Pickering雙乳液法制備分子印跡聚合物分離分析玉米中的硝磺草酮

葛俊康，柏曉麗，郭昕鷺，祁爍霖，牛 娜，陳立鋼

（東北林業(yè)大學 化學化工與資源利用學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

硝磺草酮（Mesotrione）是一種可以抑制對羥苯基丙酮酸雙氧化酶活性的選擇性除草劑［1－2］，過量施加會給農作物安全帶來潛在危害，并通過食物鏈傳遞對人體健康產生影響［3］，因此檢測食品中殘留硝磺草酮的含量尤為重要。硝磺草酮在高溫條件下不穩(wěn)定，常用液相色譜法進行檢測，氣相色譜法進行分析時須采用間接法［4］，且在色譜分析前，必須經過操作復雜、過程繁瑣的樣品前處理過程，如固相萃取等［5］。

采用基質固相分散（MSPD）技術萃取分析玉米中的硝磺草酮，其提取、凈化和過濾可一步完成，減少了溶劑消耗量，簡化了分析步驟［6－7］。傳統(tǒng)的MSPD 分散劑在分散復雜樣品時，存在富集效果差、特異性低等問題［8］。分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymer，MIP）是一種對目標分子具有選擇性結合能力的材料，采用MIP 作為MSPD 的分散劑，可以提高對化合物的親和性，降低干擾物產生的影響［9］。

傳統(tǒng)制備MIP 的方法主要為本體聚合，此方法操作過程繁瑣，制備的MIP 形貌不規(guī)則［10］。與傳統(tǒng)制備方法相比，Pickering 雙乳液法制備的MIP 具有形貌規(guī)則，模板分子易洗脫等優(yōu)點［11－12］。在材料制備中，可引入價廉易得［13］的木質素作為穩(wěn)定粒子。木質素經過油酸改性處理后，可得到穩(wěn)定的W/O Pickering 乳液粒子，親水性木質素與疏水性木質素可以在界面形成無表面活性劑的穩(wěn)定的W1/O/W2Pickering雙乳液［14］。

本研究以硝磺草酮為模板分子，甲基丙烯酸甲酯為功能單體，木質素為穩(wěn)定粒子，采用Pickering雙乳液技術制備了硝磺草酮MIP，并通過動態(tài)吸附、靜態(tài)吸附及選擇性吸附，研究了其吸附行為。將MIP用作MSPD的分散劑對樣品進行處理，并通過高效液相色譜測定了玉米樣品中硝磺草酮的含量。本文的前處理方法快速，具有較高的選擇性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC－15C 高效液相色譜儀、XRD－600 X 射線衍射儀（日本島津公司）；Nicolet360 傅立葉變換紅外光譜儀（美國尼高力儀器公司）；JEM－6700 F 掃描電鏡（捷歐路科貿有限公司）；OCA 20 接觸角測量儀（北京奧德利諾有限公司）；KQ5200E 超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；HSY－B 恒溫振蕩搖床（常州金壇精達儀器制造有限公司）。

木質素（98%，山東龍力生物科技股份有限公司）；莠去津（98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；硝磺草酮（97%）、磺草酮（98%）（上海源葉生物科技有限公司）；色譜純乙腈（成都思為科學儀器有限公司）；甲基丙烯酸甲酯、偶氮二異丁酸二甲酯、二乙烯基苯、苯乙烯、油酸、冰醋酸、乙醇（天津市科密歐化學試劑有限公司），以上試劑均為分析純；實驗用水為去離子水；玉米樣品購于哈爾濱當地超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 分子印跡聚合物的制備準確稱取3.0 g木質素，加入30 mL去離子水中以形成木質素分散體，以濃氨水調至pH 11.0，待木質素完全溶解后，用1 mol/L 鹽酸調至pH 3.0，過濾并干燥，得親水性木質素。精密量取49 mL 苯乙烯溶液，加入2.0 g 親水性木質素，超聲處理3 min 后，再加入1 mL 油酸，并于50 ℃恒溫下磁力攪拌12 h，獲得疏水性木質素。取0.5 mL 甲基丙烯酸甲酯、1.5 mL 二乙烯基苯、40 mg 偶氮二異丁酸二甲酯和0.4 g 硝磺草酮溶于2.0 mL 疏水性木質素中，添加1 mL 0.1 mol/L NaCl 溶液和4.0 mL親水性木質素分散液（稱取1.0 g親水性木質素，分散在100 mL去離子水中，形成親水性木質素分散液），得W1/O/W2雙乳液，于65 ℃下反應12 h，用乙醇和水洗滌未反應產物并干燥，再經乙酸－甲醇溶液（體積比15∶85）索氏提取除去產物中的模板分子，干燥得MIP，制備過程如圖1所示。

