寒蔥蛋白提取工藝優(yōu)化及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

秦 露， 韓 蕊， 張 先, 李范洙

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，延吉 吉林 133002)

寒蔥(AlliumvictorialisL.)是百合科、蔥屬的多年生草本植物，學(xué)名為茖蔥，別名山蔥、鹿耳蔥等。寒蔥主要分布于北半球溫帶，在半蔭環(huán)境下生長(zhǎng)良好，耐寒且遇寒生長(zhǎng)更旺盛，味辛辣如蔥而得名“寒蔥”，有止血、散淤、化痰、止痛的功效。寒蔥含有蔥香，具有味美、腌制后爽口甘甜的特點(diǎn)，享有“菜中靈芝”的美譽(yù)。寒蔥營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，是一種具有重要生物學(xué)功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的綠色植物。寒蔥中富含維生素 C、氨基酸及有利于人體健康的活性成分，如多酚、黃酮[1]等。

目前國(guó)內(nèi)的寒蔥研究大多與其栽培種植[2-5]及成分生物活性[6-9]相關(guān)，鮮見(jiàn)關(guān)于寒蔥蛋白提取及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)方面的研究。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，寒蔥與其他植物相比蛋白質(zhì)含量較高。有研究表明，長(zhǎng)期攝入動(dòng)物蛋白可能會(huì)增加患肥胖癥及糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[10]，而植物蛋白與動(dòng)物蛋白相比，不含膽固醇，更加健康，并能減輕人體腎臟負(fù)擔(dān)[11]；且植物蛋白資源可循環(huán)再生，對(duì)環(huán)境友好[12]，可將其替代或部分替代動(dòng)物蛋白，滿足人體對(duì)蛋白質(zhì)的攝入要求[13]。

該試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶復(fù)合堿提酸沉法提取寒蔥蛋白的工藝條件，并對(duì)所得寒蔥蛋白進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)，為植物蛋白資源的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2020年夏季采摘新鮮吉林省延邊地區(qū)的野生寒蔥置于55 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，然后用高速多功能粉碎機(jī)粉碎后過(guò)100目篩，得到寒蔥干燥粉，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸鈉，分析純，購(gòu)于河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；其余常規(guī)試劑均為分析純，購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-7504可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司)；QFST-250SQ索氏提取器(浙江托普儀器有限公司)；Scientz-10N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TDZ5-WS離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀(島津國(guó)際貿(mào)易有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 寒蔥蛋白提取工藝

寒蔥蛋白的提取參照丘苑新等[14]的方法，取3 g寒蔥粉，加入2%的纖維素酶，浸泡于一定比例的水中，并按照單因素相應(yīng)的試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)，將其水解完畢后于80 ℃水浴鈍化酶活性，冷卻至常溫后用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至10，在50 ℃條件下水浴2.5 h，冷卻至常溫后在4 000 r/min離心15 min取上清液，進(jìn)行沉淀復(fù)提，合并上述2次上清液，取1 mL用于之后的蛋白質(zhì)含量測(cè)定。用0.1 mol/L HCl將上清液pH值調(diào)節(jié)至等電點(diǎn)3.5，靜置1 h后在4 000 r/min離心15 min取沉淀，使用真空冷凍干燥機(jī)干燥48 h即可得到寒蔥蛋白粉。

1) 單因素試驗(yàn)

①酶解溫度對(duì)寒蔥蛋白提取率的影響

在酶解時(shí)間2 h，料液比1∶50 (g∶mL)條件下，選擇酶解溫度30、40、45、50、55和60 ℃分別酶解，重復(fù)3次，根據(jù)最終蛋白質(zhì)的提取率確定最優(yōu)酶解溫度。

②酶解時(shí)間對(duì)寒蔥蛋白提取率的影響

在酶解溫度45 ℃、料液比1∶50 (g∶mL)條件下，分別酶解1、1.5、2、2.5、3和3.5 h，重復(fù)3次，根據(jù)最終蛋白質(zhì)的提取率確定最優(yōu)酶解時(shí)間。

