復(fù)合酶法提取靈芝多糖工藝優(yōu)化及果凍飲料開發(fā)

孫德鵬， 徐瀚然， 韓春姬， 汪庭瑞， 李官浩， 牟柏德*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院；2.延邊大學(xué) 食品研究中心；3.延邊大陽參業(yè)有限公司：吉林 延吉 133000)

靈芝屬多孔菌科真菌赤芝，是一種珍貴的藥材。靈芝中含有許多對人體有益的功能性營養(yǎng)成分[1]，如多糖類、三萜類化合物、礦物質(zhì)等，具有促進血液循環(huán)、提高免疫力、改善肝功能等作用[2-4]。已報道的200多種靈芝多糖分為α型和β型[5]，單糖間通過苷鍵結(jié)合的形式?jīng)Q定了靈芝多糖的藥理活性。許多研究表明，靈芝多糖還具有抑制腫瘤細胞增殖的作用[6]，能夠抑制核酸的合成，誘導(dǎo)其調(diào)亡，并能調(diào)節(jié)機體免疫力來發(fā)揮作用[7-8]。酶法提取能使靈芝中的多糖與細胞中果膠、半纖維素等分離開[9-11]，以提高多糖的提取率。為此，該試驗以靈芝為原料，復(fù)合酶法提取多糖，并優(yōu)化最佳工藝參數(shù)。

果凍是一種利用增稠劑與水為原料制作的休閑食品，深受廣大青年人的青睞。在果凍的制作中，靈芝子實體多糖具有一定的凝膠性，當波美度達到65%時冷卻凝固。靈芝多糖尚未以增稠劑的用途添加至果凍中，這不僅能夠減少明膠的使用量，還能增加產(chǎn)品的穩(wěn)定性和營養(yǎng)價值。該試驗以靈芝為原料，利用質(zhì)構(gòu)測定、味覺系統(tǒng)以及感官分析對食用明膠、山楂大棗浸膏等添加量進行優(yōu)化，為現(xiàn)代休閑食品行業(yè)提供新思路，以及后續(xù)的靈芝飲料、果凍等的研究和生產(chǎn)提供參考和依據(jù)[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長白山林下靈芝(購于延邊大陽參業(yè)有限公司)；纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶(購于河南萬邦科技有限公司)；葡萄糖、苯酚、無水乙醇、硫酸均為分析純(購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；冰糖、明膠、低聚果糖、β-環(huán)糊精均為食品級(購于延吉市西市場)；山楂大棗提取液由延邊大學(xué)食品研究中心研制。

酶聯(lián)免疫檢測儀(南京華東電子醫(yī)療裝備有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州翔天實驗儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海豫明儀器有限公司)；冷凍離心機(德國HERMLE公司)；味覺分析系統(tǒng)(日本Insent公司)；質(zhì)構(gòu)分析儀(美國ISENSO公司)。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合酶法提取靈芝多糖工藝優(yōu)化

1) 樣品預(yù)處理

將靈芝干燥至恒重，粉碎后過篩，密封保存待用。

2) 多糖提取方法

根據(jù)丁霄霄等[13]人的試驗方法修改如下：稱取靈芝樣品10.0 g置于容器中，按照料液比1∶20(g∶mL)加入蒸餾水浸泡1 h后，稱取一定質(zhì)量分數(shù)的果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶(相對底物濃度)加入浸泡液中，50 ℃水浴酶解80 min后，95 ℃下滅酶提取120 min，趁熱抽濾至澄清，濾液減壓濃縮至50 mL，加入4倍體積無水乙醇，于4 ℃醇沉10 h。5000 r/min離心10 min取沉淀溶解，蒸餾水定容至100 mL。

3) 多糖含量測定

多糖含量以苯酚-濃硫酸法測定，參照屈小玄等[14-15]人的方法并加以改動：以葡萄糖對照品含量c為橫坐標(μg)，492 nm波長處測得吸光度A為縱坐標繪制標準曲線，得線性方程 A=2.411 9c+0.037 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 6。取1 mL提取溶液，相同方法顯色后取200 μL滴入96孔板，測得吸光度代入方程計算出靈芝多糖的提取率。