圖1 MIP的制備過程示意圖Fig.1 Schematic illustration of the preparation process of MIP

非分子印跡聚合物（NIP）的制備不添加模板分子，其余步驟與上述相同。

1.2.2 吸附實驗靜態(tài)吸附實驗：將20 mg MIP（或NIP）加入8 mL 不同質量濃度（5、10、20、50、80、100、120、150、200μg/mL）硝磺草酮標準溶液中并設置空白組，于25 ℃恒溫水浴中振蕩24 h；動態(tài)吸附實驗：將20 mg MIP（或NIP）加入9 組8 mL 200μg/mL 的硝磺草酮標準溶液中并設置空白組，于25 ℃恒溫水浴中振蕩不同時間（1、2、5、10、20、30、45、60、90 min）；選擇性吸附實驗：精確稱取3份20 mg MIP（或NIP），分別加入8 mL 200μg/mL硝磺草酮標準溶液、莠去津標準溶液、煙嘧磺隆標準溶液中，于25 ℃恒溫水浴中振蕩24 h。吸附后溶液以7 000 r/min 離心5 min，取上清液過濾，進行HPLC檢測。

1.2.3 玉米中硝磺草酮的基質固相分散萃取精確稱取0.2 g玉米樣品和0.3 g MIP加入瑪瑙研缽中研磨10 min，再取已裝有玻璃棉墊底的萃取柱（5 mL），將研磨好的樣品放入萃取柱，樣品上方放置適量玻璃棉并壓實。以2 mL 20%甲醇水溶液淋洗，并用5 mL 5%乙酸乙腈溶液洗脫目標物，流速為1 mL/min，洗脫液用氮氣吹干后于0.5 mL色譜流動相中溶解，待測。

1.2.4 色譜條件Hypersil ODS2色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動相：乙腈－水（體積比85∶15）；流速1.0 mL/min；進樣體積20μL；檢測波長233 nm。

2 結果與討論

2.1 分子印跡聚合物的表征

MIP 的傅里葉紅外光譜及掃描電鏡圖見圖2。798 cm－1和882 cm－1處的吸收峰為C—H 苯環(huán)的彎曲振動；1 608 cm－1處的吸收峰由C—C 苯環(huán)的振動所產生，說明二乙烯基苯成功參與了印跡聚合反應。1 745 cm－1處的吸收峰代表C====O 拉伸振動，說明甲基丙烯酸甲酯成功參與反應。在波長3 137 cm－1和3 622 cm－1位置的強振動表明木質素含有苯酚和脂肪族羥基（圖2A）。而MIP和NIP具有類似的紅外光譜圖，表明模板分子已成功洗脫。由掃描電鏡圖可以看出MIP 形貌規(guī)則，且顆粒尺寸較大（圖2B），有助于基質固相分散過程，避免柱壓過高。

對制備的親水性木質素、疏水性木質素及MIP 的接觸角進行測量（圖2C），結果發(fā)現(xiàn)三者的接觸角大小分別為71.5°、99.9°、149.3°，這是因為未改性的木質素親水，有助于形成水包油乳液；而油酸吸附到木質素表面后，使得木質素具有疏水性；在聚合反應后，由于二乙烯基苯和甲基丙烯酸甲酯的加入，致使MIP的接觸角最大，其疏水性表面有利于吸附低水溶性且疏水的硝磺草酮［15］。

Pickering雙乳液法制備的MIP的XRD光譜圖在2θ=20°處出現(xiàn)一個光滑的衍射峰，表明該MIP是無定形物質（圖2D）。

圖2 MIP的紅外光譜圖（A）和掃描電鏡圖（B），親水性、疏水性木質素以及MIP的接觸角（C）與MIP的X射線衍射譜圖（D）Fig.2 Infrared spectrum（A）and scanning electron microscope（B）of MIP，contact angle of hydrophilic，modified hydrophobic lignin and MIP（C），and X-ray diffraction pattern of MIP（D）

