不同染色方法對兩種禾本科牧草菌根侵染率的影響

張海娟， 蘆光新*， 范月君， 周華坤， 周學(xué)麗， 竇聲云， 顏琿璘， 馬 坤， 趙陽安

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2.中國科學(xué)院西北高原生物研究所， 青海省寒區(qū)恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點實驗室， 青海 西寧 810008； 3.青海省草原改良試驗站， 青海 共和 813000;4.青海農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院， 青海 湟源 812100)

叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌能與禾本科(Graminoids)、豆科(Leguminosae)、莎草科(Sedges)等植物互作形成菌絲(Hyphae)、泡囊(Vesicles)、孢子(spore)、叢枝(Arbuscular)等菌根結(jié)構(gòu)[1]。菌根在調(diào)控植物株高和生物量[2-4]，促進(jìn)植物根系發(fā)育和對氮磷等養(yǎng)分的吸收[5-8]，增強(qiáng)植物對低溫[9]、干旱[10]、鹽堿[11-12]及重金屬[13-14]等非生物脅迫的抵抗和耐受能力，以及改善土壤養(yǎng)分狀況及修復(fù)嚴(yán)重污染的土壤等方面發(fā)揮著重要的作用[15-16]。近年來，由于受到氣候變化和人類活動等干擾，大面積高寒草地出現(xiàn)不同程度退化，叢枝菌根真菌也被逐漸用于退化高寒草地恢復(fù)治理中，而適宜的草種和菌種是退化高寒草地植被和土壤得以恢復(fù)的必要物質(zhì)基礎(chǔ)[17]。禾本科牧草如‘川草2號’老芒麥(Elymussibiricus‘Chuancao No.2’)和‘阿壩’垂穗披堿草(Elymusnutans‘Aba’)等因具有抗寒、耐貧瘠等特點，是高寒地區(qū)人工草地建植、天然草地補(bǔ)播改良和退化草地恢復(fù)治理中重要的牧草資源[18-20]。

菌根侵染率表示植物受AM真菌侵染的程度，其檢測值會受染色效果的影響[21]，檢測菌根侵染率常用的染色方法有酸性品紅、臺盼藍(lán)和墨水醋染色法。不同研究者因植物種類等不同而采用了不同的染色方法，其菌根觀測效果亦有所差異。房鳳如[22]、景躍波等[23]和晏梅靜等[24]用臺盼藍(lán)分別染色楊樹(Populus)、杉木林(Cunninghamialanceolata)和桑樹(Morusalba)根部的AM真菌后，能觀察到孢子、菌絲和泡囊等結(jié)構(gòu)；毛圓圓[25]、蔡柏巖等[26]、邵金誠等[27]和李文彬等[28]用酸性品紅分別染色香根草(Vetiveriazizanioides)，黃檗(Phellodendronamurense)，甘蔗(Saccharumofficinarum)和高羊茅(Festucaarundinacea)根系A(chǔ)M真菌后，也能清晰觀察到菌絲、孢子和泡囊結(jié)構(gòu)；汪茜等[29]和廖楠等[30]用墨水醋染色生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)和甘蔗根系A(chǔ)M真菌后，亦能清楚觀察到菌絲、泡囊和孢子結(jié)構(gòu)。

目前，對禾本科牧草接種AM真菌檢測菌根侵染效應(yīng)的研究已有很多，涉及的禾本科牧草有早熟禾(Poapratensis)[31-32]、黑麥草(Loliumperenne)[33-36]、狗牙根(Cynodondactylon)[37]、狼尾草(Setariaviridis)[38]、羊草(Leymuschinensis)[39]、冷蒿(Artemisiafrigida)[40]、高羊茅(Festucaarundinacea)[12]等，但未見對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草接種AM真菌的研究。為此，本研究通過對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草接種根內(nèi)球囊霉(Glomusintraradices，GI)和摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)，探討2種禾本科牧草與AM真菌的共生情況，同時探討了酸性品紅、臺盼藍(lán)和墨水醋3種染色方法對菌根侵染率的影響，以期為禾本科牧草菌根侵染率的測定提供技術(shù)指導(dǎo)，同時也為“植被-微生物”聯(lián)合生態(tài)修復(fù)技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1禾本科牧草 試驗材料為環(huán)青海湖地區(qū)引種的‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草，購自四川省草原科學(xué)研究院。播種前，供試牧草種子均用10%H2O2消毒10 min，無菌水清洗干凈后用濾紙吸干水分備用。

