黃鱔出血病研究進展

文崢嶸，羅鳴鐘，柴 毅，楊代勤，李 銳，魏 巍

（1.長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025；2.浙江省農業(yè)科學院農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室（籌），杭州 310021）

黃鱔（Monopterusalbus）因具有豐富的營養(yǎng)價值和較高的藥用價值而深受廣大消費者的青睞。近年來，養(yǎng)殖水體的污染以及不合理的養(yǎng)殖方式等導致黃鱔暴發(fā)性細菌疾病種類增多，給黃鱔養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經濟損失。在黃鱔養(yǎng)殖中，出血病是暴發(fā)性細菌疾病之一，具有傳染力強、死亡率高等特點［1］。嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）是水產養(yǎng)殖中暴發(fā)性細菌病的主要病原體之一［2］，是黃鱔出血病的主要病原菌［3］，嗜水氣單胞菌為條件致病菌，其致病條件受菌體本身致病性和環(huán)境因素影響，環(huán)境突變時也會誘發(fā)黃鱔出血病。嗜水氣單胞菌既可以單獨引起黃鱔發(fā)病，也可與其他病原菌混合致病。本研究綜述了嗜水氣單胞菌在免疫學、病理學、分子生物學水平的研究進展，對其生物學特性進行了概括總結，旨在為有效防止黃鱔由嗜水氣單胞菌引起的病害提供基礎資料。

1 黃鱔出血病的病原及其特性

1.1 嗜水氣單胞菌菌體形態(tài)

1989年，陳懷青等［4］從患病黃鱔體內分離病原菌培養(yǎng)，首次報道了黃鱔出血病病原為嗜水氣單胞菌。培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌菌體為革蘭氏陰性菌，菌體直、兩端鈍圓、極生單鞭毛、有運動性，呈短桿形態(tài)。張錦華等［5］從發(fā)病的甲魚（Pelodiscussinensis）中分離出一株細菌，感染黃鱔后黃鱔出現(xiàn)出血病癥狀，分離培養(yǎng)該菌株得到與嗜水氣單胞菌菌體形態(tài)描述相一致。

1.2 嗜水氣單胞菌菌落的形態(tài)特征

嗜水氣單胞菌菌落直徑2～3 mm，圓整平滑，有特殊芳香氣味。顏色由白至淺黃色，在營養(yǎng)肉湯中，菌落大小因培養(yǎng)時間而異，在有氧環(huán)境及厭氧環(huán)境下，CAMP試驗均為陽性［6］。楊移斌等［7］通過鑒別培養(yǎng)基的方法鑒別出一株從患病黃鱔體內分離到的病原菌株，培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)試驗菌落符合嗜水氣單胞菌菌落相關描述，初步確定所獲菌株為嗜水氣單胞菌。

1.3 嗜水氣單胞菌致病性

1891年，Sanarelli首次對嗜水氣單胞菌形態(tài)結構進行描述，稱為Bacillus hydrophila fuscus。1959年，中國科學院水生生物研究所研究報道嗜水氣單胞菌能誘發(fā)魚類爛鰓病和赤皮病。研究表明，通常通過表型變化、臨床診斷以及基因的毒力因子成為致病性檢測的標準［8］。高明輝等［9］從暴發(fā)細菌性出血病的發(fā)病黃鱔中分離得到了嗜水氣單胞菌菌株，以5.0×108個/mL菌液浸浴黃鱔，菌液浸浴的黃鱔暴發(fā)出血病并在48 h死亡率達100%。莫豪虎等［10］將純培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌以0.2 mL/條腹腔接種黃鱔，2 d內黃鱔均發(fā)病并死亡?？梢娛人畾鈫伟鷮S鱔有很強的致病性，浸浴或注射都能造成黃鱔死亡。

1.4 嗜水氣單胞菌致病機理

嗜水氣單胞菌可以通過飲水、皮膚創(chuàng)傷等途徑感染，造成機體損傷［11］，魚類的表皮是魚類與水環(huán)境的第一道防線［12］。黃鱔患病途徑主要是通過體表感染，首先嗜水氣單胞菌會在魚體表分泌體表外聚合物增加黏性，從而感染積聚繁衍［13］，破壞上皮組織，進入血液，然后通過血液循環(huán)進入肝臟、腎臟、脾臟等組織，繼而引起組織以及血液變性，最后出現(xiàn)全身癥狀。

