酸漿果實(shí)多酚和多糖雙水相提取工藝及其抗氧化活性

讓鳳菊，劉偉，歐陽艷

（伊犁師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院新疆維吾爾自治區(qū)教育廳普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 伊寧 835000）

酸漿（Physalis alkekengi L.）是茄科酸漿屬多年生草本植物，性寒，歸肺經(jīng)，廣布于亞歐大陸，如中國、日本、俄羅斯等[1]。果實(shí)和宿萼是其主要入藥部位，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其主要含有酸漿苦味素類、多酚類、生物堿類、多糖、揮發(fā)油類等多種生理活性物質(zhì)[2-6]。目前對(duì)酸漿果實(shí)的研究多集中在酸漿苦素類及其他活性成分的藥理活性上，如國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)酸漿具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用[7-10]。多酚、多糖是植物中主要活性成分，而有關(guān)酸漿中多酚、多糖較少關(guān)注。

有研究發(fā)現(xiàn)心血管疾病、腫瘤、阿爾茲海默癥等疾病都與體內(nèi)自由基的高反應(yīng)活性有關(guān)[11]。因而含有大量無毒天然抗氧化劑（如多酚、類黃酮、維生素C等）的藥用植物[12]引起研究人員關(guān)注，已有研究表明酸漿多酚具有抗氧化、改善認(rèn)知、降血糖等功效[13-15]，酸漿多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖血脂等活性[16]。但對(duì)其提取工藝研究較少。武乾英[17]優(yōu)化乙醇水提取酸漿果實(shí)多酚工藝，獲得多酚得率為0.899%；王文祥[14]采用酸加酶的熱水浸提法提取酸漿多糖，多糖提取率較高，為33.2%。王曉林等[18]探究了微波協(xié)同雙水相法提取酸漿宿萼總黃酮工藝，最佳工藝：正丙醇-水比為0.7、微波提取時(shí)間 20 min、料液比 1∶50（g/mL），硫酸銨質(zhì)量濃度為0.35 g/mL，微波功率為400 W。

雙水相同時(shí)提取酸漿果實(shí)多酚和多糖類工藝的研究報(bào)道較少，本試驗(yàn)以酸漿果實(shí)為研究對(duì)象，根據(jù)多酚易溶于醇相，多糖易溶于水相特點(diǎn)，采用C2H5OHK2HPO4構(gòu)造雙水相體系，輔助超聲波同時(shí)提取酸漿果實(shí)中多糖、多酚，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化粗提工藝，并評(píng)價(jià)其體外抗氧化性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸漿果實(shí)：市售，洗凈后于烘箱45℃烘干，粉碎過60目篩密封保存冷藏備用。

石油醚、無水乙醇、K2HPO4、苯酚、福林酚、濃硫酸、碳酸鈉（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；沒食子酸、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（優(yōu)級(jí)純）：上海士峰生物科技有限公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、三吡啶基三嗪：上海阿拉丁生化試劑科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2500紫外可見分光光度計(jì)：日本島津分析儀器廠；YB-250粉碎機(jī)：永康市速鋒工貿(mào)有限公司；KQ-250DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。BSA124S電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品脫脂

將酸漿果實(shí)粉末置于燒瓶中，以1∶15（g/mL）料液比加入石油醚，超聲提取40 min，抽濾。取出濾渣后再重復(fù)上述操作2次，濾渣常溫中揮干，裝瓶冷藏備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用福林酚比色法測(cè)定多酚含量，具體方法參考張艷霞等[19]的方法稍有改動(dòng)。精確配制1 g/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，取適量標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL容量瓶，稀釋成不同濃度沒食子酸溶液（10 mg/L～60 mg/L），依次取1 mL該沒食子酸溶液于10 mL的試管中，加入去離子水5 mL，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑（加水稀釋10倍）1 mL，搖勻，再加入7.5% Na2CO3溶液3 mL，搖勻后室溫黑暗靜置2 h，于最大吸收波長718 nm處測(cè)量不同濃度的沒食子酸溶液吸光度，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參考巫永華等[20]的方法測(cè)定多糖含量，配制濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，依次吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，用蒸餾水補(bǔ)足至 2 mL，搖勻，分別加入6%苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL后搖勻，冷卻至25℃，以葡萄糖濃度為0的那組作為空白參比，對(duì)該6組溶液按體積比稀釋50倍，在最大吸收波長488 nm處測(cè)定不同濃度葡萄糖溶液的吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 酸漿果實(shí)中多酚和多糖的分離提取