2.2 吸附等溫線的測定與Scatchard分析

由圖3A 可見，無論是MIP 還是NIP，對硝磺草酮的吸附量均隨其濃度遞增，但在相同濃度下，MIP的吸附效果遠高于NIP，表明MIP上所形成的分子印跡空穴使其特定識別和吸附模板分子的能力增強。采用Scatchard分析聚合物的吸附情況［16］，公式如下：

圖3 MIP和NIP的吸附等溫線（A），MIP（B）和NIP（C）的Scatchard分析曲線Fig.3 Adsorption isotherms of MIP and NIP（A），Scatchard analysis curves of MIP（B）and NIP（C）

式中，Q為聚合物吸附硝磺草酮的容量大?。╩g/g）；C為平衡時硝磺草酮的質量濃度（μg/L）；Qmax為聚合物吸附硝磺草酮的最大容量（mg/g）；Kd為結合位點的解離常數（mg/L）。

以Q/C對Q作圖得Scatchard 分析曲線，如圖3B 所示，MIP 的Scatchard 分析曲線具有兩種不同的斜率，表明MIP對硝磺草酮的吸附具有兩種不同的結合位點，由兩條擬合直線可求得截距和斜率分別為：Qmax1= 32.31 mg/g，Kd1= 116.28 mg/L；Qmax2= 89.99 mg/g，Kd2= 413.22 mg/L；則本實驗制備的MIP 對硝磺草酮的吸附容量（Qmax1+Qmax2）為122.30 mg/g。此外，NIP 的Scatchard 分析曲線（圖3C）具有良好的線性關系，表明NIP 對于硝磺草酮的吸附是均勻的，僅存在一個結合位點。由擬合直線的截距和斜率求得：Qmax=31.62 mg/g，Kd=270.27 mg/L。比較實驗結果可知，MIP的最大表觀結合量遠高于NIP。

2.3 吸附動力學曲線的測定

從圖4A 可知，MIP 和NIP 對硝磺草酮的吸附能力隨時間延長而增強，而MIP 的硝磺草酮吸附量始終大于NIP。由于分子印跡孔穴較多，最初的40 min 內MIP 的吸附率很高，而60 min 后，大多數印跡孔穴已被填充，因此MIP 的吸附速率達到平衡和穩(wěn)定。40～60 min 的快速平衡表明MIP 結合位點對硝磺草酮具有良好的親和力。

圖4 MIP和NIP的動力學吸附（A）、準一級動力學（B）和準二級動力學（C）Fig.4 Kinetic adsorption（A），quasi first order kinetics（B）and quasi second order kinetics（C）of MIP and NIP

分別采用準一級、準二級動力學反應對MIP和NIP進行擬合計算［17－18］，擬合方程如下：

式中，Qt為不同時間的吸附量（mg/g）；Qe為平衡時的吸附量（mg/g）；k1、k2分別是準一級、準二級動力學的速率常數（min－1）。

通過ln（Qe－Qt）對t擬合計算，獲得準一級動力學方程，如圖4B所示，MIP和NIP的線性方程分別為y=－0.008 7x+3.435，r2=0.879 1；y=－0.014 9x+2.577 2，r2=0.781 3；以t/Qt對t擬合可獲得如圖4C所示的MIP、NIP 的準二級動力學方程：y=0.041 8x+0.912 7，r2=0.999 1；y=0.075 8x+2.158 9，r2=0.999 9。由準一級和準二級擬合曲線的r2分析比較可得，MIP和NIP吸附硝磺草酮的過程較切合準二級動力學模型。

2.4 吸附選擇性的研究

本實驗采用磺草酮為類似物，莠去津為參照物，探究MIP的選擇性吸附性能，其分子結構如圖5A所示。結合圖5B 及表1數據可見，在吸附硝磺草酮的過程中，MIP 對硝磺草酮的吸附能力遠大于NIP，表明制備的MIP對硝磺草酮具有更好的選擇吸附性；MIP對磺草酮的吸附能力也明顯高于NIP，這歸因于磺草酮和硝磺草酮的結構相似。為了深入研究MIP的選擇能力，通過公式（4）、（5）、（6）計算選擇性參數；得其分配系數（δ）、選擇因子（α）和相對選擇因子（β）關系如下：

圖5 莠去津、硝磺草酮、磺草酮的結構式（A）與MIP和NIP的選擇性吸附結果（B）Fig.5 Structural formula of atrazine，mesotrione and sulcotrione（A）and their selective adsorption results by MIP and NIP（B）

