藥源微生物遺傳育種的研究進(jìn)展

仝倩倩，李亞亮，王順昌，顏守保

(1.淮南師范學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 淮南 232038；2.資源與環(huán)境生物技術(shù)安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮南 232038)

0 引言

微生物藥物是指微生物發(fā)酵產(chǎn)物或其衍生物研發(fā)的醫(yī)藥產(chǎn)品[1].藥源微生物菌種性狀的好壞，直接關(guān)系到目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量與品質(zhì)，對(duì)藥物的高效率制備極其重要.因此，藥源微生物菌種遺傳育種技術(shù)在現(xiàn)代生物技術(shù)中，尤其是在生物制藥中具有重要的地位.藥源微生物遺傳育種從常規(guī)的自然育種發(fā)展到誘變育種、原生質(zhì)體融合育種、基因組重排育種及基因工程育種，改良甚至改變菌種遺傳特性，大大提高了藥源微生物育種的效果.文章主要從方法技術(shù)、理論機(jī)理、應(yīng)用和發(fā)展前景等方面綜述藥源微生物遺傳育種的研究進(jìn)展.

1 自然育種

自然育種是利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過程[2].在工業(yè)菌種保藏中，可通過自然選育分離純種，防止菌種衰退，并對(duì)已經(jīng)衰退的菌種進(jìn)行復(fù)壯；或在工業(yè)大生產(chǎn)中，從生產(chǎn)水平高的批次中，分離出高產(chǎn)菌株，提高發(fā)酵產(chǎn)量，保藏并用于穩(wěn)定生產(chǎn).一般不直接用于藥源微生物的菌種選育.

2 誘變育種研究及應(yīng)用概況

誘變育種，是利用各種誘變劑處理微生物細(xì)胞，提高基因突變頻率，再通過適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法.誘變育種包括誘變和篩選兩部分，關(guān)鍵是選擇出發(fā)菌株、確定誘變劑種類和劑量.

2.1 物理誘變

物理誘變主要是由高能輻射引起微生物遺傳物質(zhì)的變異.傳統(tǒng)物理誘變劑有紫外線、微波、各種射線、超聲波等[3].紫外線(UV)使用最早，當(dāng)微生物DNA吸收紫外線之后，DNA雙鏈會(huì)形成胸腺嘧啶二聚體，從而引起遺傳特性的改變[4].微波是一種高頻率電磁波，可刺激極性分子快速震動(dòng)，從而發(fā)生遺傳變異[3，5，6]；微波誘變可直接使用家用微波爐，實(shí)際推廣應(yīng)用更具優(yōu)勢(shì)，但要注意微波熱效應(yīng)，一般需采用加冰等降溫冷卻手段，消除輻射過程中產(chǎn)生的熱效應(yīng).

林可霉素是由林可鏈霉菌(Streptomyceslincolnensis)產(chǎn)生的一種抗生素，主要用于治療由革蘭氏陽性菌引起的疾病.El-Sherbini等[7]利用紫外誘變照射S.Lincolnensis，獲得60個(gè)突變株，其中有34個(gè)表現(xiàn)出比野生型菌株更高的林可霉素產(chǎn)量(從77.69%上升至84.62%).筆者等[8]利用微波誘變結(jié)合鏈霉素抗性篩選動(dòng)物抗生素維吉尼亞霉素高產(chǎn)菌株維吉尼亞鏈霉菌(Streptomycesvirginiae)，正突變率高達(dá)32.83%；并獲得一株高產(chǎn)菌株MW 178((146.72±11.80) μg/mL)，較出發(fā)菌株((21.24±1.34) μg/mL)提高了約6倍.

近年來，育種工作者還開發(fā)出一些新型的物理誘變劑.離子注入技術(shù)是1986年由中科院余增亮等首次應(yīng)用于農(nóng)作物品種改良，它是集化學(xué)誘變及物理誘變?yōu)橐惑w，存活率隨注入劑量增加呈現(xiàn)先降后升再降的“馬鞍型”變化[9-10]，可達(dá)到10%～20%的高突變率，在藥源微生物菌種育種中起著重要的作用.清華大學(xué)研發(fā)了專門應(yīng)用于生物誘變育種的常壓室溫等離子體(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)誘變育種儀，獲得業(yè)界的廣泛認(rèn)可.ARTP誘變育種儀是一種新開發(fā)的基于大氣壓射頻輝光放電等離子體的全細(xì)胞誘變工具，具有比UV輻射或化學(xué)誘變劑更高的突變率，產(chǎn)生的高活性粒子可改變微生物細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及通透性，并發(fā)生基因損傷，最終導(dǎo)致微生物突變[11].但ARTP誘變育種技術(shù)仍處于發(fā)展階段，很多問題還有待進(jìn)一步研究，如ARTP誘變育種對(duì)各種生物分子作用機(jī)理，ARTP誘變育種對(duì)于不同生物種的代謝過程、生理及遺傳的影響機(jī)制等.