2 黃鱔出血病的病征及病理特征

黃鱔出血病在全國各地均有發(fā)生，湖北、湖南、江西、安徽等主產地大規(guī)模暴發(fā)，發(fā)病高峰期在8月下旬至10月上旬，流行季節(jié)為5—11月。黃鱔出血病主要病征表現(xiàn)為魚體發(fā)白，黏液增多，爛肉爛鰭，肛門紅腫，腸黏膜上皮脫落，基底膜排列紊亂，脾臟、腹腔等器官充血、出血，死亡率高［14］。何智［15］通過人工接種已鑒定的嗜水氣單胞菌菌液到黃鱔體內，發(fā)現(xiàn)感染3 h后黃鱔腎臟病變最為明顯，感染后期腸上皮細胞脫落、肝臟細胞壞死。凌天慧等［16］利用電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病鱔肝臟積血變性、組織潰爛，脾臟破裂、腎臟間質出血嚴重、少量腎小管消失以及腸組織細胞病變、腸系膜充血、伴有異常白細胞積聚。何智等［11］通過以3.6×107cfu/L菌液稀釋10倍后腹腔注射健康黃鱔，嗜水氣單胞菌脅迫后的黃鱔脾臟充血、出血、最終壞死，肝臟表現(xiàn)為細胞充血、形成空泡，腎臟最為嚴重，表現(xiàn)為腎小球壞死、間質充血、多組織壞死，腸道中腸組織病變、腸絨毛脫落。在嗜水氣單胞菌感染黃鱔后，在組織病理變化明顯，組織不同程度病變，伴隨著器官大量出血，死亡率大大增高。

3 黃鱔出血病病原菌的診斷與檢測

3.1 生化方法

黃鱔出血病病原的生化鑒定方法，通常包括菌體觀察、人工感染、回歸感染等常規(guī)鑒定方法。傳統(tǒng)生化方法鑒定細菌種類主要依據(jù)細菌對營養(yǎng)物質分解能力不一致，代謝產物不同，致病性嗜水氣單胞菌的檢測已制定了國家標準GB/T 18652—2002［5］，即添加標準生化試劑到病鱔組織中觀察反應結果，與國家標準進行對比發(fā)現(xiàn)便可得出初步結論。而后在生化反應的基礎上研制出API快速反應板和細菌鑒定儀［17］，通過計算機分析不同測試孔的顏色變化來鑒定細菌的種屬。高明輝等［9］通過傳統(tǒng)生化試驗，將從病體黃鱔的肝臟、消化道、血液分離到的單菌落接種生化管，經過生化分析鑒定，確定所采集致病菌為嗜水氣單胞菌。

傳統(tǒng)生化方法鑒定黃鱔嗜水氣單胞菌的方式耗時耗力，使用AHM培養(yǎng)基鑒定菌株操作簡單，但耗時較長；而全自動生物鑒定儀通過分析細菌圖譜鑒定細菌更加精確可信，但機器較為昂貴，難以普及。

3.2 免疫學方法

斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（Dot-ELISA）利用硝酸纖維素膜（NCM）為載體，方法簡便、節(jié)省抗原、保存期長。周飛等［18］應用斑點酶聯(lián)免疫試驗檢測引起四川省綿陽市某養(yǎng)殖場暴發(fā)出血病的黃鱔病原，試驗結果為陽性，即出現(xiàn)了明顯棕色斑點，結合生化指標鑒定病原為嗜水氣單胞菌，取得滿意效果。

3.3 分子生物學方法

分子生物學技術廣泛用于動、植物病原菌和病毒的相關檢測方面，并體現(xiàn)了特異性強、靈敏度高、用時短、檢測量大等優(yōu)點［19］。

聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction，PCR），是一種在體外將特異性DNA進行引物介導的酶促放大方法。楊壯志等［20］根據(jù)氣溶素基因序列，設計出一對特異性引物，采用PCR方法檢測到致病性嗜水氣單胞菌在17尾黃鱔中呈陽性表達，耗時6 h；相比常規(guī)鑒定耗時72 h，檢出率僅為40.9%，PCR檢測病原既快捷又準確。