式中，Q和C分別代表聚合物的吸附量以及溶液原濃度，δ1和δ2分別代表硝磺草酮和莠去津的靜態(tài)分布系數，α1和α2為聚合物的選擇性系數。

如表1 所示，MIP 的相對選擇因子β為2.510，表明成功制備了選擇性較高的聚合物。這是由于MIP 中的互補孔穴可以特異性識別模板分子。但莠去津與孔穴不能形成互補，所以其吸附量在MIP 和NIP上無明顯區(qū)別。

表1 MIP和NIP選擇性系數比較Table 1 Comparison of MIP and NIP selectivity coefficients

2.5 基質固相分散條件的選擇

2.5.1 樣品比例的選擇實驗研究了分散劑與樣品的質量比（1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1）對結果的影響。結果顯示：分散劑與玉米樣品質量比選擇3∶2 和2∶1 時，硝磺草酮的回收率均較大（分別為95.8%、96.2%）。為節(jié)約分散劑用量，最終選擇分散劑與樣品的質量比為3∶2。

2.5.2 研磨時間的確定研磨可使分散劑與待提取樣品充分接觸，實驗考察了不同研磨時間（2、5、10、15 min）時硝磺草酮的回收率。發(fā)現(xiàn)研磨10 min 時回收率最大（96.8%），繼續(xù)延長研磨時間回收率無明顯提高，因此實驗選擇研磨10 min。

2.5.3 淋洗劑、洗脫劑及其最佳體積的確定實驗考察了5 種（水、20%乙腈水溶液、20%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液、50%甲醇水溶液）淋洗劑對MIP 吸附選擇性的影響。結果發(fā)現(xiàn)，純水和20%甲醇水溶液得到的硝磺草酮回收率最大（分別為97.6%、97.3%），但純水作為淋洗劑時，很難洗去雜質，故最佳淋洗劑選用20%甲醇水溶液。實驗進一步考察了20%甲醇水溶液用量（1～7 mL）對結果的影響，發(fā)現(xiàn)2 mL用量時硝磺草酮的回收率最大。

實驗考察了甲醇、乙酸、乙腈、1%乙酸乙腈、2%乙酸乙腈、5%乙酸乙腈為洗脫劑時對檢測的影響。結果發(fā)現(xiàn)：5%乙酸乙腈溶液的洗脫效果最佳（96.3%），且其用量為1～5 mL時，回收率升高較快，用量為5～7 mL時，回收率保持較高值且趨于穩(wěn)定。為節(jié)約試劑，最佳洗脫劑體積選擇5 mL。

2.6 分析方法的評價與應用

在最佳檢測條件下，得到硝磺草酮的回歸方程為：A=111 872c－1 110.7（A為峰面積；c為硝磺草酮的含量，μg/g），r2=0.999 8，線性范圍為0.05～10μg/g，檢出限（S/N=3）為0.018μg/g。根據食品安全國家標準，玉米中硝磺草酮的最大殘留值為0.5 mg/kg［19］，所以本方法符合檢測要求。為進一步評估方法準確度和精密度，使用本方法對加標玉米樣品進行檢測，得到回收率為97.0%～98.4%，相對標準偏差（RSD）為0.70%～5.6%。其加標樣品的色譜圖如圖6所示。

采用本方法測定哈爾濱當地超市市售3 種玉米中的硝磺草酮含量。結果顯示，3 種樣品中均未檢出硝磺草酮，隨后對玉米樣品在3 個水平下（0.05、0.30、5.00 μg/g）進行加標回收實驗，得其回收率為97.5%～98.6%，RSD 為2.5%～4.8%。因此本實驗所采用的檢測方法在分離分析硝磺草酮方面具有一定的應用價值。

3 結 論

本文以硝磺草酮為模板分子，木質素為穩(wěn)定粒子，采用Pickering 雙乳液法制備了MIP，對其進行靜態(tài)吸附、動態(tài)吸附、選擇性吸附性能研究，并將其作為MSPD 的分散劑，萃取玉米中的硝磺草酮。結果顯示：MIP 對硝磺草酮具有良好吸附作用，且動態(tài)吸附過程符合準二級動力學反應模型。本實驗通過使用分子印跡聚合及基質固相分散技術，提高了分析檢測效率，使木質素得到有效利用，有很好的實際應用價值。