根瘤菌對(duì)紫花苜蓿生物修復(fù)鎘污染功能的影響

孔海明， 李開(kāi)源， 高雙紅， 孫孌姿

(西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

隨著我國(guó)工業(yè)的飛速發(fā)展，土壤重金屬污染已成為破壞生態(tài)環(huán)境、阻礙農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要問(wèn)題[1]。其中，鎘(Cadmium，Cd)的污染問(wèn)題最為突出，Cd污染土壤面積已達(dá)到2×105km2，約占總耕地面積的1/6[2]。土壤中的Cd可通過(guò)食物鏈的富集作用進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，嚴(yán)重危害人和動(dòng)物的健康。因此，Cd污染土壤的修復(fù)治理問(wèn)題亟待解決[3]。治理重金屬污染土壤的傳統(tǒng)方法有物理法和化學(xué)法，不僅成本高，還易造成二次污染。植物修復(fù)作為近年來(lái)興起的新型修復(fù)重金屬污染土壤的方法，成本低且保護(hù)土壤生態(tài)環(huán)境，被廣泛認(rèn)可和接受[4]。植物修復(fù)是利用植物根部吸收污染土壤中的重金屬，并使重金屬在植物地上部分積累，收割植物地上部分，即可在不破壞土壤結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上去除污染物[1]。其中，氮素作為植物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素，可提高植物對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)功能。研究表明，利用非固氮植物修復(fù)Cd污染土壤時(shí)，施加氮肥可改變土壤中Cd的有效性及其在植物中的富集量，進(jìn)而提高植物對(duì)Cd的生物修復(fù)能力[5]。但是，施用氮肥不僅增加成本，過(guò)多施氮還可能產(chǎn)生二次污染[6]。

根瘤菌是豆科植物重要的共生微生物，在土壤氮素不足的條件下，根瘤菌可將空氣中的分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化為植物可直接利用的氮素[7]，為植物提供氮素營(yíng)養(yǎng)。根瘤菌共生對(duì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量具有重要作用[8]，并且可以減少人工施氮量從而保護(hù)土壤生態(tài)環(huán)境。已有研究表明，接種根瘤菌可增強(qiáng)豆科植物生物修復(fù)重金屬污染土壤的功能[9]，根瘤菌可以直接螯合、沉淀、轉(zhuǎn)化、吸附和積累重金屬，還可通過(guò)固氮、磷溶解、植物激素合成等促進(jìn)豆科植物生長(zhǎng)，同時(shí)降低Cd毒性[10]。其中，Younis等[11]發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌可提高扁豆(LablabpurpureusSweet)對(duì)Cd的抗性，促進(jìn)生長(zhǎng)。Chen等[12]表明接種根瘤菌的含羞草(Mimosapudica)對(duì)Cd的吸收能力可提高70%。但是，在Cd脅迫下，根瘤菌是否可以通過(guò)改變植物的氮素營(yíng)養(yǎng)而影響其對(duì)Cd的生物修復(fù)功能尚不清楚。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是豆科多年生草本植物，抗逆性強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)、生物量大，且耐頻繁刈割，可起到保護(hù)水土、改良土壤的作用，具有較好的生態(tài)價(jià)值，是目前生態(tài)修復(fù)研究的重要植物[13-14]。本試驗(yàn)以紫花苜蓿為研究對(duì)象，在不同氮素水平上對(duì)其進(jìn)行接種和不接種根瘤菌處理，研究根瘤菌對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)和鎘吸收的影響，為Cd污染土壤中修復(fù)植物的選擇以及修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)

試驗(yàn)于2020年7月25日在西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院進(jìn)行，供試紫花苜蓿為‘三得利’品種，供試菌株是苜蓿中華根瘤菌Rm1021。

挑選籽粒飽滿且大小均一的種子，用15% H2O2浸種消毒10 min后，用蒸餾水沖洗4～5次，置于鋪有兩層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，于25℃光照的人工氣候培養(yǎng)間中萌發(fā)，待長(zhǎng)出真葉后移至裝有石英砂的圓形塑料花盆中(口徑12 cm，高23 cm)，每盆3株植物。移栽后，置于溫度25℃、光照時(shí)長(zhǎng)15 h的培養(yǎng)間內(nèi)。每天澆灌1/2 Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)材料處理

