脂肪酶催化菜籽油制備甘油二酯的研究

王福超 , 曲可心， 李鉉軍

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000)

人們隨著年齡增長，機(jī)體的生理功能也逐漸減退，對糖代謝、脂類代謝及酶代謝均有影響[1]，因此對食品品質(zhì)的要求也逐漸提高。甘油二酯是油脂的天然成分，是油脂代謝的中間產(chǎn)物[2]，是由2分子脂肪酸分別結(jié)合到甘油的2個端羥基上形成的二酯，包括1,3-甘二酯和1,2-甘二酯2種同分異構(gòu)體[3]。甘油二酯不僅能改善食品風(fēng)味，延長儲存期，而且是功能食品的主要添加劑，能減少體內(nèi)的脂肪堆積，預(yù)防和治療高血脂及相關(guān)疾病[4]。在醫(yī)藥行業(yè)中，甘油二酯不僅可以作為藥物活性成分的分散介質(zhì)，還是重要的藥物中間體[5-6]。在化工行業(yè)中，甘油二酯可作為原料用于脂類、重構(gòu)脂質(zhì)和酯蛋白等多種化合物的合成，也可用于工業(yè)酶的激活劑和抑制劑等。

菜籽油為我國居民目前使用的主要油脂之一[7]，約占我國食用植物油消費量的35%[8]，菜籽油主要成分為甘油三酯 (約98%) , 同時還含有游離脂肪酸及植物甾醇、多酚、生育酚、胡蘿卜素等營養(yǎng)元素[9]。然而，菜籽油在儲存和加工過程中，其不飽和脂肪酸油酸、亞油酸容易氧化，既不利于菜籽油的儲存和加工，又破壞了其脂肪酸組成，且氧化產(chǎn)物可能對人體產(chǎn)生有害影響。若能將甘油二酯與菜籽油的優(yōu)點相結(jié)合，生產(chǎn)出既具有甘油二酯功能特性又保留菜籽油脂肪酸組成(營養(yǎng)價值)的功能性結(jié)構(gòu)化油脂，將有利于菜籽油產(chǎn)品的儲存加工及廣泛使用，并對中國的功能性健康食用油的開發(fā)具有重要的推動作用。

因此，該試驗以固定化脂肪酶(Lipozyme TL IM)催化菜籽油酶解反應(yīng)制備的甘油二酯為研究對象，對脂肪酶添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等因素對甘油二酯得率的影響進(jìn)行單因素研究試驗及正交試驗的研究，尋找產(chǎn)率優(yōu)良，環(huán)境友好，操作簡便的最佳工藝條件，為進(jìn)一步將甘油二酯應(yīng)用為食品專用油脂提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽油(西王集團(tuán))；固定化脂肪酶(Lipozyme TL IM，諾維信生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)；硅膠；固體碘；甘油；正己烷；乙醚；冰乙酸，試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平(JA1003J，上海雷韻試驗儀器制造有限公司，上海，中國)；水浴恒溫振蕩器(SHA-c，江蘇恒豐儀器廠，金壇，中國)；渦旋混合器(SI-0246，上海凡勁儀器設(shè)備有限公司，上海，中國)；高速離心機(jī)(TGL-16C，上海安亭科學(xué)儀器廠，上海，中國)；核磁共振譜儀(AVANCE III 500MHz，德國)。

1.3 制備工藝

1.3.1 工藝流程

硅膠→烘干→與甘油按一定比例混合(1∶1，w/w)→制備預(yù)吸附甘油→預(yù)吸附甘油與菜籽油混合(1∶1，mol/mol)→添加酶→恒溫振蕩器→離心→上層清液(供試樣品)。

1.3.2 制備方法

將硅膠先置于100 ℃烘箱中烘干，再與甘油以質(zhì)量比1∶1均勻混合，得到預(yù)吸附甘油。在50 mL離心管中加入5 g菜籽油和1.261 g預(yù)吸附甘油(1∶1，mol/mol)，加入固定化脂肪酶器加熱，放入配置好的樣品，反應(yīng)一定時間后取出，放入離心機(jī)中以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min后，取上清液，即為甘油二酯。取50 μL上清液用20 mL正己烷稀釋，渦旋30 s均勻混合，進(jìn)行薄層層析分析，以確認(rèn)甘油二酯的生成，最終計算轉(zhuǎn)化率。

1.4 單因素試驗

1.4.1 不同反應(yīng)時間對甘油二酯得率的影響

在恒溫振蕩器轉(zhuǎn)數(shù)(80 r/min)恒定，反應(yīng)溫度為60 ℃，脂肪酶添加量為菜籽油質(zhì)量的2%的條件下，研究反應(yīng)時間為4、6、8、10、12 h時,對甘油二酯得率的影響。

1.4.2 不同酶添加量對甘油二酯得率的影響

在恒溫振蕩器轉(zhuǎn)數(shù)恒定，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時間為8 h的條件下，研究脂肪酶添加量為菜籽油質(zhì)量的2%、4%、6%、8%和10%時,對甘油二酯得率的影響。

