Hsa_circ_0008957靶MiRNA預(yù)測(cè)及其表達(dá)載體構(gòu)建

李仙仙 魯艷芹,2,* 韓金祥,2,*

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院 (山東 濟(jì)南 250014)

2.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 (山東 濟(jì)南 250062)

CircRNA即環(huán)狀RNA分子，是通過(guò)共價(jià)鍵連接的環(huán)形構(gòu)造的不具有5’末端磷酸基和3’末端poly(A)羥基的非編碼RNA分子[1]。根據(jù)形成方式不同，circRNAs可分為內(nèi)含子circRNAs、外顯子circRNAs和內(nèi)含子-外顯子circRNAs(ElciRNA)，大多數(shù)的circRNAs來(lái)自蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子[2]。作為環(huán)狀RNA，可以有效地防止被RNA酶和核酸外切酶降解掉，比線性RNA的穩(wěn)定性要強(qiáng)。它會(huì)在血漿和外泌體中穩(wěn)定并廣泛存在，所以circRNAs常作為疾病的生物標(biāo)記物。CircRNA在不同物種間在進(jìn)化上具有高度保守性[3]；在動(dòng)物不同時(shí)期、不同組織的表達(dá)水平不同，具有表達(dá)的時(shí)序性與特異性。

circRNA分子能與miRNA中的應(yīng)答元件(miRNA response element，MRE)結(jié)合，作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenousRNA，ceRNA)與miRNA結(jié)合，中起到miRNA海綿的作用，進(jìn)而降除miRNA對(duì)其目標(biāo)基因的抑制作用，提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平[4]。

CircRNAs可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，ElciRNA可以與RNA聚合酶結(jié)合，影響其轉(zhuǎn)錄活性[5]。如果circRNAs序列中含有其母本基因的起始密碼子，可能會(huì)影響其轉(zhuǎn)錄本的翻譯，可編碼蛋白[6]。近年來(lái)，circRNAs在腫瘤疾病[7]、心腦血管疾病[8-9]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[10]以及骨相關(guān)疾病[11]等諸多病理狀態(tài)時(shí)表達(dá)異常，并且其表達(dá)水平與疾病的發(fā)生階段有緊密聯(lián)系[12]，可作為評(píng)估病情的潛在指標(biāo)。

COL1A2是Ⅰ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)基因之一，Ⅰ型膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)分布最廣、含量最豐富的的蛋白質(zhì)，起到支撐、保護(hù)機(jī)體的功能，其主要分布在真皮、肌腱、骨和牙本質(zhì)等[13]。另外它還在腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞[14]及血管細(xì)胞[15]中表達(dá)。COL1A2基因多個(gè)獨(dú)立突變會(huì)引起骨骼和心血管缺陷，如成骨不全和Ehlers-Danlos綜合征[16]。但它的突變與腫瘤的發(fā)生機(jī)理仍不清楚，只是在某些腫瘤細(xì)胞中COL1A2表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)，如結(jié)直腸癌，肝癌[17]，且COL1A2被鑒定為與轉(zhuǎn)移潛力高度相關(guān)的17個(gè)基因之一[18]，COL1A2基因在某些轉(zhuǎn)移性腫瘤中上調(diào)。

Circ RNAs 作為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)，本研究通過(guò)對(duì)COL1A2基因circRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)hsa-col1a2-circ-0008957基因進(jìn)行克隆，構(gòu)建表達(dá)載體，該circRNA尚未報(bào)道，研究意義較大，可為后續(xù)細(xì)胞水平機(jī)制方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA_bio_tek有限公司；PCR試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、內(nèi)切酶(KpnI和BamHI)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；Clon ExpressⅡ One Step Cloning Kit試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Yeast Extract和TRYPTone均購(gòu)自O(shè)XOID公司；氯化鈉試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Agar Powder購(gòu)自索萊寶科技有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pCD 2.1質(zhì)粒均由山東省罕少見(jiàn)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 Hsa_COL1A2_circ_0008957序列的獲取及引物的設(shè)計(jì)及合成。采用circbase網(wǎng)站，查詢以COL1A2為母本基因的circRNA，挑選出hsa_col1a2_circ_0008957，并獲得其基因序列，利用載體的酶切位點(diǎn)通過(guò)軟件CE Design V1.04設(shè)計(jì)基因特異性擴(kuò)增引物，用于目的基因的PCR擴(kuò)增，引物序列如下表1(黑體序列為同源臂，小寫序列為酶切位點(diǎn)，下劃線序列為正/反向環(huán)化介導(dǎo)序列)，引物均由華大基因有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法提取293T細(xì)胞總RNA，檢測(cè)核酸濃度及純度，選取合格的RNA用于cDNA合成。第一步去除基因組DNA；Random Primer(6mer)1μL，dNTP Mix(10nm)1μL，模板RNA 2μg，RNase-free ddH2O補(bǔ)足10μL，65℃5min，4℃ 2min；第二步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在第一步反應(yīng)產(chǎn)物中加入5xPrimer Script Buffer 4μL，RNase Inhibitor0.5μL，Primer Script Reverse Transcriptase 1μL，RNase-free ddH2O 4.5μL，按下列反應(yīng)程序合成第一條鏈cDNA：30℃10min；42℃60min；70℃15min[19]。產(chǎn)物置于-80℃保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增Hsa_COL1A2_circ_0008957 以cDNA為模板PCR 擴(kuò)增Hsa_COL1A2_circ_0008957，PCR 反應(yīng)體系20 μL：2xGCBuffer 10 μL，dNTP Mixture(2.5nm)1.6μL，TaKaRa Taq 0.1μL，模板cDNA(1000ng)，上下游引物各1μL，RNase-free ddH2O補(bǔ)足20μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，50℃退火20s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)。72℃延伸5min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.2.4 pCD2.1-hCOL1A2-circ-0008957重組載體構(gòu)建及檢測(cè) PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分離，將目的DNA片段進(jìn)行切膠回收純化。pCD2.1載體用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，37℃酶切4h，電泳并回收酶切產(chǎn)物，與目的片段進(jìn)行同源重組。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素(Amp+)的LB固體培養(yǎng)基上涂布，置于37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12～16h。挑取單菌落克隆，在含氨芐青霉素(Amp+)的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并將菌液進(jìn)行菌液PCR鑒定，挑取鑒定正確的的單克隆菌液利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并最終進(jìn)一步酶切驗(yàn)證，將鑒定正確的質(zhì)粒送去華大基因進(jìn)行Sanger測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并用75%甘油保存在-80℃冰箱。