為探究氮素水平對(duì)紫花苜蓿生物修復(fù)的影響，待植株生長(zhǎng)至30 cm時(shí)，將植株隨機(jī)分成兩組進(jìn)行氮素處理。由于根瘤菌在土壤氮素含量低于4.5 mmol·L-1下可接種成功[15]，因此設(shè)置低氮(1 mmol·L-1)和高氮(4 mmol·L-1)兩個(gè)水平，隨后在每個(gè)氮素水平上進(jìn)行根瘤菌接種和不接種處理。為促使紫花苜蓿接種成功，接種后，將全部植株統(tǒng)一剪至7 cm高。接種后一周將根挖出查看，在確保根系著生粉紅色有效根瘤后，施加Cd脅迫處理(CdCl2)。研究共設(shè)置4個(gè)Cd水平：0 mmol·L-1(CK)，0.25 mmol·L-1，0.5 mmol·L-1，1.0 mmol·L-1。因此，本研究共計(jì)16個(gè)處理(2個(gè)氮素水平N×2個(gè)接種處理R×4個(gè)Cd處理)，每個(gè)處理4次重復(fù)，共64盆植物。為防止蒸發(fā)造成土壤Cd及氮素的積累，每日的澆灌量達(dá)到澆透程度。30天后將整株植物采樣，用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)指標(biāo)和測(cè)定方法

株高和生物量的測(cè)定：用直尺測(cè)量株高。取紫花苜蓿鮮樣，用剪刀分離地上部和地下部，在烘箱內(nèi)105℃殺青30 min后，在75℃烘干至恒重，于萬(wàn)分之一天平上稱重，記錄干重。

Cd含量的測(cè)定：將植物樣品取樣烘干后，粉碎過(guò)0.425 mm篩。稱取樣品2.0 g放入消解管中，分別添加20 mL濃硝酸和4 mL高氯酸，然后低溫?zé)嵯?。?dāng)溶液到5 mL左右時(shí)加10 mL超純水，繼續(xù)消解15 min左右，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，冷卻至室溫，以0.2%的硝酸定容，通過(guò)火焰原子吸收分光光度法測(cè)定其重金屬含量[16]。

氮含量的測(cè)定：將地上部和地下部植物樣品烘干后，磨碎過(guò)孔徑為0.074 mm篩，用凱氏定氮法測(cè)定紫花苜蓿含氮量。

葉片丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量的測(cè)定：采用硫代巴比妥酸法[17]。以0.5% TBA溶液為空白對(duì)照，測(cè)定450 nm，532 nm和600 nm處的吸光值，用公式MDA(μmol·g-1FW)=[6.452×(A532—A600)—0.559×A450]×Vt/(Vs×FW)計(jì)算。其中，Vs為測(cè)定所用提取液體積(mL)，Vt為提取液總體積(mL)，下同。

葉綠素含量的測(cè)定：采用95%乙醇提取葉綠素[18]。后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-6100S型，MAPADA，中國(guó))在波長(zhǎng)665 nm，649 nm下測(cè)定吸光度，利用公式葉綠素含量(mg·g-1FW)=(18.16A649+6.63A665)×Vt×n/(1 000×FW)計(jì)算單位鮮重(Fresh weight，F(xiàn)W)的總?cè)~綠素含量，式中，n為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)出現(xiàn)顯著交互作用時(shí)，使用Duncan’s法對(duì)每個(gè)Cd水平下數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿株高和生物量

株高和生物量可反映植物的生長(zhǎng)狀況。Cd脅迫可顯著降低紫花苜蓿的株高和生物量(表1)。在不同Cd脅迫下，增加施氮處理紫花苜蓿的株高和生物量均有所增加，說(shuō)明添加氮素可緩解Cd對(duì)植物生長(zhǎng)的毒害(表2，表3)。在2個(gè)氮素水平下，相比于未接種組，接種處理紫花苜蓿的株高和生物量均有所提高，Cd水平為0時(shí)，接種處理使低氮和高氮下植物株高分別增加10.20%和13.32%(P<0.05)，地上生物量分別增加34.62%和25.00%(P<0.05)。Cd水平為1.0 mmol·L-1時(shí)，接種處理對(duì)株高無(wú)顯著影響，但可顯著提高植物的地上和地下部生物量(P<0.05)(表3)。