1.4.3 不同反應(yīng)溫度對甘油二酯得率的影響

在恒溫振蕩器轉(zhuǎn)數(shù)恒定，反應(yīng)時間為8 h，脂肪酶添加量為菜籽油質(zhì)量的2%的條件下，研究反應(yīng)溫度為45、50、55、60和65 ℃時,對甘油二酯得率的影響。

1.5 正交試驗

通過單因素試驗可以確定適宜的脂肪酶添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間，由此以脂肪酶添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間為考察因素，分別選取3個水平，以菜籽油甘油二酯為考察指標(biāo)進(jìn)行L9(34)正交試驗。因素水平見表1。

表1 因素水平表

1.6 核磁共振分析

準(zhǔn)確稱量反應(yīng)產(chǎn)物溶于1 mL的氘代氯仿(CDCl3-d)中，以TMS為內(nèi)標(biāo)，混合搖晃至完全溶解后，通過0.45 mm有機(jī)相濾膜，轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中，制成待測樣品，備用。待測樣品中1,3-甘油二酯的摩爾含量以內(nèi)標(biāo)四甲基硅烷(TMS)計算而來，其計算公式為：

式中，W1,3-DAG為產(chǎn)物中1,3-甘油二酯的摩爾含量，As 1,3-DAG為試樣特征峰1,3-DAG的峰面積，As 1,2-DAG為試樣特征峰1,2-DAG的峰面積，As TAG為試樣特征峰TAG的峰面積，As MAG為試樣特征峰MAG的峰面積，As FFA為試樣特征峰FFA的峰面積。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

所有試驗數(shù)據(jù)均以獨立試驗的均值來表示，平行試驗次數(shù)至少3次。使用統(tǒng)計分析軟件SPSS Statistics 23.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，檢驗各組數(shù)據(jù)的顯著性，顯著性水平選擇0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時間對甘油二酯得率的影響

由圖1可以看出，反應(yīng)時間為8與10 h時，甘油二酯得率顯著高于其余各組，均具有顯著差異(P<0.05)。當(dāng)反應(yīng)時間為8 h時，得率最高，而8 h過后產(chǎn)率開始下降，可能是因為隨著反應(yīng)時間的延長，酶解反應(yīng)已經(jīng)開始向負(fù)反應(yīng)方向進(jìn)行，使得率降低，也可能是隨著反應(yīng)時間的延長，發(fā)生?；D(zhuǎn)移進(jìn)一步生成甘油三酯等副產(chǎn)物，1，3-DAG的得率從而降低。所以，從提高得率的角度考慮選取較優(yōu)的反應(yīng)時間為8 h。

2.2 脂肪酶添加量對甘油二酯得率的影響

由圖2可知，脂肪酶添加量為2%與4%，添加量8%與10%之間均無顯著性差異(P>0.05)，添加2%、4%分別與6%、8%和10%之間均存在顯著性差異(P<0.05)，當(dāng)添加量為2%和4%時，得率較高?？梢钥闯鲭S著脂肪酶添加量的增加含甘油二酯層的上清液的得率降低，這可能是因為脂肪酶添加量為2%和4%時，酶與底物絡(luò)合物的濃度比較高，所以甘油二酯的得率較高，隨著脂肪酶添加量的增加，反而呈現(xiàn)下降趨勢，可能是脂肪酶與底物的結(jié)合率已經(jīng)達(dá)到飽和，而且過量的酶有可能導(dǎo)致增加反應(yīng)過程中的傳質(zhì)阻力。孫景繁等[10]人利用固載脂肪酶催化酯交換反應(yīng)最佳反應(yīng)條件為醇油物質(zhì)的量比為6∶1，固載酶2%(油重)，反應(yīng)時間為2 h，反應(yīng)溫度為50 ℃，蓖麻油的轉(zhuǎn)化率最高為92.44%。故從經(jīng)濟(jì)效益考慮單因素結(jié)果，較優(yōu)的脂肪酶添加量為2%。

2.3 反應(yīng)溫度對甘油二酯得率的影響

由圖3可以看出，反應(yīng)溫度為45和65 ℃之間有顯著差異(P<0.05)，反應(yīng)溫度為50、55和60 ℃ 3個溫度之間均無顯著性差異(P>0.05)，50、55和60 ℃得率顯著高于其余各組(P<0.05)，且反應(yīng)溫度為55 ℃時得率最高。

反應(yīng)溫度為45～55 ℃時的產(chǎn)率不斷增加，反應(yīng)溫度為60～65 ℃時呈下降趨勢。這可能是因為反應(yīng)溫度在低于50 ℃時脂肪酶還沒有完全活化，但酶解化反應(yīng)中正反應(yīng)速率大于逆反應(yīng)速率，反應(yīng)整體趨向正向反應(yīng)，當(dāng)溫度超過50 ℃時，隨著溫度的升高，酶活增大，所以得率上升趨勢變大，當(dāng)溫度為55～65 ℃時，得率處于穩(wěn)定甚至下降，這可能是因為此時正反應(yīng)速率與逆反應(yīng)速率相同，甚至逆反應(yīng)速率大于正反應(yīng)速率，此時得率將基本不再變化，甚至降低。所以選取較優(yōu)的反應(yīng)溫度為55 ℃。