稱取1.00 g酸漿果實(shí)粉末于100 mL錐形瓶中，按料液比1∶30（g/mL）加入30 mL一定濃度雙水相體系。在一定溫度下超聲提取20 min，抽濾，室溫下分液漏斗靜置一段時(shí)間分層后，讀出上、下層溶液體積，按照

1.3.2 方法測(cè)得上下相中多酚、多糖的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚、多糖的濃度。

1.3.4 酸漿果實(shí)中多酚和多糖得率、萃取率的測(cè)定

酸漿果實(shí)中多酚和多糖得率按式（1）、萃取率按式（2）計(jì)算[21]。

式中：O為酸漿果實(shí)多酚（或多糖）得率，mg/g；C為由回歸方程計(jì)算的多酚（或多糖）的濃度，mg/mL；V1為多酚（或多糖）提取液的體積，mL；V2為多酚（或多糖）為顯色反應(yīng)的定容體積，mL；V3為酸漿測(cè)定多酚（或多糖）取樣體積，mL；m為酸漿提取樣品質(zhì)量，g。

式中：Y為多酚（或多糖）萃取率，%；K為多酚（或多糖）在上下相中的分配系數(shù)；R為上下相的體積比；Cu，Cd分別為多酚（或多糖）上下相的濃度，mg/L；Vu和Vd為上下相體積，mL。

1.4 單因素試驗(yàn)

根據(jù)1.3.3的試驗(yàn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)，分別研究料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]、超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、溫度（20、30、40、50、60 ℃）、乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（15%、18%、21%、24%、27%）和K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（20%、26%、31%、36%、41%）5個(gè)因素對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響。

1.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，以多酚（或多糖）萃取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)選酸漿果實(shí)多酚和多糖提取工藝。多酚提取因素水平選取見表1，多糖提取因素水平選取見表2。

表1 多酚正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Orthogonal test factors level of polyphenols

表2 多糖正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Orthogonal test factors level of polysaccharides

1.6 酸漿果實(shí)中多酚和多糖抗氧化性試驗(yàn)

1.6.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

DPPH溶液配制：稱取DPPH 6.3mg，無水乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，即制成濃度為0.16 mmol/L的DPPH工作液。

樣品、VC、空白（乙醇）溶液分別與DPPH溶液等體積混合，充分搖勻，暗處反應(yīng)30 min，分別于517 nm處測(cè)吸光度，按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ac×100]

式中：Ac表示2 mL DPPH溶液+2 mL乙醇溶液的吸光度；Ai表示2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度；Aj表示2 mL樣品溶液+2 mL乙醇溶液的吸光度。

1.6.2 鐵離子還原力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）實(shí)驗(yàn)

FRAP工作液制備：酸漿多酚、多糖的FRAP實(shí)驗(yàn)參考Xu等[22]的方法稍有改動(dòng)。準(zhǔn)確配制一定體積的20 mmol/L FeCl3·6H2O 溶液、10 mmol/L TPTZ溶液（溶于40 mmol/L鹽酸）和300 mmol/L醋酸鹽緩沖液（pH3.6），然后按照按 1∶1∶10 體積比混合。

VC標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配制一定體積的0.2 mg/mL的VC甲醇溶液作為母液，將母液稀釋成一系列的濃度。分別取上述溶液100 μL，加入3 mL FRAP工作液，混勻后常溫反應(yīng)90 min于593 nm處測(cè)定吸光度，以去離子水做對(duì)照。得到VC的FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=4.308 29x-0.043 45（R2=0.998 2）。

樣品中酸漿多酚和多糖的FRAP值：將酸漿多酚、多糖粗提物配制不同濃度溶液，按照做VC標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色，測(cè)出各樣品吸光度，根據(jù)VC標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相同吸光度下VC的濃度，以此濃度的數(shù)值作為FRAP值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。本試驗(yàn)運(yùn)用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用origin 8.0繪圖軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚和多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.01C+0.021，R2=0.9953（式中：A為吸光度；C為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mg/L），表明在濃度0～60 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性相關(guān)性。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程：y=0.301 7x+0.009 7，R2=0.999 4（式中：y為吸光度；x為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mg/L），表明在濃度0～2.5 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性相關(guān)性。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響

