CRISPRi/ddCpf1 促進大腸桿菌中丙二酰輔酶A 的積累

洪煦琳， 賈 笑， 肖 毅

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

丙二酰輔酶A（malonyl-CoA） 是食品、保健品等產(chǎn)品中多種有價值化合物合成的重要前體物質(zhì)，比如次級代謝產(chǎn)物類黃酮、聚酮化合物和脂肪酸等[1-2]。 大多數(shù)宿主中，丙二酰輔酶A 通過乙酰輔酶A 羧化酶 （acetyl-CoA carboxylase，ACC） 催化乙酰輔酶A 羧化合成而來[3]。 由于許多次級代謝產(chǎn)物的天然生產(chǎn)菌株難以大規(guī)模培養(yǎng)、 基因操作困難，易遺傳操作的大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）已成為次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的常用微生物細(xì)胞工廠。 然而，E. coli 中的丙二酰輔酶A 被用于產(chǎn)生脂肪酸和磷脂，僅留下少量可用于其他次級代謝[4-5]，是大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)次級代謝產(chǎn)物的潛在瓶頸[6]。 目前，通過基因調(diào)控提高丙二酰輔酶A 的含量，可以促進多種下游目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成，如白藜蘆醇和柚皮苷等類黃酮化合物[7]。實驗表明，丙二酰輔酶A 的常規(guī)基因敲除會明顯影響細(xì)胞生長，導(dǎo)致生長遲緩甚至細(xì)胞死亡[8]。 而添加脂肪酸代謝抑制劑淺藍(lán)菌素（cerulenin） 可以顯著提高細(xì)胞內(nèi)丙二酰輔酶A 的水平[9]，這表明可以通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄來提高丙二酰輔酶A 水平。

基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR） 是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)， 常見于細(xì)菌和古細(xì)菌中，可以對外源侵入的核酸進行靶向切割，從而起到保護自身免受外源核酸侵害的免疫作用。 CRISPR 系統(tǒng)由Cas （CRISPR-associated protein） 蛋白和crRNA（CRISPR RNA） 相互作用形成核糖核蛋白復(fù)合體， 在成熟crRNA 的指導(dǎo)下，識別靶向DNA 序列并進行切割。 基因工程中，crRNA和tracrRNA 可以人工改造并融合成sgRNA（singlemolecule guide RNA） 用于基因組編輯[10]。 CRISPR干擾是一種基于CRISPR 系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)錄抑制技術(shù)， 利用催化失活的Cas 蛋白 （dead Cas protein，dCas）對特定基因轉(zhuǎn)錄進行下調(diào)[11]。以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為例，dCas9 是Cas9 的催化失活突變體，dCas9-sgRNA 復(fù)合體能夠與DNA 特異性結(jié)合而不進行核酸切割， 通過空間阻礙RNA 聚合酶（RNA polymerase，RNAP） 的轉(zhuǎn)錄過程，從而抑制目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄[11]。 代謝工程中，CRISPRi 技術(shù)可用于下調(diào)代謝競爭途徑、抑制轉(zhuǎn)運蛋白的活性等，從而提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量、減少毒性中間體和副產(chǎn)物[12]。目前，CRISPRi 已經(jīng)被用于多種代謝工程宿主，包括Escherichia[13]、Mycobacterium[14]、Clostridium[15]、Corynebacterium[16]、Pseudomonas[17]。 Cpf1 是II 類Ⅴ-A 型CRISPR 系統(tǒng)， 具有和Cas9 同源的類RuvC 內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域[18]。 由于其具有組成簡單、特異性高、能同時作用多靶點、脫靶效應(yīng)更低[19]等優(yōu)勢，被視為常用基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9 的替代品，已經(jīng)被開發(fā)成為多重基因編輯、基因調(diào)控的工具，應(yīng)用于代謝工程[20-22]。 Ji 等用ddCpf1 替代化學(xué)抑制劑用于下調(diào)fabI 基因的表達(dá)，將丁烯酸的產(chǎn)量提高了6 倍[22]。Li 等在谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）中應(yīng)用CRISPR/dCpf1 抑制gltA、pck、pgi 和hom 基因（參與賴氨酸合成） 表達(dá)，將賴氨酸產(chǎn)量提高了4倍以上[23]。

噬菌體T7 的基因2 編碼的一種大腸桿菌RNA聚合酶抑制劑Gp2 蛋白， 可以干擾DNA 在RNAP下游的正確定位，有效抑制E-σ70轉(zhuǎn)錄起始[24]，表現(xiàn)了其在抑制基因轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控潛力。 另外，小分子化合物可以通過生物分子傳感器進行胞內(nèi)實時檢測和分析[25]。