③料液比對(duì)寒蔥蛋白提取率的影響

在酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間2 h條件下，分別采用料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70 (g∶mL)進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3次，根據(jù)最終蛋白質(zhì)的提取率確定最優(yōu)料液比。

2) 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，以酶解溫度(A)、酶解時(shí)間(B)、料液比(C)這3個(gè)因素為自變量[15]，以試驗(yàn)中寒蔥蛋白提取率的大小為響應(yīng)面的響應(yīng)值進(jìn)行工藝條件優(yōu)化，相關(guān)試驗(yàn)因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

1) 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取考馬斯亮藍(lán)G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL 85%H3PO4,用蒸餾水稀釋至1 000 mL后，用濾紙于循環(huán)水真空泵中抽濾，制得考馬斯亮藍(lán)溶液[16]。

配制0.02、0.04、0.06、0.08、1.0 mg/mL牛血清蛋白質(zhì)溶液。分別吸取1 mL不同濃度的蛋白質(zhì)溶液于10 mL試管中，再向試管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，震蕩混勻，靜置2 min。在波長(zhǎng)為595 nm處用分光光度計(jì)測(cè)定不同濃度的牛血清蛋白質(zhì)吸光度值，以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終得到回歸方程

y=0.507 5x+0.034 9，R2=0.993 7。

2) 蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法及提取率計(jì)算

吸取1 mL蛋白質(zhì)提取液置于10 mL試管中，再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，震蕩混勻，靜置2 min，于波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定寒蔥蛋白提取液的吸光度值，再根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中蛋白質(zhì)含量[17]。根據(jù)凱氏定氮法測(cè)定寒蔥中蛋白質(zhì)的總含量。寒蔥蛋白提取率[18]計(jì)算公式為：

寒蔥蛋白提取率/%=提取液中蛋白質(zhì)含量/寒蔥粉末中蛋白質(zhì)含量×100

(1)

1.3.3 氨基酸含量測(cè)定

根據(jù)GB/T5009.124-2016規(guī)定的試驗(yàn)方法對(duì)寒蔥蛋白進(jìn)行氨基酸組分分析。

在水解管中準(zhǔn)確稱量0.2 g樣品，加入10 mL 6 mol/L HCl溶劑，在減壓的條件下將水解管密封后放入烘干箱，在110 ℃水解24 h，冷卻后過(guò)濾水解液，再旋蒸去除鹽酸，將所得試樣用0.02 mol/L HCl 溶劑定容至50 mL。該試樣使用時(shí)稀釋10倍，取少量稀釋后的水解液，再將其過(guò)0.02 μm的濾膜過(guò)濾，裝入進(jìn)樣瓶中放入氨基酸自動(dòng)分析儀中進(jìn)行檢測(cè)。[19-20]

1.3.4 氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)方法

根據(jù)FAO/WHO共同修訂的理想蛋白質(zhì)人體必需氨基酸模式譜，分析寒蔥氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，具體指標(biāo)包括：必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氨基酸評(píng)分(AAS)、化學(xué)評(píng)分(CS)、氨基酸比值系數(shù)(RCAA)、氨基酸比值系數(shù)分(SRCAA)、必需氨基酸指數(shù)(EAAI)、生物價(jià)(BV)、營(yíng)養(yǎng)指數(shù)(NI)[21-23]，各項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算公式如(2)～(8)。由于半胱氨酸與酪氨酸分別由甲硫氨酸和苯丙氨酸轉(zhuǎn)變而成，因此將苯丙氨酸和酪氨酸、甲硫氨酸與半胱氨酸分別合并計(jì)算[24]。

氨基酸評(píng)分(AAS)=(Ax/Fx)×100；

(2)

化學(xué)評(píng)分(CS)=(Ax/Ae)/(Ex/Ee)×100；

(3)

氨基酸比值系數(shù)(RCAA)=氨基酸比值/氨基酸比值的均值；

(4)

