HPLC 法測(cè)定煨姜中6-姜辣素的含量

佘永紅，楊德泉

湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 吉首 416000

生姜為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鮮根莖。生姜味辛，微溫，歸肺、脾、胃經(jīng)。生品解表散寒的功效較強(qiáng)，煨制后緩而性降，增強(qiáng)溫中止嘔、和胃降逆的作用，明·李時(shí)珍《本草綱目》［1］：“生用發(fā)散，熟用和中”。煨姜具有溫中止嘔、驅(qū)寒止痛功效，適于胃寒嘔吐及胃腹冷痛、泄瀉等癥，是臨床辨證施治常用品種，也是脾胃科的常用中藥飲片。臨床研究證實(shí)［2］，煨姜湯方劑能夠減輕化療導(dǎo)致的消化道不良反應(yīng)，不影響腫瘤對(duì)化療的反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量；煨姜還應(yīng)用于治療胃息肉切除術(shù)后出現(xiàn)的反復(fù)胃脘受風(fēng)寒則易腹痛而瀉；老年患者腸癌術(shù)后又做化療，致腸胃受損，脾運(yùn)失健，氣津兩傷；受涼后易反酸噯氣，呃逆頻頻等方面［3］。含煨姜成分的逍遙丸（散），用于治療抑郁癥、眼科疾病、精神疾病、神經(jīng)衰弱、黃褐斑、青春期女生月經(jīng)不調(diào)及其他婦科疾病、消化系統(tǒng)疾病等方面［4-13］。煨姜之性既不及生姜之太散，又無干姜之過燥，故略兼二者之長(zhǎng)，善“治胃寒，泄瀉，吞酸”（《會(huì)約醫(yī)鏡》）［14］。羅婷等用HPLC 測(cè)定6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的含量，結(jié)果顯示生姜炮制過后的煨姜中這三個(gè)成分的含量均低于生姜［15］，說明煨姜的成分分布和含量水平與臨床應(yīng)用療效直接相關(guān)。

生姜及其炮制品干姜、炮姜、姜炭均在《中國(guó)藥典》2020年版一部中收載，而煨姜未被收載。有關(guān)煨姜的各省炮制規(guī)范，只有山東省單列煨姜，另外云南、廣西、甘肅、湖南、重慶、上海、江西、貴州、江蘇、河南各省炮制規(guī)范在生姜項(xiàng)下附煨姜［16］，且以上各省炮制規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)中均無煨姜的含量測(cè)定。《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范（2010年版）》煨姜列在生姜項(xiàng)下［17］，為完善和提升煨姜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保煨姜的質(zhì)量，采用HPLC 法研究測(cè)定煨姜中活性成分6-姜辣素的含量，為定量控制煨姜飲片的質(zhì)量提供有效手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（檢測(cè)器：VWD）；島津電子天平AUW220D；ZOOMWO Water Environmental超純水機(jī)；KM5200D 中文液晶超聲波清洗器（功率200 W，40 kHz）；XMTD-4000 電熱恒溫水浴鍋。

1.2 試藥

6-姜辣素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量測(cè)定用，批號(hào)：111833-2020007，純度：99.3%）；甲醇、乙腈為色譜純；水為純凈水；其他試藥均為分析純。

1.3 樣品

煨姜飲片9 批（湖南振興中藥有限公司，批號(hào)：19092909-1、19092909-2、19092909-3；湖南衡岳中藥飲片有限公司，批號(hào)：19112418-1、19112418-2、19112418-3、20210522-1、20210522-2、20210522-3）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈-甲醇-水（40∶5∶55）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；柱溫30 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取6-姜辣素對(duì)照品，分別精密稱定112.35 mg、108.48 mg，置50 mL 棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液（2.231 3 mg/mL，2.154 4 mg/mL）。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL，置20 mL 容量瓶中，分別加甲醇稀釋成濃度為0.111 56 mg/mL、0.107 72 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號(hào)篩）約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液8 μL 與供試品溶液20 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣，6-姜辣素分離度大于1.5，理論板數(shù)均在18 000 以上。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上檢出色譜峰且空白溶液無干擾。見圖1～3。