阿維菌素類藥物作為一類動(dòng)物抗寄生蟲藥劑和植物殺蟲劑，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)，Wang等[12]利用12C6+重離子誘變技術(shù)處理阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)，成功篩選出阿維菌素B1a高產(chǎn)突變株，最高一株ZJAV-Y-147突變株產(chǎn)量達(dá)4 822.23 μg/mL，其產(chǎn)量是出發(fā)菌種的2倍.阿魏酸作為阿魏、木賊、當(dāng)歸等多種中藥的有效成分之一，Liu等[13]為了獲得提高拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)對(duì)阿魏酸的耐受力，采用大氣壓輝光放電低溫等離子體誘變技術(shù)結(jié)合高通量篩選，獲得能耐受0.9 g/L的突變株NCIMB 8052和M11，揭示Cbei _ 4693基因在調(diào)控阿魏酸發(fā)酵過程中起到了重要的作用.

2.2 化學(xué)誘變

化學(xué)誘變劑是一類化學(xué)物質(zhì)，如烷化劑、堿基類似物、移碼突變劑等，由于其誘變效果好且經(jīng)濟(jì)，因此在實(shí)驗(yàn)室中被廣泛應(yīng)用.然而，化學(xué)誘變劑大部分是致癌物質(zhì)，使用必須十分謹(jǐn)慎.操作者需要作好自身防護(hù)，避免誘變劑與皮膚接觸，防止吸入蒸氣，導(dǎo)致白血病等惡性疾病的發(fā)生；另外，要防止污染環(huán)境.

常用的烷化劑有亞硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG)、甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)及硫酸二乙酯(diethyl sulfate，DES)等[3].其中，NTG又稱超誘變劑，能使DNA分子上的堿基及磷酸烷化，從而發(fā)生遺傳性變異，影響微生物代謝途徑[14-15].NTG是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，在操作時(shí)要十分小心，作好防護(hù)，如要戴橡膠手套，戴口罩，在通風(fēng)櫥中稱量等[3].堿基類似物是結(jié)構(gòu)類似于天然四種堿基的物質(zhì)，這類誘變劑誘變生長旺盛的微生物，可以取代核酸分子中堿基的位置，效果較好，因此也被稱為摻入誘變劑.一般來講，堿基類似物與其他物理及化學(xué)誘變聯(lián)合使用效果會(huì)更好，是一種增敏劑，提高突變率.

宋芳等[16]采用250 μg/mL的NTG對(duì)出發(fā)菌株紫金牛葉桿菌(Phyllobacteriummyrsinacearum)RC6b進(jìn)行化學(xué)誘變后，其中菌株N-RC6b2對(duì)二苯砷酸的降解率最高，由出發(fā)菌株的低于2%提高到36.71%，效果顯著.杜嬋娟等[17]為了提高生防菌短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)對(duì)香蕉炭疽病的抑菌活性，采用紫外線/亞硝酸鈉復(fù)合誘變的方法對(duì)短短芽胞桿菌 Bb5911 進(jìn)行誘變，復(fù)篩得到一株突變株5B37-3，對(duì)13種植物病原真菌的抑菌活性提高18.20%～239.27%.

2.3 復(fù)合誘變

長期使用一種誘變劑會(huì)產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”，實(shí)際生產(chǎn)中往往采用多種誘變劑復(fù)合處理的方法進(jìn)行菌株誘變，提高誘變效率.黃文福等[18]為了提高在臨床上常用的抗生素林可霉素的發(fā)酵水平，以林可霉素LK15-35為出發(fā)菌株，采用氯化鋰、常壓室溫等離子體和紫外線三重復(fù)合誘變，最終獲得高產(chǎn)突變株LK16-77，搖瓶發(fā)酵單位比出發(fā)菌株提高30.0%.