4) 復(fù)合酶添加量的確定

①單因素實驗：自變量分別為果膠酶(1.5%,2.0%,2.5%,3.0%和3.5%)、纖維素酶(0.5%,1.0%,1.5%,2.0%和2.5%)和木瓜蛋白酶(1.2%,1.6%,2.0%,2.4%和2.8%)，按照1.2.1 2) 的步驟，保持酶解條件為50 ℃、酶解80 min進行試驗，以1.2.1 3) 的方法記錄吸光度并計算出多糖得率，分析得到各種酶最佳添加量。

②正交試驗：根據(jù)上述結(jié)果，按照表1進行正交試驗設(shè)計，保持酶解條件不變進行試驗，以確定最佳復(fù)合酶配比。

表1 復(fù)合酶法提取靈芝多糖正交試驗設(shè)計

5) 酶解條件的篩選

按照正交試驗結(jié)果，選用最佳復(fù)合酶的比例，對酶解溫度及酶解時間進行優(yōu)化。

①酶解時間的篩選 將酶解時間分別調(diào)節(jié)為60、70、80、90、100 min，保持酶配比、酶解溫度50 ℃不變，通過測定靈芝多糖提取率，確定最佳酶解時間；②酶解溫度的篩選 將酶解溫度分別調(diào)節(jié)為46、48、50、52和54 ℃，保持酶配比、酶解時間80 min不變，通過測定靈芝多糖提取率，確定最優(yōu)酶解溫度。

1.2.2 靈芝果凍的開發(fā)

參考賈娟等[16-17]人的方法，該試驗將以正交設(shè)計和感官評價的方法，優(yōu)化出靈芝果凍的配方。

1) β-環(huán)糊精添加量的篩選

參考戰(zhàn)旭梅等[18-19]人的方法，采用添加β-環(huán)糊精的方法對提取液中的靈芝酸進行包埋，以除去部分苦味和保留靈芝中特有的香味及營養(yǎng)成分，達到試驗?zāi)康摹?/p>

準確稱量100.0 g靈芝，采用1.2.1.5) 優(yōu)化后的條件對靈芝進行提取。將提取液濃縮至1 L待用。β-環(huán)糊精的添加量設(shè)置為7.0，7.2，7.4，7.6，7.8和8.0 g/L分別加入到50 mL靈芝多糖提取液中。

樣品倒入潔凈的樣品杯中，用味覺分析系統(tǒng)(電子舌)分析酸、甜、苦、澀、鮮、咸6個基本味覺[20]。同時，由20名品嘗員按照表2評價標準進行感官評價。通過分析兩組試驗結(jié)果確定β-環(huán)糊精的添加量。

表2 β-環(huán)糊精添加量感官評價標準

2) 口感調(diào)配及感官優(yōu)化

該試驗將延邊大學(xué)食品研究中心研制的山楂大棗浸膏的配料添加至靈芝提取液中進行口感調(diào)配，賦予其酸甜的口感。

通過前期試驗初步確定了低聚果糖、冰糖以及山楂大棗浸膏的添加量，按表3進行正交試驗，自變量為3種輔料的配比，分別添加到β-環(huán)糊精脫苦后的靈芝提取液中，以混合液感官為指標，按照表4由20名品嘗員進行感官評分，確定最優(yōu)添加比例。

表3 果凍飲料輔料添加量的正交試驗設(shè)計

3) 明膠添加量的確定

參照吳佳南等[21-22]人的方法，按上述優(yōu)化的條件制備混合液加熱至60 ℃后，在50 mL混合液中添加不同量的軟化明膠(4%，4.5%，5%，5.5%和6%)，混合均勻，放置于4 ℃冰箱內(nèi)貯存2 h后成型制成果凍。將成品切成1 cm×1 cm×1 cm的正方體，放置于質(zhì)構(gòu)儀樣品臺，以60 mm/min的速度用探頭進行40%形變的擠壓測定，分別記錄硬度、膠黏性以及彈性。同時按照表5標準，由20名品嘗員進行感官評價。通過分析2組數(shù)據(jù)確定食用明膠的添加量。