料液比對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響Fig.1 Effect of solid liquid ratio on the extraction rate of Physalis alkekengi polyphenols and polysaccharides

如圖1所示，總體上多酚萃取率遠(yuǎn)低于多糖，且都呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。料液比為 1∶10（g/mL）～1∶30（g/mL）時(shí)，多酚萃取率隨溶劑量增加直線上升，1∶30（g/mL）時(shí)達(dá)最大值76.35%，隨后稍減至平緩；多糖的萃取率則隨料液比 1∶20（g/mL）上升到 1∶30（g/mL）快速增加到最大值92.12%，之后多酚萃取率波動(dòng)不大，說明隨著溶劑量的逐漸增加，物料黏度逐漸變小，且濃度梯度隨之變大，擴(kuò)散速度加快，原料中的多酚、多糖得以大量轉(zhuǎn)移到提取液中，使得提取更加完全。試驗(yàn)結(jié)果與巫永華和邵圣娟等[20，23]相似，因此多酚和多糖提取料液比均選擇 1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）3 個(gè)水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of Physalis alkekengi polyphenols and polysaccharides

由圖2可知，超聲時(shí)間在20 min內(nèi)多酚和多糖的萃取率快速增加，之后增加緩慢，漲幅較小，在50 min時(shí)分別到達(dá)最大值75.48%和82.98%。說明樣品中的多酚、多糖在超聲20 min時(shí)已經(jīng)充分溶出，隨后超聲時(shí)間增加對(duì)其萃取率的影響都不明顯，并且延長超聲時(shí)間會(huì)降低工作效率。故本試驗(yàn)沒有把時(shí)間因素作為正交試驗(yàn)考察對(duì)象，超聲時(shí)間均為20 min。

2.2.3 超聲溫度對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響

超聲溫度對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響見圖3。

圖3 溫度對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響Fig.3 Effect of temperature on the extraction rate of Physalis alkekengi polyphenols and polysaccharides

如圖3所示，多酚萃取率隨溫度升高而降低，變化幅度不大，20℃時(shí)萃取率最高，為75.79%，可能是因?yàn)殡S溫度升高乙醇揮發(fā)加快。在20℃～60℃時(shí)，多糖萃取率整體上呈現(xiàn)隨溫度的升高先增大而后又有所下降的現(xiàn)象，50℃時(shí)達(dá)到最大值83.38%，可能是因?yàn)闇囟壬邔?dǎo)致酸漿果實(shí)細(xì)胞壁大量破裂，基質(zhì)中多糖快速溶出，故萃取率上升，繼續(xù)升溫，影響雙水相體系分配系數(shù)和壓力等因素，導(dǎo)致萃取率降低[24]。多酚提取正交試驗(yàn)溫度選擇20、25、30℃3個(gè)水平，而多糖提取選擇的3個(gè)水平為50、55、60℃。

2.2.4 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響

乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響見圖4。

圖4 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響Fig.4 Effect of ethanol mass fraction on the extraction rate of Physalis alkekengi polyphenols and polysaccharides

從圖4可以看出，C2H5OH-K2HPO4雙水相萃取體系中，酸漿多酚萃取率隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高逐步增大，因?yàn)槎喾宇愇镔|(zhì)在乙醇中的溶解度大于水中的溶解度，故乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，多酚萃取率上升。多酚萃取率在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)27%時(shí)達(dá)最高值74.53%。而多糖萃取率則與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)成反比，多糖在水中的溶解度遠(yuǎn)大于乙醇的溶解度，隨著乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，體系中水含量減少，多糖的溶解量降低，萃取率降低[25]。而適量乙醇的存在增加了脂溶性多糖的溶出故出現(xiàn)多糖萃取率在降低的趨勢(shì)下有所回升。故多酚提取正交試驗(yàn)中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇21%、24%、27%3個(gè)水平，而多糖提取則選擇15%、18%、和21%3個(gè)水平。

2.2.5 K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響

K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響見圖5。

圖5 K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酸漿多酚和多糖萃取率的影響Fig.5 Effect of K2HPO4mass fraction on the extraction rate of Physalis alkekengi polyphenols and polysaccarides

