7-羥基黃烷酮抑制大鼠生長板軟骨細(xì)胞凋亡及對脛骨生長的影響

研究表明，芳香化酶抑制劑能夠減少生長期體內(nèi)雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，抑制生長板軟骨細(xì)胞凋亡，從而起到延緩骨骺閉合，促進(jìn)身高增長的目的

。而7-羥基黃烷酮作為一種天然產(chǎn)物黃酮類化合物，具有較好的芳香化酶抑制作用

。前期的實驗發(fā)現(xiàn)其具有抑制生長板軟骨細(xì)胞凋亡的效果，但是最佳藥物濃度尚無定論

。因此本研究對其抑制生長板軟骨細(xì)胞凋亡的最佳藥物濃度進(jìn)行篩選，并對其延遲骨骺閉合促進(jìn)長骨生長進(jìn)行驗證，為該藥物的臨床使用及后續(xù)實驗提供一定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器1.1.1 主要試劑 0.25%胰蛋白酶，胎牛血清，IL-1β，來曲唑，7-羥基黃烷酮，MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒MTT，膠原蛋白酶Ⅱ，臺盼藍(lán)染色液，曲拉通，4'，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽DAPI溶液，二甲基亞砜DMSO，封閉山羊血清，流式細(xì)胞術(shù)ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，Ⅱ型膠原抗體Collagen Type ⅡAntibody，熒光封片劑Fluoromount-G。

本文將該滑坡的物理介質(zhì)概化成滑體土與滑床基巖兩種介質(zhì)，基于FLAC3D數(shù)值分析平臺和該滑坡的幾何形態(tài)特征，構(gòu)建的數(shù)值模型如圖10所示。其中，滑體表面的102、100號點分別對應(yīng)著JCD-1、JCD-2地表GPS監(jiān)測點。

1.1.2 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)孔板，電子天平，恒溫水浴鍋，37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，電熱恒溫震蕩水槽，立式壓力蒸汽滅菌器，高速離心機(jī)，高級分析倒置顯微鏡，流式細(xì)胞儀，多功能酶標(biāo)儀，血球計數(shù)板。

1.2 實驗方法

1.2.3 流式細(xì)胞儀驗證7-羥基黃烷酮對IL-1β引起細(xì)胞凋亡的抑制作用 取培養(yǎng)的對數(shù)期生長板軟骨細(xì)胞，以正常培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對照組；以20 ng/mL IL-1β誘導(dǎo)每孔細(xì)胞凋亡為模型對照組；以加入來曲唑為陽性對照組；以加入40 μM 7-羥基黃烷酮為7-羥基黃烷酮組，各組培養(yǎng)24 h。懸浮棄上清。然后用1mL Binding Buffer重懸細(xì)胞。每管加入100 μL細(xì)胞（1×10

個）。再向管中加入5 μL Annexin V-FITC。室溫避光，混勻10 min。加入5 μL PI，室溫避光，孵育5 min。加入PBS至500 μL，混勻。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。觀察各組細(xì)胞凋亡情況，并統(tǒng)計細(xì)胞凋亡率。

1.2.1 羊水染色體核型分析 在無菌操作條件下抽取羊水約10ml，并進(jìn)行接種、培養(yǎng)、收獲、制片、G顯帶及核型分析。

2.2 7-羥基黃烷酮抑制生長板軟骨細(xì)胞凋亡的初步藥物濃度篩選 溶劑組及非造模＋用藥組軟骨細(xì)胞活率與正常組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，培養(yǎng)24 h的10、20、40、60 μM 7-羥基黃烷酮均對生長板軟骨細(xì)胞的凋亡有抑制作用，與模型組比較差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（

＜0.01），且作用比陽性對照組好，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（

＜0.01）。其中最佳的藥物濃度為40 μM，見表1。

2013年1月至2015年12月我院對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)患者150例開展了分析研究,患者臨床中都有典型的冠心病癥狀,使用各種診斷方式均確診為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病[3-4]。全部患者共有71例女性患者和79例男性患者,患者最小是55歲,最大是86歲,平均(71.87±13.62)歲。此次我們就患者的臨床病例資料開展了分析比較,患者對此次研究知情且同意參與。

1.2.4 7-羥基黃烷酮對大鼠骨骺閉合及脛骨生長的影響 36只4周齡雌性SD大鼠分為正常對照組、陽性對照組及用藥組，每組各12只。正常對照組每天灌胃去離子水。陽性對照組每天灌胃0.325 mg/kg來曲唑，用藥組每天灌胃100 mg/kg 7-羥基黃烷酮。正常組每15 d拍攝X線片觀察骨骺閉合情況，當(dāng)正常組閉合數(shù)量超過2/3時，對陽性對照組及用藥組同時拍攝X線片觀察骨骺閉合例數(shù)并進(jìn)行記錄。當(dāng)所有大鼠骨骺均閉合后采用脫頸椎法處死大鼠，使用游標(biāo)卡尺測量脛骨長度，進(jìn)行各組間比較。