2.4 篩選

誘變育種技術(shù)由于是非定向突變，所以一般會(huì)結(jié)合特定的篩選方法，如抗生素抗性、耐前體類似物抗性等，提高正突變率，從而提高篩選效率.1998年，文獻(xiàn)[19-21]提出了一種可以廣泛用于提高微生物抗生素(次級(jí)代謝產(chǎn)物)產(chǎn)量的方法——鏈霉素耐藥性篩選，該法正突變率頻率高、具有廣譜性，對(duì)許多抗生素產(chǎn)生菌抗性突變株的篩選都有較好的效果.另外，在生物合成中，代謝產(chǎn)物過量積累時(shí)常會(huì)出現(xiàn)反饋調(diào)控作用，抑制途徑中有關(guān)酶的合成或活性，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物產(chǎn)量下降.由于初級(jí)代謝中某一段造成的反饋?zhàn)枰侄绊懘渭?jí)產(chǎn)物產(chǎn)量的現(xiàn)象，因此可通過耐前體結(jié)構(gòu)類似物的突變加以消除[3]，使突變株能不斷產(chǎn)生參與合成代謝產(chǎn)物的前體，從而提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量.

作為腫瘤化療重要藥物的博來霉素，Zhu等[22]為了提高其產(chǎn)量，利用紫外誘變和抗生素抗性篩選對(duì)重組菌株StreptomycesflavoviridisSB9026進(jìn)行改良，成功獲得一株高產(chǎn)突變株G-4F12，其產(chǎn)量超過70 mg/L，比出發(fā)菌株提高了7倍.在利用釀酒酵母產(chǎn)腺苷蛋氨酸(SAM)的誘變育種中，蛋氨酸是合成腺苷蛋氨酸的底物，乙硫氨酸是蛋氨酸類似物，提高釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)乙硫氨酸抗性基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)高濃度乙硫氨酸的耐受性，從而提高釀酒酵母腺苷蛋氨酸的產(chǎn)量.Cao等[23]首先對(duì)釀酒酵母CGMCC 2842 進(jìn)行紫外誘變，然后再利用高濃度的乙硫氨酸篩選，得到了一株耐前體類似物的突變株，SAM產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高2.7倍，在15 L發(fā)酵罐中產(chǎn)量達(dá)6.1 mg/L.

3 原生質(zhì)體融合育種

原生質(zhì)體融合是去除細(xì)胞壁后，由原生質(zhì)膜包裹的球形裸細(xì)胞，然后再誘導(dǎo)裸細(xì)胞融合，從而實(shí)現(xiàn)全基因組交換，最后經(jīng)特定的篩選方法獲得含有雙親遺傳特征的融合子.原生質(zhì)體融合具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)重組頻率高；2)重組的親本范圍大，可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交；3)融合時(shí)親本染色體整體參與交換，集合優(yōu)良性狀的可能性更大[24].原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物育種中應(yīng)用相當(dāng)廣泛，主要包括提高產(chǎn)量或質(zhì)量、合成新物質(zhì)、改良菌種遺傳特性、優(yōu)化菌種發(fā)酵特性、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、融合原生質(zhì)體與細(xì)胞核及進(jìn)行遺傳分析等.

制備原生質(zhì)體主流做法是酶解法.由于不同微生物細(xì)胞壁組成不一樣，因此去壁需要的酶系、酶量也存在著差異.另外，培養(yǎng)基成分、菌齡和預(yù)處理等因素對(duì)原生質(zhì)體的制備也有影響[3].趙文超等[25]在探索制備高純度茂源鏈霉菌原生質(zhì)體懸液條件時(shí)，考察了二級(jí)菌絲培養(yǎng)基中所添加的甘氨酸的濃度對(duì)原生質(zhì)體制備率及再生率的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甘氨酸約為5 mg/L時(shí)，能得到最優(yōu)的原生質(zhì)體的制備率；二級(jí)菌絲培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期中期時(shí)，原生質(zhì)體的制備效果最佳.潘淼等[26]在研究高山被孢霉高產(chǎn)花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA)的原生質(zhì)體融合子篩選時(shí)，考察不同溶菌酶系對(duì)高山被孢霉原生質(zhì)體釋放的影響，發(fā)現(xiàn)在混合酶為蝸牛酶、纖維素酶、溶菌酶的基礎(chǔ)上加入幾丁質(zhì)酶，酶解3 h后，更有助于高山被孢霉原生質(zhì)體的釋放.