多重PCR（multiplex PCR），是指在一個PCR體系基礎上，添加兩對及以上的引物進行擴增，最終得到多個DNA片段的PCR反應。艾克特等［21］將從患病黃鱔中獲得的嗜水氣單胞菌Hly A基因進行擴增，并建立多重PCR檢測方法，檢測出患病黃鱔的病原菌為嗜水氣單胞菌以及肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）。多重PCR檢測方法對水產常見病原鑒定有重要意義。

環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），是一種合算恒溫擴增技術，具有操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點。喻蔚等［22］運用該技術擴增嗜水氣單胞菌tbp A基因，優(yōu)化反應溫度，檢測該方法的靈敏度及特異性，結果表明，該方法最適擴增時間為40 min，并且能有效檢測到1 pg/μL核酸濃度，具有很高靈敏度及特異性，是快速檢測嗜水氣單胞菌的便捷方式。

分子生物學技術已經運用廣泛，如基因組DNA的分離純化、RNA的抽提、PCR的擴增等都是檢測細菌及細胞的重要手段，運用分子生物學檢測手段具有自動化程度高、速度快，同時便于建立標準化操作等優(yōu)點。

4 黃鱔出血病病原菌研究進展

4.1 黃鱔免疫系統(tǒng)對嗜水氣單胞菌侵染的應答機制

張釗等［23］對健康黃鱔注射不同濃度的嗜水氣單胞菌菌液，通過定量PCR方式檢測感染黃鱔的脾臟、腎臟和肌肉中Moronecidin基因在不同時間處理下的表達量。結果表明，Moronecidin基因在健康魚體3種組織中都有表達，其中脾臟表達最高，隨著濃度以及時間的升高，Moronecidin基因表達下調。林榮楠［24］通過熒光定量PCR反應，檢測黃鱔MIF和CathepsinB兩個基因在感染嗜水氣單胞菌后的表達變化，表明感染后的黃鱔MIF基因表達量呈先高后低的趨勢；黃鱔CathepsinB基因表達量明顯升高，即黃鱔MIF和CathepsinB基因對黃鱔抵御嗜水氣單胞菌入侵有積極作用。闞延澤等［25］利用熒光定量PCR對黃鱔載脂蛋白A1基因在不同組織以及嗜水氣單胞菌脅迫后的表達情況進行了分析，表明該基因在不同組織中均有表達，其中肝臟中最高，黃鱔的載脂蛋白Apo-A1基因可能參與了魚體的天然免疫反應。在魚類中，TNF-α和IL-1β是兩種廣泛研究的細胞因子［26］，Xu等［27］通過Real Time PT-PCR方法檢測IL-1β和IL-1R2在不同組織的表達情況，注射6 h后基因表達量達到最高水平，表明IL-1β和IL-1R2在炎癥和宿主防御中起重要作用。當嗜水氣單胞菌侵入機體時會引起黃鱔發(fā)生免疫應答，通過PCR檢測免疫基因的表達變化，判定嗜水氣單胞菌對黃鱔免疫基因的影響。

魚類非特異性免疫是通過各種免疫細胞和免疫因子來實現(xiàn)的［28］。嗜水氣單胞菌侵入時會誘發(fā)黃鱔發(fā)生非特異性免疫，刺激機體的氧化應激，產生大量的活性氧，酶促可以減少氧化應激帶來的損傷，同時反應機體受損傷程度［29］。溶菌酶、堿性磷酸酶、谷胱甘肽S-轉移酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶是機體內重要的免疫因子［30］，溶菌酶是目前研究最多的先天反應因子［31］，負責補體系統(tǒng)的激活和吞噬病原的作用［32］，這幾種酶類都能反映黃鱔免疫功能的變化，張釗等［23］通過檢測病鱔血清中溶菌酶、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、總超氧化物歧化酶4種酶活性變化，4種酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。王霞等［33］用不同濃度嗜水氣單胞菌感染健康黃鱔，研究細菌對黃鱔血細胞的影響，表明感染24 h的黃鱔紅細胞濃度隨著處理組菌濃度增加而逐漸減小，感染后黃鱔白細胞及淋巴細胞顯著增多，說明嗜水氣單胞菌會刺激機體產生免疫反應，感染前期免疫酶活以及炎癥細胞增多產生免疫應激，感染后期由于嗜水氣單胞菌的致病性導致免疫因子的活力逐漸降低，從而影響黃鱔的免疫功能表達?？梢姡人畾鈫伟梢杂绊扅S鱔機體多種酶類以及免疫細胞應激，降低機體免疫力。