在拍攝前最好查一下天氣條件是否合適。這個場景中的暗沉天空為James的照片定下了硬朗的基調(diào)。沒有這種天氣，涂鴉的背景和粗獷感就不會如此突出。

2.1 軟骨細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果 Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞分泌的特異性膠原，可利用其免疫熒光對軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定

。大鼠生長板軟骨細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行免疫熒光實驗，結(jié)果顯示，在熒光倒置相差顯微鏡下，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后在不同波段熒光激發(fā)出藍(lán)色熒光，見圖1A，細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)出清晰紅色熒光，見圖1B。表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)特征性Ⅱ型膠原，符合軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特征，證明本實驗方法能夠分離培養(yǎng)出純度較高的軟骨細(xì)胞，可供進(jìn)一步實驗研究使用。

2 結(jié)果

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對不同濃度7-羥基黃烷酮對生長板軟骨細(xì)胞的凋亡影響比較及大鼠脛骨生長長度的影響比較采用單因素方差分析，對大鼠脛骨平臺骨骺閉合例數(shù)影響的比較采用χ

檢驗，以

＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.1 大鼠生長板軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定 2只4周齡雌性SD大鼠處死體外分離脛骨生長板軟骨，沖洗并充分剪碎。加入2 mL 1%Ⅱ型膠原酶，37 ℃水浴鍋振蕩5 h后，過濾離心5 min后收集細(xì)胞沉淀PBS清洗2次。完全培養(yǎng)基反復(fù)吹打混勻制成細(xì)胞懸液。血球計數(shù)板計數(shù)，臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞的活力。將懸液接種到裝有含10%胎牛血清DMED/F12培養(yǎng)液的T25培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃含體積百分?jǐn)?shù)為5%的CO

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長情況，每2 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞接近80%～90%匯合時進(jìn)行傳代。取傳代的細(xì)胞爬片于24孔板中，每孔加入培養(yǎng)基1 mL，加入細(xì)胞1×10

個/孔，置于培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。細(xì)胞爬片后，吸出培養(yǎng)基PBS洗1遍，加入PFA于4 ℃固定30 min。用PBS洗3×5 min/次。最后一次不吸出PBS，4 ℃過夜。除去玻片水分并用封閉液封閉。陽性玻片一抗孵育過夜，陰性玻片不孵育一抗。二抗避光孵育2 h后PBS洗3×5 min/次，染DAPI5min，PBS洗3×5 min/次。玻片上各滴1滴Fluoromount-G，將有細(xì)胞的一面蓋上。進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.2.2 MTT法初步觀察7-羥基黃烷酮對生長板軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的影響 取對數(shù)期生長的大鼠生長板軟骨細(xì)胞消化處理后，按1×10

/孔接種于96孔板，置于37 ℃，5% CO

培養(yǎng)箱，正常培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對照組；模型對照組和陽性對照組加入20 ng/mL IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，陽性對照組中同時加入5 μm來曲唑；以配制藥物的DMSO溶液為溶劑組；以正常細(xì)胞加入濃度為40 μM 7-羥基黃烷酮為非造模＋用藥組；以加入20 ng/mL IL-1β的同時分別加入濃度為10、20、40、60 μM 7-羥基黃烷酮的培養(yǎng)液為實驗1～4組。每孔200 μL，每組設(shè)6個復(fù)孔。置于37 ℃，5% CO

培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h和48 h后，取出96孔板，將20 μL MTT溶液加入到每個培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，取出96孔板，吸除培養(yǎng)基，每孔加入150 μL Formazan溶液，置搖床上低速振蕩30 min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在OD 570 nm處測量各孔的吸光值。

支撐架(圖2)的作用首先是用于承受壓裝時裝置所受的的軸向載荷，在裝置吊運時承受整個裝置的重力，要求結(jié)構(gòu)呈360°等分，剛度大。為此我們設(shè)計成采用Q235材料的工字型的六根梁，并且在兩邊各焊了25 mm厚的Q235鋼板作為加強(qiáng)筋，焊后去應(yīng)力退火。其次，支撐架將作為液壓站、拉桿連接套、電接點壓力表、吊耳等的載體，面積較大，我們將這些零部件，均勻地布置在支撐架的上方，避免吊運時發(fā)生傾斜。

2.3 流式細(xì)胞儀驗證7-羥基黃烷酮對IL-1β引起細(xì)胞凋亡的抑制作用 流式細(xì)胞儀檢驗結(jié)果顯示，正常組幾乎均為正?；罴?xì)胞，模型組各時期凋亡細(xì)胞較多，陽性對照組可以抑制生長板軟骨細(xì)胞凋亡，而7-羥基黃烷酮組效果略優(yōu)于陽性對照組，見圖2。在細(xì)胞凋亡率方面也得到相同結(jié)果，見圖3。