1.1.2供試菌劑 供試AM真菌為由長江大學(xué)吳楚教授饋贈的根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉，均為包含根段、叢枝、菌絲和孢子等的混合物。

1.1.3培養(yǎng)基質(zhì) 培養(yǎng)基質(zhì)為青海大學(xué)農(nóng)牧試驗田壤土和河沙(3∶1)的混合物，養(yǎng)分含量見表1，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后使用(121℃，2 h)。

表1 試驗田土壤養(yǎng)分含量

1.1.4培養(yǎng)盆缽 培養(yǎng)盆缽為規(guī)格18 cm × 15 cm × 13 cm(上口徑×下口徑×高)的塑料花盆，使用前用75%酒精反復(fù)擦拭消毒。

1.1.5染色劑 酸性品紅：0.15 g酸性品紅+ 100 mL乳酸+ 100 mL甘油+ 100 mL蒸餾水；臺盼藍(lán)：0.05 g臺盼藍(lán)+ 100 mL乳酸+ 100 mL甘油+ 100 mL蒸餾水；墨水醋：5 mL Quink牌純黑墨水+ 95 mL家用白醋。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置接種根內(nèi)球囊霉(GI)、接種摩西球囊霉(GM)和不接種(Control check，CK)3個處理，每個處理4次重復(fù)，每種牧草有12盆，共有24盆，隨機(jī)排列，隔天依次調(diào)換花盆位置，確保各盆所處的培養(yǎng)條件一致。稱取400 g滅菌基質(zhì)裝于經(jīng)消毒處理的塑料花盆中，噴灑適量無菌水，準(zhǔn)確稱取10 g供試AM真菌菌劑均勻的鋪撒于上面，覆蓋60 g滅菌基質(zhì)，每盆澆100 mL無菌水，然后以30粒每盆的播種密度分別播種2種禾本科牧草種子，覆土40 g后再次噴少量無菌水，出苗7 d后間苗并定苗至20株每盆。盆栽試驗在青海大學(xué)農(nóng)牧實驗樓草地微生物實驗室進(jìn)行，栽培周期為2個月(2021年1月13日至2021年3月13日)。試驗期間，自然采光，白天溫度為(25±2)℃，夜間(19±2)℃。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1孢子密度 栽培2個月后，每個處理隨機(jī)稱取20 g風(fēng)干后混勻的根際土，采用濕篩傾析-蔗糖離心法式和光學(xué)顯微鏡下觀察孢子形態(tài)并用直接計數(shù)法計數(shù)

1.3.2菌根侵染率 取1 g宿主植物的新鮮根樣，抖落根際土后輕輕地用水漂洗干凈，剪成1 cm左右的根段，置于甲醛-乙酸-乙醇固定液(Formaldehyde acetic acid，F(xiàn)AA)中固定過夜，次日取出適量根系洗凈后分別用臺盼藍(lán)、酸性品紅和墨水醋染色法進(jìn)行染色[27]。染色完成后隨機(jī)選取10條根段，完成制片，3次重復(fù)。做好的壓片通過光學(xué)顯微鏡觀察孢子、菌絲、泡囊等菌根結(jié)構(gòu)，染色質(zhì)量較好的壓片在熒光顯微鏡下拍照，然后按Biermann等的方法計算菌根侵染率[41]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件整理數(shù)據(jù)，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 孢子密度

通過濕篩傾析-蔗糖離心法分離獲得的孢子在體式和光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)如圖1所示?？梢钥闯觯瑑煞NAM真菌孢子形態(tài)多為不規(guī)則球形，淺黃至黃褐色。直接觀測計數(shù)后分析發(fā)現(xiàn)，不接種的對照處理均無孢子出現(xiàn)(圖1a，1 d)，而接種的處理均能分離出孢子(圖1b，1c，1e，1f)。‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草分別接種根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉2個月后，‘川草2號’老芒麥根際孢子密度分別為119個·(20 g)-1和145個·(20 g)-1，‘阿壩’垂穗披堿草根際孢子密度分別為63個·(20 g)-1和74個·(20 g)-1，且‘川草2號’老芒麥接種處理的孢子密度顯著高于‘阿壩’垂穗披堿草(P<0.05)(表2)。

圖1 2種AM真菌接種處理下2種禾本科牧草根際孢子顯微形態(tài)