去除細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體能夠再生，能夠正常地生長和分裂.影響原生質(zhì)體再生的因素有很多，如再生培養(yǎng)基的組成、酶解條件等[27-28].一般會(huì)在培養(yǎng)基中添加一些營養(yǎng)因子，促進(jìn)細(xì)胞壁的再生.另外，酶濃度、酶解時(shí)間及溫度對(duì)原生質(zhì)體的再生亦有很大的影響.如果酶濃度太高且酶處理時(shí)間過長，細(xì)胞可能脫壁完全，導(dǎo)致再生率顯著降低.Liu等[29]考察了Rhizoctoniasolani原生質(zhì)體再生的培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)最佳的固體再生培養(yǎng)基為1% V-8，再生率達(dá)65%；最佳的液體固體再生培養(yǎng)基為10%土豆葡萄糖培養(yǎng)基，再生率達(dá)34%.

融合子檢出方法很多，可根據(jù)微生物及實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇，具體4種篩選方法見表1.傳統(tǒng)的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記篩選法，要首先篩選獲得營養(yǎng)缺陷型突變株，工作量較大，且營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記會(huì)使親本的優(yōu)良性狀喪失或降低，操作性不強(qiáng).其次，1984年，Bradshaw和Peberdy[30]首次利用抗藥性篩選融合子，將抗吖啶黃的Apergillusnidulans營養(yǎng)缺陷型和不抗吖啶黃的A.rugulosus菌株進(jìn)行融合，并涂布到含有吖啶黃的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，進(jìn)行融合體篩選.該方法相對(duì)于營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記篩選法更有針對(duì)性，然而微生物的抗藥性是由遺傳物質(zhì)決定的，不同微生物抗藥性差異較大，所以對(duì)微生物要求較高.再者，可利用熒光染色篩選融合子，將原生質(zhì)體染色，讓其帶有不同顏色的熒光探針，融合后可在熒光顯微鏡下直接挑取融合子.潘淼等[26]首次將流式細(xì)胞儀分選技術(shù)用于篩選高山被孢霉原生質(zhì)體的融合子，將用不同的熒光染料標(biāo)記雙親原生質(zhì)體，通過流式細(xì)胞儀分選融合子，成功獲得一株ARA高產(chǎn)菌株.最后，可采用滅活法檢出融合體，其原理是采用不同滅活方法(如熱、紫外、化學(xué)試劑等)滅活雙親本，使親本原生質(zhì)體死亡，但細(xì)胞融合后，由于死亡的親本之間可以互補(bǔ)，從而會(huì)再生出融合子[31-32].陳凱等[33]利用加熱-紫外滅對(duì)兩株親本哈茨木霉(Trichodermaharzianum)TW21990和木霉(Trichodermasp.)TW21990-1進(jìn)行原生質(zhì)體融合，成功篩選獲得遺傳穩(wěn)定并能防治番茄猝倒病的理想菌株Tpf-2，該融合子對(duì)引起的番茄猝倒病的這兩種腐霉均有防治效果，防治效果分別達(dá)到86.3%和85.7%.

表1 融合子檢出方法

4 基因工程育種研究及應(yīng)用概況

廣義的基因工程育種包括所有利用DNA重組技術(shù)將外源基因?qū)氲轿⑸锛?xì)胞，使后者獲得前者的某些優(yōu)良性狀，或者利用后者作為表達(dá)場所來生產(chǎn)目的產(chǎn)物的育種方法.然而，真正意義上的微生物基因工程育種應(yīng)該僅指那些以微生物本身為出發(fā)菌株，利用基因工程方法進(jìn)行改造而獲得的工程菌，或是將微生物A的某種基因?qū)氲轿⑸顱中，使B具有A的某些性狀或表達(dá)A的基因產(chǎn)物而獲得新菌種.

基因工程育種的特點(diǎn)是能夠按照人們的意愿事先設(shè)計(jì)和控制，并有能力在極端錯(cuò)綜復(fù)雜的生物細(xì)胞內(nèi)取出所需基因，并人為地將此目的基因在試管中進(jìn)行剪切、拼接、重組并轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞中，經(jīng)無性繁殖獲得增產(chǎn)數(shù)百數(shù)千倍的新型蛋白質(zhì)，能在動(dòng)植物和微生物間進(jìn)行任意的、定向的遠(yuǎn)緣雜交，這是基因工程最突出的優(yōu)越性[2].