氨基酸比值系數(shù)分(SRCAA)=100-CV×100；

(5)

(6)

生物價(jià)(BV)=(1.09×EAAI-11.7)×100;

(7)

營(yíng)養(yǎng)指數(shù)(NI)=EAAI×(Pp/100);

(8)

式中,Ax為待測(cè)蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸含量(mg/g)；Fx為FAO/WHO評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式中相應(yīng)的必需氨基酸含量(mg/g)；Ae待測(cè)蛋白質(zhì)中必需氨基酸總含量(mg/g)；Ex為標(biāo)準(zhǔn)雞蛋模式中相應(yīng)必需氨基酸含量(mg/g)；Ee為標(biāo)準(zhǔn)雞蛋模式中必需氨基酸總含量(mg/g)；氨基酸比值為某一必需氨基酸含量與FAO/WHO模式中相應(yīng)必需氨基酸含量的比值；CV為RCAA的變異系數(shù)，CV=標(biāo)準(zhǔn)差/均數(shù)；n為比較的必需氨基酸個(gè)數(shù)；Pp為待測(cè)蛋白質(zhì)的百分含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各項(xiàng)數(shù)據(jù)均重復(fù)試驗(yàn)3次，并使用Excel 2010進(jìn)行處理；對(duì)所得數(shù)據(jù)結(jié)果采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)；響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果較為顯著，模擬效果良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解溫度對(duì)寒蔥蛋白提取率的影響

隨著酶解溫度的逐漸升高，蛋白質(zhì)提取率先上升后下降(圖1)。當(dāng)酶解溫度處于30～50 ℃時(shí)，寒蔥蛋白的提取率隨酶解溫度的升高而顯著上升，可能是由于纖維素酶在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，酶活性越強(qiáng)，寒蔥細(xì)胞壁上的纖維素更容易分解，使細(xì)胞中蛋白質(zhì)溶出，且溫度的提高會(huì)使分子擴(kuò)散速率加快，由此增加蛋白質(zhì)溶出含量。當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，寒蔥蛋白提取率達(dá)到峰值53.68%；而隨著酶解溫度的持續(xù)升高，寒蔥蛋白提取率下降顯著，可能是當(dāng)溫度超過(guò)一定限度時(shí)，纖維素酶活性受到抑制甚至失活，或是溫度過(guò)高寒蔥蛋白變性導(dǎo)致其溶解性下降，從而蛋白質(zhì)提取率降低。所以，選擇酶解溫度42.5～52.5 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)寒蔥蛋白提取率的影響

由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的逐漸增加，寒蔥蛋白的提取率先上升后趨于平緩。當(dāng)酶解時(shí)間為1～2.5 h時(shí)，寒蔥蛋白提取率隨時(shí)間的增加而顯著上升，可能是因?yàn)樵谠撁附鉁囟群土弦罕葧r(shí)，提取時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于寒蔥蛋白的溶解。而隨著酶解時(shí)間繼續(xù)增加，寒蔥蛋白提取率基本保持不變，說(shuō)明此時(shí)寒蔥蛋白溶解已達(dá)最大值，所以蛋白質(zhì)提取率變化較?。贿^(guò)長(zhǎng)的酶解時(shí)間會(huì)使試驗(yàn)耗時(shí)加長(zhǎng)。因此，選擇酶解時(shí)間2～3 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 料液比對(duì)寒蔥蛋白提取率的影響

隨著料液比的升高，寒蔥蛋白提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖3)。當(dāng)溶液料液比為1∶30～1∶40時(shí)，寒蔥蛋白提取率隨料液比升高而顯著上升，可能是因?yàn)楫?dāng)料液比較低時(shí)，原料濃度較高，不利于寒蔥蛋白從中析出，所以在這個(gè)范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，寒蔥蛋白提取率提高。但隨著料液比持續(xù)增加時(shí)，蛋白質(zhì)提取率又急劇下降，可能是在料液比較高時(shí)，析出的蛋白質(zhì)成分隨雜質(zhì)一起離心析出，導(dǎo)致提取率下降。因此,選取料液比1∶30～1∶50進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 寒蔥蛋白提取工藝優(yōu)化