表2 接種對2種禾本科牧草根際孢子密度的影響

2.2 不同染色方法對菌根侵染率的影響

2.2.1臺盼藍(lán)染色的菌根結(jié)構(gòu)觀測效果 由圖2可知，用臺盼藍(lán)染色法對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉進(jìn)行水浴加熱染色后，除了對照外，均能清晰的觀察到根皮層AM真菌的泡囊、孢子和菌絲結(jié)構(gòu)，說明臺盼藍(lán)染色劑利于泡囊等菌根結(jié)構(gòu)著色，利于菌根結(jié)構(gòu)的觀察。可以看出，未接種AM真菌的處理無菌根侵染的跡象(圖2A，2D)，而接種的處理則被不同程度侵染(圖2B，2C，2E，2F)。

圖2 臺盼藍(lán)染色劑對2種禾本科牧草根系2種AM真菌的染色效果

2.2.2酸性品紅染色的菌根結(jié)構(gòu)觀測效果 用酸性品紅對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉染色后發(fā)現(xiàn)，除了不接種的對照處理外(圖3A，3D)，在光學(xué)顯微鏡下均能較為清晰的觀察到泡囊、菌絲等菌根結(jié)構(gòu)(圖3B，3C，3E，3F)，但其效果略次于臺盼藍(lán)染色劑染色的效果。因此，在實際研究中，可根據(jù)試劑的存儲情況等進(jìn)行選擇。2種染色劑也可以交叉使用，視覺效果會更佳。

圖3 酸性品紅染色劑對2種禾本科牧草根系2種AM真菌的染色效果

2.2.3墨水醋染色的菌根結(jié)構(gòu)觀測效果 使用5%的墨水醋染色劑對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉染色后發(fā)現(xiàn)，在光學(xué)顯微鏡下很難觀察到菌根結(jié)構(gòu)(圖4)，隨后進(jìn)行的多次染色試驗效果亦是如此?？梢?，墨水醋染色法對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉的染色效果差，會影響菌根侵染率的測定，實際研究中應(yīng)慎選。

圖4 墨水醋染色劑對2種禾本科牧草根系2種AM真菌的染色效果

2.2.4不同染色方法對菌根侵染率的影響 3種染色方法對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草菌根侵染率的影響存在差異(表3)。用臺盼藍(lán)染色后，根內(nèi)球囊霉對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率分別為66.3%和55.3%，摩西球囊霉對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率分別為71.3%和73.3%；用酸性品紅染色后，根內(nèi)球囊霉對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率分別為63.0%和49.1%，摩西球囊霉對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率分別為65.3%和63.0%；而用墨水醋染色的菌根侵染率均為0。經(jīng)分析，根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉對‘川草2號’老芒麥的菌根侵染率之間差異不顯著，對‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率之間差異顯著(P<0.05)；臺盼藍(lán)和酸性品紅染色法對2種禾本科牧草菌根侵染率的影響差異均不顯著，與墨水醋染色的菌根侵染率之間差異顯著(P<0.05)。

表3 3種染色方法對2種禾本科牧草菌根侵染率的影響

3 討論

3.1 不同AM真菌對不同植物的接種效應(yīng)

本研究結(jié)果顯示根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率存在差異，這可能是由這2種禾本科牧草對菌根的依賴性不同所致，也可能是因為2種牧草根部產(chǎn)生的分泌物對2種AM真菌的刺激程度不一樣引起的。許多相關(guān)研究與本研究結(jié)果一致，如肖雪毅等對黑麥草(Loliumperenne)分別接種3種不同的AM真菌后侵染率分別為2%，14%和3%[35]；楊婷等對紫花苜蓿(Medicagosativa)和黑麥草分別接種蘇格蘭球囊霉(Glomuscaledonium)后紫花苜蓿菌根侵染率大于黑麥草[36]；王麗萍等測得摩西球囊霉對黑麥草的菌根侵染率在33.33%～66.67%之間[15]；馮海艷等用摩西球囊霉和根內(nèi)球囊霉分別接種黑麥草后測得菌根侵染率分別為34%和38%[42]。這些研究結(jié)果都表明，不同AM真菌對黑麥草的侵染率存在差異。馬放等用摩西球囊霉和根內(nèi)球囊霉分別接種早熟禾(Poapratensis)后，測得菌根侵染率分別為49.49%和41.81%[31]；楊海霞等用2種不同的AM真菌分別接種高羊茅(Festucaarundinacea)和草地早熟禾發(fā)后發(fā)現(xiàn)菌根侵染率草地早熟禾>高羊茅，分別為17.0%，19.5%和57.7%，39.4%[12]；王立等對早熟禾分別接種了根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉后發(fā)現(xiàn)摩西球囊霉的菌根侵染率高于根內(nèi)球囊霉，分別為35.71%和43.27%[32]?？梢姡缡旌痰木秩韭室惨駻M真菌類型不同而呈現(xiàn)差異。對其他植物的菌根侵染率亦是如此，如賈振宇等對羊草(Leymuschinensis)分別接種摩西球囊霉和地表多抱囊霉(Diveversiforme)后測得菌根侵染率分別為17%和56%[10]；葉少萍等對狗牙根(Cynodondactylon)接種摩西球囊霉和聚叢球囊霉(Glomusaggregatum)后菌根侵染率為49.50%和58.01%[37]；寧楚涵等對蘆葦(Phragmitescommunis)和狼尾草(Pennisetumalopecuroides)接種摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)和根內(nèi)根孢囊霉(Rhizophagusintraradices)后測得菌根侵染率分別為55.3%，52.7%和46.4%，44.6%[38]。以上研究結(jié)果表明，不同AM真菌對同種或不同植物的菌根侵染率存在差異。