4.2 抗菌肽對嗜水氣單胞菌的抑菌作用

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs），是非特異性免疫的重要組成成分［34］，免疫性好，具有廣譜殺菌功能，在黃鱔機體各組織均有分布。許勤智［35］從黃鱔血液、表皮、體表黏液、肝臟、脾臟、腸道和腎臟等組織中提取到了抗菌肽粗提物，表明黃鱔腸道的抗菌肽提取物對嗜水氣單胞菌的抑制效果最好。王霞［36］研究黃鱔肝臟、腎臟、腸和皮膚提取物的抗菌活性，表明4種組織的提取物都對嗜水氣單胞菌具有很好的抑制作用。李聯(lián)泰等［37］將黃鱔體表黏液分離純化，得到多肽MAS-Ⅳ-4，抑菌試驗表明MAS-Ⅳ-4對嗜水氣單胞菌有較強的抑菌效果。唐勇［38］將黃鱔肝臟和腸道粗提取物進行純化，獲得黃鱔抗菌肽，抑菌試驗表明獲得的抗菌肽對嗜水氣單胞菌有很好的抑制效果。黃鱔抗菌肽作為黃鱔體內外廣泛存在的一類殺菌劑，是病原入侵機體時的一道屏障，其廣泛的生物學活性顯示其在生物免疫上良好的應用前景。

5 黃鱔出血病的防治

5.1 抗生素

使用抗生素防控嗜水氣細胞單菌引發(fā)的黃鱔疾病，能在短時間內控制病情蔓延，但高頻率使用抗生素帶來的負面影響也十分顯著?？股鼐哂懈咚苄裕蛟诃h(huán)境中不易降解［39］，在養(yǎng)殖生產中盲目使用抗生素，會造成環(huán)境污染及防治效果降低等問題?？股卦谏a上運用廣泛且價格低廉，操作簡單（表1）。

表1 抗生素對黃鱔源嗜水氣單胞菌藥敏試驗的相關研究

抗生素在治療黃鱔出血病，抵抗嗜水氣單胞菌侵襲方面擁有很好的效果，能夠有效防治黃鱔出血病。但各地黃鱔源分離的嗜水氣單胞菌菌株對抗生素的敏感程度存在差異，產生該現(xiàn)象的原因較多，如菌株分離地點環(huán)境差異產生了耐藥性的變異；藥敏試驗所用的藥物濃度以及敏感性判斷標準不同；黃鱔養(yǎng)殖過程中抗生素藥物的使用不規(guī)范導致耐藥菌株的產生等?？股氐氖褂糜欣斜祝x用抗生素防治黃鱔出血病時應根據(jù)實際情況進行選擇，并注意用藥量。

5.2 中藥

中藥可以減少甚至替代抗生素的使用，防治黃鱔源嗜水氣單胞菌引起的疾?。?］，植物提取物是替代抗生素很好的免疫刺激劑［44］，藥用植物具有抗氧化特性，減少機體損傷［45］。國內學者們已進行了大量研究（表2）。

表2 中藥防治黃鱔出血病的相關研究

中藥防治黃鱔嗜水氣單胞菌研究主要分為體外抑菌試驗、養(yǎng)殖投喂試驗和腹腔注射試驗。體外抑菌是通過培養(yǎng)基抑菌試驗，運用紙片法檢測目的中藥對嗜水氣單胞菌的影響效果。盧春霞［46］通過醇提法獲得16種中草藥；孫武等［47］通過浸提法制成復方漁用藥；周飛等［22］通過水提法獲得12味中草藥，表明調整投喂可提高黃鱔免疫力。養(yǎng)殖投喂試驗更加貼近生產實踐，則更加直觀地體現(xiàn)中草藥制劑的效果［48，49］。4種復方中草藥在提高黃鱔存活率和降低疾病發(fā)生方面都有促進作用。通過腹腔注射中草藥防治疾病黃鱔出血病發(fā)生的方式，在生產運用中推廣難度更大、操作要求更高。閆琳等［50］通過將加味玉屏風散腹腔注射黃鱔，相比對照組提高了黃鱔的存活率。研究證明植物化學物質對嗜水氣單胞菌具有很好的抑菌活性［51］。中藥防治黃鱔出血病療效良好，對環(huán)境的污染小，但由于所需治療時間長，需要長期防治才有很好的效果，投入的物力人力較大，并且治療效果也會因為環(huán)境的改變發(fā)生變化，防治效果不一，想要推廣中藥防治黃鱔出血病還需進一步研究。