表5 靈芝果凍感官評價標準

1.3 數(shù)據(jù)處理

按照表1、3的正交設(shè)計進行試驗，得到的結(jié)果運用SPSS 26.0進行分析，并用Excel對數(shù)據(jù)進行處理后，Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶法提取靈芝多糖工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

由不同種類酶對提取率的影響可知(圖1)。果膠酶添加量為2.5%時多糖提取率最高，達2.22%，添加量高于2.5%時反而下降；纖維素酶添加2.0%時，靈芝多糖最高提取率達到2.92%；木瓜蛋白酶添加1.2%～2.8%時可以看出多糖提取率呈現(xiàn)先上升然后下降的趨勢，在添加量為2.0%時，提取率達到最高為2.53%。選擇三種酶的最佳用量:果膠酶2.5%、纖維素酶2.0%和木瓜蛋白酶2.0%進行正交試驗。

2.1.2 正交試驗結(jié)果

由表6極差分析結(jié)果可知，RA(0.37)>RB(0.23)>RC(0.20)，果膠酶的添加量對靈芝多糖提取率的影響最大。選擇最優(yōu)方案為A2B2C3，即最佳復(fù)合酶的配比為果膠酶2.5%、纖維素酶2.0%、木瓜蛋白酶2.4%，在此比例下進行試驗，靈芝多糖最高提取率達到3.23%。

表6 復(fù)合酶配比正交試驗結(jié)果

2.1.3 酶解條件的篩選

1) 酶解時間的篩選

由酶解時間對靈芝多糖提取率的影響可知(圖2)。隨著酶解時間的延長，多糖提取率在80 min時最高，隨后呈下降趨勢。

2) 酶解溫度的篩選

由酶解溫度對靈芝多糖提取率的影響可以看出(圖3)。隨著溫度的升高，多糖類物質(zhì)能夠更好地從細胞壁釋放，48 ℃時靈芝多糖提取率達到最大值,為3.26%。

2.2 靈芝果凍的開發(fā)

2.2.1 β-環(huán)糊精添加量的確定

由β-環(huán)糊精添加量對靈芝提取液感官品質(zhì)的影響可知(圖4，5)。味覺分析系統(tǒng)顯示，與對照組相比，靈芝提取液的苦味隨著添加量的增加而下降，但酸味以及酸味后味明顯提高。當β-環(huán)糊精的添加量為7.6 g/L時，靈芝提取液的風(fēng)味最佳，苦味適中，既適當?shù)匮谏w，又不會降低靈芝特有風(fēng)味。因此，根據(jù)味覺系統(tǒng)和感官分析，較適宜的β-環(huán)糊精的添加量為7.6 g/L。

2.2.2 口感調(diào)配及感官優(yōu)化結(jié)果

低聚果糖、冰糖及山楂大棗浸膏3種輔料的添加量對靈芝提取液感官評價的影響見表7。由表7極差分析結(jié)果可知，極差RB(13.3)>RC(8.3)>RA(1.3)，因此改變冰糖使用量對靈芝提取液口感的影響最大。以K值最佳選擇最優(yōu)方案為A2B2C3，評分最佳為92分，此時混合液口感豐富，滋味協(xié)調(diào)，酸甜可口。即低聚果糖添加量0.2%，冰糖添加量8%，山楂大棗浸膏添加量5%。

表7 輔料配比感官評價正交試驗結(jié)果

2.2.3 明膠添加量的確定

由表8和圖6可以看出，隨著明膠添加量的增加，果凍的硬度、膠黏性以及彈性都呈現(xiàn)上升的趨勢，質(zhì)構(gòu)測定添加量4%的果凍時，極容易被壓碎，彈性較差；靈芝果凍的感官評分隨著明膠的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。因此，較適宜的明膠添加量為5%