利用Box-Behnken[25]共設(shè)計(jì)出17組試驗(yàn)，相應(yīng)的響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

液壓系統(tǒng)由電機(jī)—齒輪泵總成、手動(dòng)應(yīng)急泵總成、高壓蓄能器總成、閥組總成、管路總成等組成。采用雙液壓源雙回路加蓄能器結(jié)構(gòu)，一套電機(jī)—泵總成工作，另一套備用，兩套同時(shí)出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，可使用手動(dòng)應(yīng)急泵應(yīng)急處理，具有多重保護(hù)功能，提高了可靠性和安全性。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立與分析

根據(jù)Design-Expert 8.0.6對(duì)響應(yīng)面模型結(jié)果進(jìn)行擬合分析，以酶解溫度、酶解時(shí)間、料液比3個(gè)因素為自變量，以寒蔥蛋白提取率為響應(yīng)面響應(yīng)值的二元回歸方程為：Y=44.93-3.11A+2.70B+0.93C-2.64AB-0.55AC-0.69BC-2.82A2-2.45B2-0.70C2。

由表3可知，模型中1次項(xiàng)酶解溫度(A)、酶解時(shí)間(B)對(duì)寒蔥蛋白提取率影響極顯著，料液比(C)對(duì)寒蔥蛋白提取率影響不顯著；模型中AB對(duì)寒蔥蛋白提取率影響極顯著，AC、BC對(duì)寒蔥蛋白提取率影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析

此外，模型中F值為16.32，P<0.01，說(shuō)明響應(yīng)面模型差異極顯著；失擬項(xiàng)P=0.112 6，遠(yuǎn)大于0.05，說(shuō)明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，說(shuō)明試驗(yàn)方法與設(shè)計(jì)合理可靠，且其他未知因素對(duì)試驗(yàn)影響較?。黄渲心Ｐ蜎Q定系數(shù)R2=0.954 5，矯正系數(shù)R2=0.896 0，說(shuō)明模擬預(yù)測(cè)值與真實(shí)試驗(yàn)值在試驗(yàn)范圍內(nèi)模擬度良好，所以，回歸方程可以用來(lái)分析與預(yù)測(cè)寒蔥蛋白提取的工藝結(jié)果。根據(jù)F值大小可知，影響寒蔥蛋白提取率因素的主次順序?yàn)椋好附鉁囟?、酶解時(shí)間、料液比。

2.2.2 響應(yīng)面各因素相互作用分析

響應(yīng)面曲面的凹凸程度反映了各因素對(duì)寒蔥蛋白提取率影響的大小，響應(yīng)面曲率越大，說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)于因素大小的變化十分敏感；響應(yīng)面曲率較小時(shí)，說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)于因素大小的變化不敏感。圖4a為酶解溫度與酶解時(shí)間的交互作用結(jié)果，可見(jiàn)，寒蔥蛋白提取率隨溫度變化顯著，說(shuō)明適宜的溫度對(duì)促進(jìn)蛋白質(zhì)提取得率提高有著很關(guān)鍵的作用，在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮較為積極的促進(jìn)作用。而提取時(shí)間對(duì)提取率的影響也較為顯著，說(shuō)明合適的提取時(shí)長(zhǎng)也是影響提取率的有效手段之一。

圖4b為酶解溫度與料液比的交互作用結(jié)果，可見(jiàn)料液比在寒蔥蛋白提取過(guò)程中影響作用不顯著，說(shuō)明提取時(shí)加入的水量在試驗(yàn)中作用不大。

2.2.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化回歸模型進(jìn)行的工藝參數(shù)，確定提取寒蔥蛋白的最適工藝條件為酶解溫度42.5 ℃，酶解時(shí)間3 h，料液比1∶45.6，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)提取率為48.32%。為證明響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)的合理性與可靠性，以上述條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的蛋白質(zhì)提取率為48.23%，這與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)偏差為1.0%，說(shuō)明該提取條件參數(shù)可靠，具有較好的可行性。

