的谷蛋白含量最低，H1蛋白含量下降是由谷蛋白含量下降引起的。在胚乳整個(gè)發(fā)育過程中，H1谷蛋白的含量變化一直比較平緩，且谷蛋白快速積累的時(shí)間比較短。不同的谷蛋白基因在胚乳發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)量不一樣，同一谷蛋白基因在不同的材料中表達(dá)的峰值不一樣。所研究的9個(gè)谷蛋白基因中，花后30 d，只有3個(gè)基因(GluB-1、GluB-2和GluB-4)在H1中表達(dá)量高于AJNT-2x，所有的基因在AJNT-4x中表達(dá)量均最高。AJNT-4x的17種氨基酸含量與人體必需氨基酸含量最高，H1最低。主要是由于在胚乳發(fā)育過程中，H1的氨基酸積累在花后15 d達(dá)到峰值，而AJNT-2x與AJNT-4x在花后20 d達(dá)到峰值?；騽┝康脑黾訉?dǎo)致AJNT-4x的氨基酸總量與必需氨酸總量高于AJNT-2x，但H1的氨基酸積累過早停止，導(dǎo)致它的氨基酸總量與必需氨基酸含量低于AJNT-4x，甚至低于AJNT-2x，最終導(dǎo)致H1的總蛋白含量最低。研究結(jié)果為水稻多倍體優(yōu)質(zhì)育種提供理論依據(jù)。