4.1 基因組重排育種

基因重排育種技術(shù)(Genome Shuffling，簡稱GS)是21世紀(jì)初開發(fā)的一種針對(duì)整個(gè)基因組的定向菌種改良技術(shù)，它不需要事先了解菌株遺傳背景，基于傳統(tǒng)的誘變育種，實(shí)行遞推式細(xì)胞融合，累積正向突變菌株的優(yōu)良性狀，進(jìn)而提高微生物的正突變頻率及速度，目前已成為一種高效的改造微生物的育種方法[34].

融合體的檢出和鑒別是基因組重排育種技術(shù)中非常重要的一步.常用的重組體篩選方法可以根據(jù)基因組重排目的進(jìn)行設(shè)計(jì)，利用提高菌株對(duì)環(huán)境的耐受力，或設(shè)計(jì)含有高濃度的物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基來進(jìn)行篩選.Gérando等[35]利用兩輪基因組重排技術(shù)提高ClostridiumbeijerinckiiDSM 異丙醇的耐受性，從野生型耐受的35 mg/L提高到50 mg/L，最終重組體異丙醇和正丁醇的生產(chǎn)能力比野生型分別提高了23%和21%.重組體還可以利用鈍化法，即利用滅活法或營養(yǎng)缺陷型原生質(zhì)體來篩選.高血壓藥物纈沙坦的主要原材料L-纈氨酸應(yīng)用廣泛.Huang等[36]利用基因組重排技術(shù)處理BrevibacteriumflavumMDV1用于提高纈氨酸的產(chǎn)量，經(jīng)過2輪重排后，篩選出6株高產(chǎn)L-纈氨酸突變株，其中一株遺傳穩(wěn)定突變株MDVR2-21在搖瓶中發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)30.1 g/L，比MDV1高6.8倍.另外，成功進(jìn)行基因組重排的挑戰(zhàn)之一是缺乏高通量篩選方法，并能夠在重排后快速有效地鑒定所需表型[37].有的研究人員則借助縮小的微孔板培養(yǎng)體系，結(jié)合快速的篩選方法進(jìn)行重組子篩選.如，Chen等[38]利用96深孔板培養(yǎng)體系培養(yǎng)產(chǎn)雷帕霉素的融合體，結(jié)合酶標(biāo)儀的方法快速篩選高產(chǎn)重組體.筆者[39]利用24深孔板培養(yǎng)體系結(jié)合管碟法快速篩選技術(shù)，快速篩選產(chǎn)量較高的重組體.

4.2 易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是通過改變PCR條件，降低DNA復(fù)制的保真度，使堿基發(fā)生隨機(jī)錯(cuò)配，從而產(chǎn)生不同的突變體，再從該突變體文庫中篩選出具有目的表型的突變株.

閆鴿等[40]利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)蘇云金芽孢桿菌Cry1Ab13基因進(jìn)行隨機(jī)誘變，構(gòu)建突變文庫，以提高作物抗蟲性，最后成功獲得具有高效殺蟲活性突變株Cry1Ab13-1.通過序列分析表明，該突變株序列與原始?jí)A基序列有97.79%的一致性，有2個(gè)堿基發(fā)生了突變，導(dǎo)致該基因編碼的氨基酸序列中有2個(gè)氨基酸改變，該氨基酸序列與原始氨基酸序列有96.97%的一致性.該基因與已知過敏原的同源性低于35%，不存在致敏性.處理72 h時(shí)表達(dá)的目的蛋白對(duì)小菜蛾幼蟲的致死率達(dá)87.88%，明顯高于未突變基因?qū)φ战M的幼蟲死亡率；對(duì)亞洲玉米螟幼蟲的致死率達(dá)81.11%，而且存活的亞洲玉米螟幼蟲的生長發(fā)育受到明顯抑制.

4.3 啟動(dòng)子組合

啟動(dòng)子活性對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平有決定作用，但宿主細(xì)胞的原始啟動(dòng)子可能無法高效啟動(dòng)外源基因的表達(dá)，為此科學(xué)家借助啟動(dòng)子組合技術(shù)，通過合理組合增強(qiáng)子元件和核心啟動(dòng)子，來增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄能力，從而提高外源基因的表達(dá).