2.4 7-羥基黃烷酮對大鼠骨骺閉合及脛骨生長的影響 當(dāng)模型組大鼠脛骨平臺骨骺閉合例數(shù)超過2/3 時，用藥組及陽性對照組的骨骺閉合例數(shù)均少于模型組（

＜0.01），見表2。通過對同一時間點模型組與用藥組及陽性對照組大鼠脛骨平臺X線片顯示，模型對照組大鼠骨骺閉合，而用藥組及陽性對照組大鼠骨骺未閉合。最終對大鼠脛骨長度測量，結(jié)果顯示用藥組大鼠脛骨長度長于模型對照組及陽性對照組（

＜0.05），見表3。

3 討論

骨骼增長結(jié)束的標(biāo)志是骨骺閉合，而骨骺閉合以生長板軟骨細(xì)胞的凋亡為直接誘因，由生長后期過高的雌激素導(dǎo)致

。雌激素是女性主要的性激素，主要由卵巢分泌或雄性激素經(jīng)芳香化酶轉(zhuǎn)化而來

。女性身體中的部分和男性身體中的大部分雌激素都是以雄激素為來源，從皮膚、脂肪、神經(jīng)等周邊組織由芳香化酶轉(zhuǎn)化而來

。因此，如果能抑制芳香化酶將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，理論上就能夠減少生長板軟骨細(xì)胞凋亡，延緩骨骺閉合，促進(jìn)身高增長。芳香化酶是細(xì)胞色素P450酶系中的一種混合功能氧化酶，其主要作用是將睪酮和雄烯二酮轉(zhuǎn)化為雌二醇和雌酮，即雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)變

；而芳香化酶抑制劑（AIS）可以抑制這一反應(yīng)，從而降低向雌激素轉(zhuǎn)化，進(jìn)而達(dá)到延緩骨骺閉合的目的。由于芳香化反應(yīng)是類固醇激素生物合成過程中獨特的反應(yīng)，而且雌激素是這種反應(yīng)的最終產(chǎn)物，因此芳香化酶抑制所導(dǎo)致的雌激素減少不會影響其他類固醇激素的產(chǎn)生，故AIS可以應(yīng)用于臨床

，例如第三代非甾體類AIS來曲唑，具有高選擇性、可逆性和高效性等特點，目前已廣泛應(yīng)用于乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌以及青春期特發(fā)性身材矮小男童的等疾病治療當(dāng)中

，因此，研發(fā)新一代效果好、不良反應(yīng)少的芳香化酶抑制劑成為研究的熱點。

天然產(chǎn)物一直是創(chuàng)新藥物及其先導(dǎo)化合物的來源之一，具有化學(xué)種類多、結(jié)構(gòu)新穎等特點

，其中7-羥基黃烷酮作為天然黃酮類化合物的一種，研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的芳香化酶抑制作用，但對于其最適藥物濃度，臨床上尚無統(tǒng)一定論

。因此，本次研究對7-羥基黃烷酮抑制大鼠生長板軟骨細(xì)胞凋亡的最適藥物濃度進(jìn)行篩選。我們首先采用倒置相差顯微鏡及Ⅱ型膠原免疫熒光實驗對分離的大鼠生長板軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定，從而為后續(xù)實驗提供基礎(chǔ)。隨后建立正常對照組、模型對照組、陽性對照組、溶劑組、非造模＋用藥組以及實驗1～4組并對各組軟骨細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行比較。最終得到抑制大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的最佳藥物濃度為40 μM，同時通過體外動物實驗證實，7-羥基黃烷酮的確能夠延緩骨骺閉合，從而促進(jìn)脛骨生長。基于此，我們認(rèn)為本次實驗證實7-羥基黃烷酮能夠延緩大鼠骨骺閉合，促進(jìn)脛骨增長，其機(jī)制可能與通過藥物抑制芳香化酶反應(yīng)，從而降低雌激素轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制生長板軟骨細(xì)胞凋亡有關(guān)。而在7-羥基黃烷酮抑制大鼠生長板軟骨細(xì)胞凋亡，最適藥物濃度篩選中，40 μM濃度效果最佳，這也為今后該藥物應(yīng)用臨床提供了實驗數(shù)據(jù)和理論支持。

綜上所述，本次研究結(jié)果顯示，7-羥基黃烷酮能夠抑制大鼠生長板軟骨細(xì)胞凋亡，最適藥物濃度為40 μM。此外，體外實驗證實給予大鼠灌胃7-羥基黃烷酮的確能夠延緩骨骺愈合，促進(jìn)脛骨生長。

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