表1 鎘水平、氮素水平和根瘤菌接種對(duì)苜蓿各指標(biāo)影響的三因素方差分析

表2 不同處理下紫花苜蓿的株高

表3 不同處理下紫花苜蓿的生物量

2.2 紫花苜蓿Cd含量

植物體內(nèi)Cd含量隨Cd水平的增加而顯著增加(表1)。無(wú)論接種與否，提高氮素水平可顯著增加地下部和地上部Cd的積累(P<0.05)(表4)。在2種氮素水平下，接種可一定程度上增加地上部和地下部的Cd含量。低氮條件下，相比于未接種處理，接種處理顯著提高紫花苜蓿地下部Cd的含量(P<0.05)(表4)；在3個(gè)Cd脅迫水平上，地上部Cd的含量分別增加24.40%，11.57%和11.96%。在高氮下，接種處理使3個(gè)Cd水平下植物地上部Cd含量顯著增加(P<0.05)(表4)，使地下部Cd含量分別增加37.78%，4.17%，20.97%。

表4 不同處理下紫花苜蓿的Cd含量

2.3 紫花苜蓿氮含量

植物地上部和地下部氮含量隨Cd脅迫水平的增加而顯著降低(P<0.05)(表1，表5)。在不同水平的Cd脅迫下，提高氮素水平可顯著增加植物地上部氮含量(P<0.05)(表1)，在Cd水平為1.0 mmol·L-1時(shí)，增施氮素可使接種組和未接種組紫花苜蓿地下部氮含量分別提高16.42%和54.55%(表5)。在2個(gè)氮素水平下，接種處理均可提高植物的氮素含量，接種組的地上和地下部的氮含量均高于未接種處理組(表5)。

表5 不同處理下紫花苜蓿的氮含量

2.4 紫花苜蓿MDA含量

MDA含量反映了膜脂過(guò)氧化的程度，可間接反映植物受Cd脅迫毒害的程度。由表1可知，MDA含量隨Cd脅迫水平的提高而顯著上升(P<0.05)。提高氮素水平顯著降低了MDA的含量(P<0.05)(表6)。鎘脅迫下，與不接種處理相比，接種處理進(jìn)一步降低了MDA含量(P<0.05)(表6)。在0.25 mmol·L-1，0.5 mmol·L-1，1.0 mmol·L-1Cd水平下，接種根瘤菌使高氮下葉片MDA含量分別降低47.40%，37.91%，25.87%，低氮下分別降低38.30%，29.37%，28.42%。

表6 不同處理下紫花苜蓿中MDA含量

2.5 紫花苜蓿葉綠素含量

葉綠素作為光合作用的關(guān)鍵色素，其含量多少標(biāo)志著植物生長(zhǎng)能力的強(qiáng)弱，Cd脅迫可導(dǎo)致葉綠素分解，使葉片干枯發(fā)黃。由表7可知，葉綠素含量隨Cd脅迫水平的提高而下降。提高氮素水平可在一定程度上增加葉綠素含量。在高氮處理下，Cd水平為0.25 mmol·L-1時(shí)，與不接種處理相比，接種處理可使葉綠素含量增加27.11%(P<0.05)。

表7 不同處理下紫花苜蓿中總?cè)~綠素含量

3 討論

Cd是重金屬污染土壤中的主要毒性元素之一，可被植物根系吸收并積累在莖葉中，進(jìn)而隨著食物鏈危害人類(lèi)健康[19]。在改良重金屬污染土壤中，生物修復(fù)是一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法。與非固氮植物相似，氮素也可增加紫花苜蓿對(duì)Cd的吸收，并增強(qiáng)紫花苜蓿對(duì)Cd的抗性。根瘤菌具有固氮功能[8]，并可增加根系對(duì)土壤氮素的吸收量[6]，從而提高植物的氮素含量。因此在Cd脅迫下，接種根瘤菌可增加紫花苜蓿的Cd含量以及葉綠素含量，降低MDA含量，從而提高紫花苜蓿對(duì)Cd污染的生物修復(fù)功能。