埃博霉素及其衍生物作為一種應(yīng)用前景廣闊的抗腫瘤藥物，已經(jīng)在臨床試驗(yàn)并在市場上推廣，它是由纖維堆囊菌產(chǎn)生的一種包含多種結(jié)構(gòu)及衍生物的大環(huán)內(nèi)酯類藥物.崔瀟文[41]為了改變纖維堆囊菌產(chǎn)量低、代時(shí)長的缺點(diǎn)，構(gòu)建了新的埃博霉素基因啟動(dòng)子簇，并將其插入至新藥物重要來源的黃色黏細(xì)菌中，結(jié)果顯示埃博霉素產(chǎn)量得到明顯提高，最高一株產(chǎn)量比原始菌株提高了113%.

4.4 基因序列改造與優(yōu)化

臨床醫(yī)學(xué)中的很多藥物是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將某藥物基因編碼序列轉(zhuǎn)到受體細(xì)胞中完成高表達(dá)，但由于外源基因與宿主細(xì)胞基因差別太大，外源基因的表達(dá)會(huì)受到嚴(yán)重的影響，因此，需要對(duì)基因序列進(jìn)行改造和優(yōu)化，從而實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞中的高表達(dá).

于榮榮[42]為了提高人干擾素α-2b基因在大腸桿菌中的表達(dá)量，將人干擾素編碼序列(CDS)改造成大腸桿菌高表達(dá)基因的偏好模式，并配以啟動(dòng)子區(qū)和終止子區(qū)序列以構(gòu)成完整基因，結(jié)果表明在克隆載體中，改造后的基因(GGB基因)表達(dá)量比編碼序列改造前的基因(GWGB基因)的表達(dá)量提高了55.1%，高表達(dá)SD基因的表達(dá)量比低表達(dá)的提高了52.8%；在表達(dá)載體中，編碼序列改造后的基因的表達(dá)量比改造前的提高了9.1%，高表達(dá)SD基因的表達(dá)量比低表達(dá)的提高了18.2%.

5 展望

遺傳育種方法在提高農(nóng)用抗生素、藥源抗生素及其他活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的產(chǎn)能方面取得了突出成果，藥源微生物的產(chǎn)率及生產(chǎn)性能大幅度提升.目前，大多數(shù)藥源微生物誘變育種是圍繞著如何提高菌株產(chǎn)能相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行的.

物理誘變、化學(xué)誘變等均屬于非定向誘變，對(duì)于藥源微生物改良有很好的成效，這類誘變技術(shù)往往是幾種誘變技術(shù)聯(lián)合使用，且越來越傾向于利用新型誘變技術(shù)開發(fā)性狀優(yōu)良的菌種；而且此類誘變技術(shù)為了提高突變頻率，研究人員會(huì)通過設(shè)計(jì)高效的篩選技術(shù)，利用篩選培養(yǎng)基或其他相關(guān)方法，從大量菌株庫中篩選正突變株.因此，非定向誘變的篩選技術(shù)在選育工作中占據(jù)了非常重要的地位，它是提高誘變效率的基礎(chǔ).基因工程技術(shù)是藥源微生物菌種選育中非常重要的定向誘變技術(shù)，它們不僅可以提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，獲得對(duì)某種環(huán)境的耐受性，改良藥源微生物，甚至可以引進(jìn)新的代謝途徑，從而改變菌種.雖然這些定向誘變育種技術(shù)比傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)的突變頻率高很多，但是仍然需要借助定向的篩選方法，高效快速的高通量篩選技術(shù)的建立仍然是定向誘變育種的瓶頸.

另外，藥源微生物誘變育種技術(shù)發(fā)展至今，真正利用誘變育種技術(shù)選育出的藥源微生物較少，無法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，主要原因便是菌種穩(wěn)定性不高，大部分在培養(yǎng)3代以后，突變株的穩(wěn)定性大大降低，很難維持原有的優(yōu)良性狀，這是科研工作者在實(shí)際選育中亟須解決的關(guān)鍵問題.隨著技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，更多更好的遺傳育種技術(shù)(代謝工程、反代謝工程等)將應(yīng)用到藥源微生物菌種選育上來，為拓寬藥源微生物資源相關(guān)領(lǐng)域提供新的研究方向.藥源微生物要想最終實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，解決藥物資源匱乏的困境，必須要通過發(fā)酵的檢驗(yàn)，菌種在滿足“穩(wěn)定”“經(jīng)濟(jì)”及“安全”前提下，與反應(yīng)器放大工藝相結(jié)合，結(jié)合發(fā)酵過程調(diào)控，實(shí)現(xiàn)人們對(duì)藥物的需求.