5.3 全菌滅活苗

全菌滅活疫苗安全性高、成本較低，但存在免疫效果不理想、免疫持久性不佳等問題。范紅結等［52］選用嗜水氣單胞菌疫苗生產用菌J-1株，制成滅活疫苗以腹腔注射和浸泡方法免疫黃鱔，后用同源強毒力株攻毒，疫苗的相對存活率分別為83.3%和58.3%。該疫苗能為黃鱔提供一定的保護，在一定程度上能有效防止疫病的傳播。

5.4 養(yǎng)殖管理

黃鱔出血病發(fā)生是黃鱔、致病菌和水環(huán)境多因素聯(lián)合作用的結果，其中水環(huán)境因素具多變性，是決定疾病發(fā)生和發(fā)展的重要外部因素，嗜水氣單胞菌的致病性為該病發(fā)生的內部因素，研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌主要通過細胞外產物和獨立因子發(fā)揮致病性［53］。黃鱔養(yǎng)殖管理是疾病防治中的關鍵環(huán)節(jié)，病害防治以預防為主。使用消毒劑來預防疾病發(fā)生，聚維酮碘（PVP-I）是一種廣譜消毒劑，對多種病原都有很好的殺滅效果［54］。Chen等［55］利用聚維酮碘在不同類型的水中進行消毒，證明聚維酮碘可以有效地防止嗜水氣單胞菌在黃鱔養(yǎng)殖中的傳播，減少黃鱔出血病的發(fā)生，提高生存率。生產中也通過投喂酵母免疫增強劑來提高黃鱔的抗病能力，徐海華等［56］通過投喂不同濃度免疫多糖（酵母細胞壁）到黃鱔飼料中，研究免疫多糖對受嗜水氣單胞菌感染的黃鱔非特異性免疫及特異性免疫的影響，表明免疫多糖有效地提高了黃鱔的免疫能力，同時提高了黃鱔對嗜水氣單胞菌的抵抗力。

6 結論

嗜水氣單胞菌是多種水生生物的原發(fā)性致病病原菌，同時也是能引起人、獸、水生動物患病的一類病原菌［6］。隨著科技的進步，嗜水氣單胞菌的鑒定方式已經趨于規(guī)范，并制訂了國家標準。但到目前針對黃鱔出血病的防控方式各有利弊。首先，嗜水氣單胞菌的致病性會因環(huán)境不同而發(fā)生變化，針對嗜水氣單胞菌疫苗的開發(fā)進行了大量的研究，但有關黃鱔源嗜水氣單胞菌的疫苗研發(fā)還比較薄弱；其次，生產養(yǎng)殖上多采用抗生素防治嗜水氣單胞菌引起的疾病，既容易產生耐藥性，又對生態(tài)環(huán)境有一定的危害，因此對于抗生素的污染、中藥防治效果的穩(wěn)定性、疫苗價格昂貴等問題亟待解決。在運用分子生物學方法研究黃鱔出血病方面，對于嗜水氣單胞菌的作用機制尚未研究清楚，對于其毒力因子的研究還不夠充分，對于嗜水氣單胞菌的分布、來源、感染途徑、在體內的作用機理沒有宏觀的描述。同時，抗菌肽的研發(fā)又具有產量低、費時、價格高昂、制作工藝要求高、無法實現(xiàn)大規(guī)模規(guī)范化生產等限制因素。由于嗜水氣單胞菌主要通過腸道感染，學者們開始探索有益菌對防治黃鱔出血病的免疫效果，研究已證實細菌素和乳酸對嗜水氣單胞菌具有協(xié)同抑制效果［57］，從生物膜探討對嗜水氣單胞菌的抑制，給黃鱔出血病防治提供了新思路，還有通過腸道菌群的多樣性提取出優(yōu)質的益生元、益生菌在魚體內起到很好的免疫保護作用［58］。至此，為更加有效地防治黃鱔出血病，建議增加黃鱔腸道微生物穩(wěn)態(tài)方面的研究，同時研發(fā)更易代謝和少污染的抗生素藥品，疫苗和抗菌肽方面著重于市場的需求度方面靠攏，研制價格低廉、防控效果好、免疫方式便捷同時能夠大規(guī)模生產的新型疫苗及抗菌肽。