圖1 6-姜辣素對(duì)照品色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

圖2 煨姜樣品色譜圖

圖3 空白溶液色譜圖

精密吸取濃度為2.231 3 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，依次加甲醇稀釋成濃度為5.578 2、11.156 4、22.312 7、33.469 1、55.781 8、111.563 6、223.127 1 μg/mL 的對(duì)照品溶液，精密吸取上述對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，以峰面積Y 值為縱坐標(biāo)，濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為：Y=11.088X-1.359 5，r=1.000 0。結(jié)果表明：6-姜辣素對(duì)照品在5.578 2～223.127 1 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一煨姜供試品溶液（批號(hào)19092909-2，湖南振興中藥有限公司），連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次20 μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算RSD（n=6）為0.85%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一煨姜供試品溶液（批號(hào)19092909-2，湖南振興中藥有限公司），分別于配制后的0、3、12、18、24 h，精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，煨姜的RSD（n=5）為0.67%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一煨姜供試品溶液（批號(hào)19092909-2，湖南振興中藥有限公司），依法制備6 份供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算，含量分別為4.159 6、4.178 5、4.212 0、4.102 5、4.114 3、4.102 0 mg/g，平均含量為4.144 8 mg/g，RSD 為1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 耐用性試驗(yàn)

采用擬定的方法，使用不同的液相色譜儀、兩個(gè)不同的色譜柱對(duì)同一批樣品進(jìn)行測(cè)定。（1）儀器：Agilent 1260 Infinity，檢測(cè)器VWD；色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm×5 μm），型號(hào)：880975-902，Agilent 公司。（2）儀器：Agilent 1260 Infinity Ⅱ，檢測(cè)器 DAD；色譜柱：Acclaim ? Polar Advantage II C18（250 mm×4.6 mm×5 μm），型號(hào)：JADE-PAK，Thermo 公司。平行測(cè)定同一生產(chǎn)企業(yè)的3 份樣品，結(jié)果3 份樣品6-姜辣素含量分別為：（1）0.36%、0.42%、0.36%；（2）0.36%、0.43%、0.36%。（1）與（2）測(cè)定的3 份含量結(jié)果之間的RSD 分別為0、1.7%，0。結(jié)果表明，本方法耐用性良好。

2.10 含量測(cè)定方法比較實(shí)驗(yàn)

將煨姜樣品按《中國(guó)藥典》2020年版一部炮姜含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液的制備方法［18］，制備煨姜供試品溶液：取本品粉末（過三號(hào)篩）約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理（功率100 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

按上述方法制備得到的供試品溶液，按“2.1”色譜條件實(shí)驗(yàn)，分別精密吸取對(duì)照品溶液8 μL 與供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 按炮姜6-姜辣素含量項(xiàng)下制備煨姜供試品溶液測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，用炮姜含量測(cè)定項(xiàng)下的制備供試品溶液方法，制備煨姜供試品溶液，所測(cè)得的含量，與本研究煨姜含量測(cè)定方法測(cè)定的含量基本一致。本研究含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定。

2.11 回收率試驗(yàn)

取已測(cè)定含量的同一煨姜供試品（批號(hào)19092909-2，湖南振興中藥有限公司）（含6-姜辣素4.144 8 mg/g）約0.4 g（9 份），精密稱定，按干燥品計(jì)算（水分為12.52%）置錐形瓶中，按80%、100%和120%的水平用刻度吸管精密加入濃度為2.231 3 mg/mL 的6-姜辣素對(duì)照品適量（見表2），依法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算結(jié)果，平均加樣回收率為99.4%。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表

2.12 樣品含量測(cè)定結(jié)果

對(duì)企業(yè)提供的9 批生姜煨姜樣品進(jìn)行了含量測(cè)定，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別按外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，結(jié)果見表3。

表3 煨姜6-姜辣素含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 提取方法的選擇

比較加熱回流提取和超聲提取的方法，因加熱回流提取比超聲提取的濾過速度要快，故選擇加熱回流提取。

3.2 對(duì)煨姜炮制工藝的建議

《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范》（2010年版）煨姜炮制：“取生姜塊，用草紙包裹濕潤(rùn)后，照煨制法（附錄Ⅰ）煨至紙變焦黃色”。批號(hào)為19092909-1、19092909-2、19092909-3 的煨姜采用傳統(tǒng)草紙包裹，直接在麥麩火堆煨制，操作過程中產(chǎn)生煙霧，對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染。本研究對(duì)煨姜的總灰分進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果用傳統(tǒng)草紙包裹煨制的煨姜總灰分的平均值為7.50%，采用烤箱煨制的煨姜總灰分為3.55%，顯示烤箱煨制方法更加潔凈。另外，傳統(tǒng)草紙包裹煨制方法，在夏天還存在炮制人員難以操作、火候不易控制、產(chǎn)品易焦化等缺點(diǎn)。因此，建議煨姜標(biāo)準(zhǔn)增加麥麩烘箱煨姜方法，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需要。

本次研究參照《中國(guó)藥典》2020年版一部中生姜飲片含量測(cè)定的色譜條件［18］，測(cè)定煨姜中活性成分6-姜辣素的含量，所建立的煨姜6-姜辣素的含量測(cè)定方法，快速，準(zhǔn)確，高效，靈敏，為煨姜的質(zhì)量控制提供了有效的檢測(cè)手段。