2.3 蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

將最佳工藝提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸組分分析并進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)。由表4可知，寒蔥蛋白共測(cè)得16種氨基酸，包括蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等7種人體必需氨基酸。寒蔥蛋白必需氨基酸總量為19.17 mg/g，非必須氨基酸31.47 mg/g，氨基酸總量達(dá)50.44 mg/g，必需氨基酸與總氨基酸(EAA/TAA)的比值為0.38，必需氨基酸與非必需氨基酸(EAA/NEAA)的比值為0.62。由此可以看出，寒蔥蛋白十分接近FAO/WHO提出的理想蛋白模式(EAA/TAA≈0.40，EAA/NEAA=0.60)的要求，因此，可確定寒蔥蛋白是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白。

表4 寒蔥蛋白中氨基酸種類(lèi)及含量

由表5可知，寒蔥蛋白中含量最高的必需氨基酸為甲硫氨酸，占氨基酸總量的14.27%，高于FAO/WHO模式的10.00%，也高于全雞蛋模式的11.07%。甲硫氨酸在人體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有著十分重要的作用，根據(jù)蛋白質(zhì)互補(bǔ)理論，可將寒蔥蛋白作為食品強(qiáng)化劑，與其他蛋白互補(bǔ)，提高各種食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[26-27]，例如，補(bǔ)充大豆等谷物中含量不足的甲硫氨酸。因測(cè)得亮氨酸與賴氨酸氨基酸比值系數(shù)(RCAA)遠(yuǎn)小于1，可知這2種氨基酸是寒蔥蛋白的限制氨基酸；且亮氨酸為寒蔥蛋白的第1限制氨基酸，所以將其評(píng)分分別作為寒蔥蛋白的化學(xué)評(píng)分和氨基酸評(píng)分[28]，得到寒蔥蛋白化學(xué)評(píng)分為4.78，氨基酸評(píng)分為2.57。

由表6對(duì)比可知，寒蔥蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)指標(biāo)較羊肚菌[29]稍高，而羊肚菌是眾所周知的營(yíng)養(yǎng)豐富的食用菌之一，這是寒蔥蛋白是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白的又一證據(jù)。而寒蔥蛋白相較于黃豆[30]的各項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)較低，由測(cè)得數(shù)據(jù)及計(jì)算得知，是寒蔥蛋白中限制氨基酸亮氨酸含量過(guò)低，影響了寒蔥蛋白的必需氨基酸指數(shù)EAAI，進(jìn)而使其余指標(biāo)值偏低，且亮氨酸含量過(guò)低對(duì)其中的變異系數(shù)影響較大，導(dǎo)致其數(shù)值偏低。但其余相關(guān)指標(biāo)符合FAO/WHO制定的氨基酸模式，所以寒蔥蛋白為優(yōu)質(zhì)植物蛋白的結(jié)論仍然正確。

表6 寒蔥蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

該試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)寒蔥蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，其最佳工藝參數(shù)組合為酶解溫度42.5 ℃，酶解時(shí)間3 h，料液比1∶45.6，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，最后得到寒蔥蛋白提取率為48.23%，與預(yù)測(cè)值48.32%接近，說(shuō)明該模型對(duì)試驗(yàn)擬合程度較高，工藝合理可靠。將得到的寒蔥蛋白進(jìn)行氨基酸組分分析并進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)，可知寒蔥蛋白含人體所需的7種必需氨基酸，其中含量最高的必需氨基酸為甲硫氨酸，占氨基酸總量的14.27%，高于FAO/WHO模式的10%，也高于全雞蛋模式的11.07%。且必需氨基酸與非必須氨基酸的比值為0.62，必需氨基酸與氨基酸總量比值為0.38，由此可知，寒蔥蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白。