表8 明膠添加量對果凍質(zhì)構(gòu)特性的影響

3 討論

3.1 酶添加量對靈芝多糖提取率的影響

單因素試驗結(jié)果顯示，不同種類的蛋白酶對靈芝多糖提取率影響的差異是由于幾種酶的作用位點不同[23]。靈芝中的主要成分是幾丁質(zhì)、半纖維素等構(gòu)成的木素層；多糖所存在細胞壁上的果膠和纖維素等物質(zhì)，可以通過添加酶促使其破裂，利于多糖的溶出，增加其溶解度。通過分析，酶添加量增多，多糖提取率下降可能是酶濃度趨于飽和或是由于溶出物質(zhì)過多，雜質(zhì)含量升高，導(dǎo)致提取率下降。

3.2 酶解條件對多糖提取率的影響

隨著酶解時間及酶解溫度的提高，靈芝多糖提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。提取率降低的原因是由于酶解時間過長而引起了多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[24]。并且當超過50 ℃時，由于溫度過高導(dǎo)致酶喪失部分活性，雜質(zhì)溶出量不斷增大，活性物質(zhì)分解使多糖提取率逐漸下降。

3.3 β-環(huán)糊精添加量對靈芝提取液感官品質(zhì)的影響

由于靈芝提取液偏苦澀，適口性差，其中呈現(xiàn)苦味的主要物質(zhì)是靈芝三萜類物質(zhì)，對肝臟有一定的保護作用，所以應(yīng)該進行保留，而不適合采用化學(xué)方法去除。結(jié)果表明隨著β-環(huán)糊精的添加，靈芝提取液苦味下降，這是由于β-環(huán)糊精是一種良好的穩(wěn)定劑和嬌味劑，能夠包埋靈芝中苦味三萜類物質(zhì)，消除異味，改善口感；但酸味以及酸味后味明顯提高可能是由于β-環(huán)糊精的物理性狀所致，其稍有果膠香氣，味微甜且?guī)嵛?。靈芝提取液的感官評分呈現(xiàn)先緩慢增加然后又稍降低的趨勢是由于一定量的β-環(huán)糊精可包埋靈芝提取液中的苦味；添加量過多又會造成風(fēng)味的不協(xié)調(diào)，使之出現(xiàn)發(fā)澀的口感，顏色變得渾濁。

3.3 β-環(huán)糊精添加量對靈芝提取液感官品質(zhì)的影響

明膠是從動物表皮和骨骼中提取的多肽高分子聚合物[25-26]，不僅凝凍效果好而且易被人體消化。通過對果凍質(zhì)構(gòu)測定和感官評價分析，明膠添加量過少成品的凝膠性差、質(zhì)地柔軟，缺乏彈性；添加過多時，由于果凍缺乏爽滑的口感，質(zhì)地偏硬粗糙，并且組織中含有大量氣泡，感官評分不高。當明膠的添加5%時，果凍的風(fēng)味色澤及口感最佳，爽滑細膩，富有彈性。

4 結(jié)論

靈芝多糖的復(fù)合酶法提取率要遠高于單一酶提取，復(fù)合酶最佳配比為果膠酶2.5%、纖維素酶2.0%、木瓜蛋白酶2.4%；單因素試驗優(yōu)化提取條件為：48 ℃酶解80 min，此時靈芝多糖的提取率為3.26%；β-環(huán)糊精的添加量為7.6 g/L時，提取液的風(fēng)味最佳，苦味適中；靈芝提取液中加入0.2%的低聚果糖、8%冰糖和5%山楂大棗浸膏時，滋味豐富，具有很好的感官評分；通過對果凍質(zhì)構(gòu)測定和感官評價分析，當明膠添加量為5%時，果凍質(zhì)地光滑細膩。該配方制作的果凍色澤明亮，口感爽滑，酸甜適口，是一款健康的現(xiàn)代休閑食品。為現(xiàn)代休閑食品行業(yè)提供新思路，以及后續(xù)靈芝的研究和生產(chǎn)提供參考和依據(jù)。