3.2 不同染色方法對不同植物根系A(chǔ)M真菌的染色效果

通過對比臺盼藍(lán)、酸性品紅和墨水醋染色的效果發(fā)現(xiàn)，臺盼藍(lán)和酸性品紅染色的效果明顯優(yōu)于墨水醋染色的效果。用前2種染色方法染色，AM真菌的孢子、菌絲和泡囊著色效果很好，便于觀察菌根結(jié)構(gòu)和測定侵染率。這一方面可能跟植物的根系結(jié)構(gòu)相關(guān)，如根的堅韌程度。栽培2個月的‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的根系較為細(xì)嫩，用10%KOH溶液透明處理1 h后，牧草根部皮層細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)基本清除干凈，極大的方便了染色劑的滲透[21]，因此孢子等更容易著色。其他研究者也做了相關(guān)研究，如婁璇[43]采用臺盼藍(lán)對水稻根系A(chǔ)M真菌染色后，能清晰觀察到根內(nèi)菌絲和泡囊以及根細(xì)胞內(nèi)形成的叢枝結(jié)構(gòu)；而劉曉迪等[44]同樣采用臺盼藍(lán)對番茄(Solanumlycopersicum)根段染色后菌根觀測效果卻一般；蔡柏巖等[26]采用酸性品紅對黃檗根圍AM真菌染色后菌根觀測效果不佳。另一方面可能跟水浴加熱透明和染色的時間有關(guān)。本研究對供試材料在處理時間上控制到位，因此觀測效果較好。房鳳如[22]采用臺盼藍(lán)對楊樹根部AM真菌進(jìn)行了過夜染色，結(jié)果能清晰觀察到孢子、菌絲和泡囊等結(jié)構(gòu)。毛圓圓[25]對香根草根系A(chǔ)M真菌用酸性品紅染色后靜置過夜，次日在香根草根系中可以觀察到AM真菌的侵入點、菌絲、泡囊和叢枝等結(jié)構(gòu)?？梢?，染色時間也是影響染色效果的關(guān)鍵因素之一，把控好染色時間可以改善觀測效果。

用墨水醋染色后，本研究很難觀察到任何菌根結(jié)構(gòu)。然而，汪茜等[29]，廖楠等[30]同樣采用了墨水醋染色法，卻能清楚觀察到生姜和甘蔗根系A(chǔ)M真菌的菌絲等菌根結(jié)構(gòu)。這可能是因為墨水醋染色法適用于生姜、甘蔗等根系相對堅韌的植物根系的AM真菌的染色，而本研究所選的宿主植物根系幼嫩，因而導(dǎo)致孢子、泡囊等著色困難，進(jìn)而影響了染色質(zhì)量；也有可能是染色時間或者墨水質(zhì)量的問題。

4 結(jié)論

不同染色方法對2種禾本科牧草根系A(chǔ)M真菌的染色效果不一致，用臺盼藍(lán)染色法染色后發(fā)現(xiàn)，孢子、菌絲和泡囊等菌根結(jié)構(gòu)更易于著色。因此，為了保證菌根觀測效果和菌根侵染率測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，在研究不同植物菌根侵染率時，應(yīng)根據(jù)菌根著色效果選擇最佳的染色方法。