2.4 最佳反應(yīng)條件的確定

L9(34)試驗結(jié)果如表2所示。由圖表中R值可以看出反應(yīng)時間、脂肪酶添加量、反應(yīng)溫度對反應(yīng)產(chǎn)物得率的影響主次順序為B>C>A，即最主要的影響因素為反應(yīng)時間，其次是脂肪酶添加量，最后為反應(yīng)溫度，由K值可以確定各因素和水平間最佳組合為A3B1C3，試驗最佳結(jié)果組合也是A3B1C3，由于D(空列)R值>A列R值，說明試驗時間對得率影響差異不大，故從生產(chǎn)效率綜合考慮，確定A3B1C3為最佳組合，即反應(yīng)時間10 h，脂肪酶添加量2%, 反應(yīng)溫度60 ℃，此時得率為57.73%。

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果

2.5 甘油二酯含量的確定

通過查閱文獻(xiàn)及對圖4進(jìn)行分析可知，該反應(yīng)在反應(yīng)過程中產(chǎn)生甘油三酯和1,3-甘油二酯，甘油三酯特征峰的化學(xué)位移為5.34 ppm，峰形為m型，1,3-甘油二酯特征峰化學(xué)位移為4.12 ppm，峰形為q型，對甘油二酯的核磁共振氫譜圖(1H-NMR)分析可知，產(chǎn)物中1,3-甘油二酯/mol%=3.43/(3.43+1.38)=71.3 mol%，甘油三酯mol%=1.38/(3.43+1.38)=28.7 mol%。

3 討論

采用菜籽油制備甘油二酯是在油脂領(lǐng)域的一種應(yīng)用，也是一種新的嘗試。將菜籽油通過酶法改性為甘油二酯，既保留了菜籽油本身的營養(yǎng)成分，同時也附帶了甘油二酯的一定功效，從而提高了產(chǎn)品的營養(yǎng)性和健康性。該研究采用的催化劑為固定化脂肪酶，與游離酶相比，固定化酶既能保持其高效專一及溫和的反應(yīng)特性，又克服了游離酶的不足之處，呈現(xiàn)出分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、工藝簡便等優(yōu)點[11]。

近年來，有許多國內(nèi)外學(xué)者對甘油二酯的制備進(jìn)行了大量的研究。馬巧霞等[3]采用脂肪酶甘油解制備甘油二酯馬油，通過單因素結(jié)合正交試驗設(shè)計，優(yōu)選出最佳反應(yīng)條件為底物比1∶0.5、酶解時間6 h、加酶量400 U/g、酶解溫度40 ℃，得到的產(chǎn)物中DAG含量為44.18%。劉四磊[12]研究了無溶劑體系中以富含ARA的微生物油脂為原料，通過酶促酯化反應(yīng)合成富含ARA的1,3-甘油二酯的工藝。最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度57 ℃，反應(yīng)時間2.7 h，酶添加量7.9%，ARA與甘油的底物摩爾比為2.5∶1，在此最優(yōu)條件下1,3-甘油二酯在反應(yīng)產(chǎn)物中DAG和TAG混合物中的相對百分含量為73.5%，這與該研究結(jié)果相近。

在現(xiàn)代化的研究過程當(dāng)中, 核磁共振技術(shù)可以應(yīng)用于食品體系當(dāng)中的水、脂肪以及糖分等多種領(lǐng)域中[13]。所以利用核磁共振法(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)進(jìn)行甘油二酯的定量測定，相比與其他測定方法，核磁共振僅需要少量樣品，且無需分離復(fù)雜的混合物，還具有同時測定樣品中多種成分含量的優(yōu)點[14]。該研究中采用脂肪酶甘油解制備甘油二酯菜籽油，通過單因素結(jié)合正交試驗設(shè)計，優(yōu)選出最佳反應(yīng)條件為酶解時間10 h、脂肪酶添加量2%、酶解溫度60 ℃，得到的產(chǎn)物中甘油二酯含量為71.3 mol%，得率為57.73%。

4 結(jié)論

該試驗以固定化脂肪酶Lipozyme TL IM催化菜籽油酶解反應(yīng)制備甘油二酯，對脂肪酶添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等因素對甘油二酯得率的影響進(jìn)行單因素研究試驗及正交試驗的研究，從而對菜籽油制備甘油二酯工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1) 根據(jù)單因素試驗和正交試驗得到對甘油二酯得率影響大小順序為酶的添加量>反應(yīng)溫度>反應(yīng)時間，最佳制備工藝：反應(yīng)時間10 h，脂肪酶添加量2%，反應(yīng)溫度60 ℃，此時甘油二酯得率為57.73%。

2) 根據(jù)核磁共振氫譜(1H-NMR)分析，該試驗制備的甘油二酯中，1,3-甘油二酯的摩爾百分比為71.3 mol%。這表明試驗所制備的甘油二酯中，1,3-甘油二酯含量很高，具有良好的營養(yǎng)保健效果，是一種可大規(guī)模生產(chǎn)的健康油脂。