由圖5知，多酚萃取率隨K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而逐漸減小，最高為69.3%，原因主要是雙水相體系中K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)太高抑制了多酚的萃取，這與徐方祥等[26]研究結(jié)果一致，而多糖萃取率則隨著K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大，最高達(dá)81.12%。這是因?yàn)殡p水相體系中存在無機(jī)鹽與有機(jī)小分子醇爭奪體系中的水分子，下相中隨K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，無機(jī)鹽爭奪水分子的能力增強(qiáng)，溶于上相的水分子會(huì)進(jìn)入下相，多糖萃取率升高。故多酚提取選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、26%、31%的K2HPO4進(jìn)行正交試驗(yàn)，而多糖提取則選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)31%、36%、41%的K2HPO4。

2.3 正交試驗(yàn)

多酚和多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果見表3和表4。

表3 酸漿多酚正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test of Physalis alkekengi polyphenols

表4 酸漿多糖正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 4 Results of orthogonal test of Physalis alkekengi polysaccharide

由表3多酚正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，影響多酚萃取率主次順序?yàn)?B＞D＞C＞A，最佳水平為 A2B3C1D1，即乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%、料液比為1∶40（g/mL）、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、超聲溫度為20℃。

從表4多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果可知，影響多糖萃取率的主次順序?yàn)镈>C>B>A，最優(yōu)水平為A2B3C3D2，即乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 18%，料液比 1∶40（g/mL），K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41%，溫度為55℃。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，各稱取酸漿果實(shí)粉末3 g，分別在多酚、多糖最佳粗提工藝條件下進(jìn)行試驗(yàn)，各3份重復(fù)，計(jì)算平均值。分別得到多酚、多糖萃取率為83.44%、89.16%；略高于表3、表4中多酚、多糖的最高萃取率。得率分別為14.774 4 mg/g和15.8 mg/g；平均萃取率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.27%、1.78%，說明該粗提工藝結(jié)果重現(xiàn)性好。

2.4 酸漿多糖和多酚DPPH自由基清除能力

酸漿多糖和多酚DPPH自由基清除能力見圖6。

圖6 酸漿多酚和多糖清除DPPH自由基能力Fig.6 DPPH radicals scavenging ability of Physalis alkekengi polyphenols and polysaccharides

由圖6可知，雙水相提取酸漿多酚和多糖均對(duì)DPPH自由基有清除能力，其清除率隨濃度的增大而升高。同濃度下多酚對(duì)DPPH自由基的清除率顯著高于多糖，且均低于對(duì)照VC的DPPH自由基清除率。多糖清除DPPH自由基能力與巫永華等[20]的研究不一致，原因可能是多糖未純化，且水相中的磷酸氫二鉀含量高，影響多糖純度，進(jìn)而影響多糖抗氧化能力。

2.5 酸漿多糖和多酚的鐵離子還原能力

酸漿多糖和多酚的鐵離子還原能力見圖7。

圖7 酸漿多酚和多糖的鐵離子還原能力Fig.7 Iron ion reduction ability of Physalis alkekengi polyphenols and polysaccharides

由圖7知，酸漿多酚、多糖抗氧化能力均與濃度成一定的量效關(guān)系。在濃度2 mg/mL～10 mg/mL時(shí)，酸漿多酚的FRAP值顯著高于多糖的最高值，10 mg/mL的酸漿多酚的FRAP值為0.239 6 mg/mL，同濃度的多糖僅為0.085 6 mg/mL，說明酸漿果實(shí)多酚和多糖具有一定的抗氧化性且有差別。

3 結(jié)論

采用正交試驗(yàn)對(duì)超聲輔助雙水相法提取酸漿果實(shí)多酚和多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的酸漿多酚提取工藝為乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%、料液比1∶40（g/mL）、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、超聲溫度20℃；酸漿多糖最佳提取工藝：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%、料液比1∶40（g/mL）、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)41%、溫度55℃。最優(yōu)提取條件下多酚、多糖的萃取率分別為83.44%、89.16%；得率分別為14.774 4、15.8 mg/g；萃取率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.27%、1.78%，說明該粗提工藝結(jié)果合理可重復(fù)。體外抗氧化評(píng)價(jià)結(jié)果顯示酸漿多酚具有較好抗氧化活性，而酸漿多糖較差，可能與雙水相提取酸漿多糖未進(jìn)行純化有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。