根系是植物與Cd最先接觸的部位，也是最先受到Cd毒害的部位[20]，Cd毒可使根系變短變粗、側(cè)根減少、活力降低，從而影響植物對(duì)Cd的吸收[21]。與前人研究一致，提高氮素水平顯著地提高了Cd脅迫下紫花苜蓿根系的重量。而接種根瘤菌也可提高紫花苜蓿的地下生物量[22]，增加根系表面積、根系體積和促進(jìn)側(cè)根生長(zhǎng)[6]，從而增加根系與土壤的接觸面積。另外，根瘤菌的細(xì)胞壁富含羧基陰離子和羧酸陰離子，易結(jié)合環(huán)境中的活性金屬陽(yáng)離子到其表面[1]，進(jìn)一步促進(jìn)植物根系對(duì)Cd的吸附。

除了根系對(duì)土壤中Cd的吸收之外，Cd在植物地上部的積累也是決定植物生物修復(fù)功能的重要指標(biāo)。相比于低氮條件，高氮下紫花苜蓿體內(nèi)積累的Cd含量較高，說(shuō)明氮素可增強(qiáng)紫花苜蓿對(duì)Cd的積累。施氮還能提高油菜(BrassicacampestrisL.)中Cd向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)積累的能力[23]，類(lèi)似結(jié)論在山楊幼苗(PopulusdavidianaDode)[24]和白三葉(Trifoliumrepens)[4]的研究中也可得到。接種根瘤菌可顯著提高植物氮素含量，因此，根瘤菌可通過(guò)增加氮素含量，增加Cd在莖葉中的富集，從而提高植物對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)。

葉綠素含量可表征逆境脅迫下植物的衰老狀況。Cd脅迫可通過(guò)抑制5-氨基酮戊酸合成及抑制原葉綠素還原酶活性使植物葉綠素合成受阻[25]，降低光合速率，抑制植物生長(zhǎng)。氮素是葉綠素合成的重要營(yíng)養(yǎng)元素，提高氮素營(yíng)養(yǎng)可增加Cd脅迫下葉綠素含量[24-26]。而根瘤菌可通過(guò)固氮作用提高紫花苜蓿氮素含量，進(jìn)而提高Cd脅迫下葉綠素的含量，王鵬輝等[27]也表明，接種根瘤菌處理使各品種大豆(Glycinemax)的葉綠素含量比未接種根瘤菌處理高7.63%～39.06%。

MDA含量是衡量膜脂過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)。Cd脅迫誘導(dǎo)活性氧類(lèi)物質(zhì)的積累，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化[28]，從而增加MDA含量(表6)。提高氮素營(yíng)養(yǎng)可減少M(fèi)DA含量，說(shuō)明氮素能夠提高植物對(duì)Cd的耐受性[29]，Hassan等[30]對(duì)水稻(OryzasativaL.)的研究結(jié)果也表明，Cd脅迫下，氮素可通過(guò)增加含氮化合物來(lái)穩(wěn)定大分子、維持體內(nèi)活性氧平衡以及抵抗細(xì)胞中氧化還原電位變化，從而減少M(fèi)DA積累。而接種根瘤菌后可提高紫花苜蓿的氮素含量，緩解Cd脅迫對(duì)紫花苜蓿的細(xì)胞膜損傷，促進(jìn)植物在逆境下的生長(zhǎng)發(fā)育，從而發(fā)揮其改良土壤的生物修復(fù)功能。

4 結(jié)論

在Cd脅迫下，紫花苜蓿的株高下降，生物量減少，植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制。提高氮素含量可促進(jìn)葉綠素合成、降低MDA含量，并且增加植物對(duì)Cd的吸收。Cd脅迫下接種根瘤菌可增加植物體內(nèi)氮素含量，增強(qiáng)植物對(duì)Cd的抗性。因此，根瘤菌可增強(qiáng)紫花苜蓿對(duì)鎘污染土壤的生物修復(fù)功能，在生物修復(fù)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力和前景。