1.2.5 Hsa-COL1A2-circ-0008957生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 應(yīng)用circBANK(http://www.circbank.cn/)軟件和Circular RNA Interactome 軟件(https://circinteractome.nia.nih.gov/)對(duì)hsa-COL1A2-circ-0008957進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957重組載體的驗(yàn)證用限制性內(nèi)切酶將pCD2.1原載體雙酶切后，獲得100bp左右的片段，與預(yù)期相符(圖1A)；PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增條帶大小約372bp，與預(yù)期相符(圖1B)；將純化的目的基因與線性載體pCD2.1進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定,出現(xiàn)了與預(yù)期相符的目的條帶，大小為372bp(圖1C)；提取質(zhì)粒后對(duì)其進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，重組片段也出現(xiàn)了372bp的目的條帶(圖1D)。

圖1 pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957重組載體的驗(yàn)證

2.2 重組載體pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957 Sanger測(cè) 將陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，與預(yù)期結(jié)果完全一致，表明成功構(gòu)建pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957重組載體(圖2)。

圖2 pCD2.1-hCOL1A2-circ0008957 Sanger測(cè)序結(jié)果

2.3 Hsa-COL1A2-circ0008957生物信息學(xué)預(yù)測(cè)應(yīng)用軟件分析，其在circBANK中的ID為hsa_circCOL1A2_116，開放閱讀框長(zhǎng)度(ORF-SIZE)為171bp；存在IRES(internal ribosome entry site)序列，可通過(guò)此啟動(dòng)翻譯行使編碼蛋白的功能，這與其他普通線性RNA是不同的；網(wǎng)站中提供的coding_prob卻為0.0019(范圍為0-1)，分?jǐn)?shù)較低，表明其編碼潛力較低，其功能還待進(jìn)一步研究，在網(wǎng)站中檢索到該circRNA位于其母本基因COL1A2的mRNA的外顯子中，且被發(fā)現(xiàn)存在于成骨細(xì)胞、皮下前脂肪細(xì)胞、膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中。Circular RNA Interactome 軟件預(yù)測(cè)到hCOL1A2-circ-0008957相互結(jié)合的miRNA有17種，其中與成骨分化和骨質(zhì)疏松相關(guān)的miRNA有5種，該circRNA與5種miRNA的結(jié)合位點(diǎn)如圖3。

圖3 circRNA與靶向MiRNA的結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

CircRNA較其他線性RNA研究開始較晚，隨著circRNA研究的深入開展，越來(lái)越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)。CircRNA多在腫瘤中報(bào)道，有少量關(guān)于骨相關(guān)疾病的報(bào)道。本研究中，hsa-COL1A2-circ-0008957在之前從未報(bào)道，該circRNA無(wú)編碼蛋白的功能，猜測(cè)它靶向miRNA分子海綿進(jìn)而調(diào)節(jié)成骨分化。通過(guò)circinteractome數(shù)據(jù)庫(kù)得出17種靶向miRNA分析，其中hsa-miR-1305、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-421、hsa-miR-548c-3p和hsa-miR-628-3p五種miRNA與骨質(zhì)疏松，成骨分化相關(guān)；hsa-miR-618、hsa-miR-561、hsa-miR-1233、hsa-miR-1305、hsamiR-558、hsa-miR-577、hsa-miR-518a-5p、hsamiR-527、hsa-miR-1200和hsa-miR-1183與腫瘤疾病相關(guān)；hsa-miR-561可作為腫瘤的生物靶標(biāo)，hsa-miR-1200也可作為妊娠糖尿病的靶標(biāo)；hsa-miR-1225-3p、hsamiR-1183和hsa-miR-197與自身免疫系統(tǒng)疾病相關(guān)。COL1A2作為該circRNA的母本基因，它與骨骼發(fā)育有關(guān)，為后續(xù)研究其在成骨分化中的作用奠定基礎(chǔ)。