作者首先構(gòu)建了丙二酰輔酶A 的生物傳感器，實現(xiàn)了丙二酰輔酶A 的快速、可視化檢測。 隨后在大腸桿菌中構(gòu)建了CRISPRi/ddCpf1 系統(tǒng)，并嘗試將ddCpf1 和Gp2 蛋白融合。最終通過CRISPRi/ddCpf1多靶點下調(diào)脂肪酸等代謝途徑，實現(xiàn)了丙二酰輔酶A 的積累， 為解決其下游目標(biāo)產(chǎn)物生物合成的瓶頸問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒大腸桿菌DH5α 用于載體構(gòu)建，大腸桿菌BL21（DE3）用于生物傳感器實驗，由作者所在實驗室保藏；Stable Competent E. coli 購于美國New England Biolabs 公司， 用于CRISPRi/ddCpf1 系統(tǒng)功能驗證和優(yōu)化；pS7a-acc、pBVSC 為作者所在實驗室保存質(zhì)粒，pAJK-RFP 質(zhì)粒為作者構(gòu)建。

1.1.2 實驗試劑胰蛋白胨、 酵母提取物： 英國Oxoid 公司產(chǎn)品；GeneRular 1kb DNA Ladder、 瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Phusion Polymerase： 美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；10× TAE buffer：大連美侖生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；卡那霉素、甘油、氯霉素：生工生物工程上海（股份）有限公司產(chǎn)品；L-阿拉伯糖： 上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；氯化鈉、瓊脂粉、葡萄糖：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；2×ES Taq Mastermix（Dye）：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；GeneRed 核酸染料、質(zhì)粒小提試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；10×DNA Loading buffer：南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；BSA（牛血清白蛋白）：德國Sigma 公司產(chǎn)品；T4 連接酶、Dpn I 、Bsa I 限制性核酸內(nèi)切酶： 美國New England Biolabs 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制10 g/L 氯霉素（Cm）溶液：稱取0.1 g Cm 粉末溶于10 mL 的無水乙醇中， 于－20 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

100 g/L 氨芐青霉素（Amp）溶液：稱取0.2 g 粉末溶于2 mL 的ddH2O 中，過濾除菌，于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

50 g/L 卡那霉素（Kan）溶液：稱取0.1 g Kan 粉末溶于2 mL 的ddH2O 中，過濾除菌，于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

0.5 mol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）溶液： 稱取1.19 g IPTG 加入適量的滅菌ddH2O，定容至10 mL，過濾除菌，于－20 ℃避光保存。

LB 培養(yǎng)基：5 g 酵母提取物、10 g NaCl、10 g 胰蛋白胨， 加入去離子水?dāng)嚢杌靹颍?用量杯定容至1 L，高溫高壓滅菌20 min。 添加12 g/L 瓊脂粉的LB培養(yǎng)基即為固體培養(yǎng)基。

1 mol/L 阿拉伯糖（Ara）溶液：稱取0.75 g Ara粉末，加終體積為5 mL 的ddH2O 溶解，過濾除菌，4℃低溫保存。

1.2.2 載體、引物和菌株構(gòu)建載體采用Oligo anneal 和Golden-gate 克隆方法進行構(gòu)建，構(gòu)建模板來自枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、BglBrick 系列質(zhì)粒[26]和Addgene 網(wǎng)站購買質(zhì)粒。 引物合成于北京擎科生物科技有限公司上海分公司。 采用電轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，挑取單克隆，獲得目的菌株。

1.2.3 熒光值的測定將菌種置于3 mL 的LB 液體培養(yǎng)基（20 mg/L Kan 溶液、25 mg/L Cm 溶液、100 mg/L Amp 溶液， 抗生素添加種類根據(jù)具體菌株調(diào)整） 中220 r/min 條件下37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，將體積分?jǐn)?shù)2%的種子液轉(zhuǎn)接于3 mL 的LB 液體培養(yǎng)基（含相應(yīng)的抗生素），振蕩培養(yǎng)，在OD600為0.4～0.6 加入誘導(dǎo)劑，一定時間內(nèi)吸取150 μL 或200 μL培養(yǎng)液于酶標(biāo)儀中進行熒光值和OD600的測量。 對于ddCpf1 功能驗證，OD600為0.6 時加入10 mmol/L Ara 溶液，2 h 后加入0.3 mmol/L IPTG， 振蕩培養(yǎng)4.5 h，吸取200 μL 的培養(yǎng)液于酶標(biāo)儀中進行測定。酶標(biāo)儀設(shè)定程序： 發(fā)射波長612 nm， 激發(fā)波長560 nm。 相對熒光值的計算公式如下：

式中：F/OD600為相對熒光值；Fm為實驗組熒光值；ODm為實驗組OD600；Fb為LB 液體培養(yǎng)基的熒光值；ODb為LB 液體培養(yǎng)基的OD600。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙二酰輔酶A 生物傳感器的設(shè)計與構(gòu)建

為了對大腸桿菌內(nèi)的丙二酰輔酶A 進行方便檢測，設(shè)計構(gòu)建丙二酰輔酶A 生物傳感器，通過紅色熒光測量評估丙二酰輔酶A 的胞內(nèi)濃度。 FapR蛋白來自枯草芽孢桿菌，可以特異性結(jié)合丙二酰輔酶A[25]。 如圖1（a）所示，以J23119 啟動子為改造基礎(chǔ)，在-35、-10 區(qū)域前后插入FapR 蛋白結(jié)合位點，設(shè)計響應(yīng)丙二酰輔酶A 濃度的啟動子。 當(dāng)胞內(nèi)丙二酰輔酶A 濃度較低時，F(xiàn)apR 蛋白結(jié)合啟動子，阻礙紅色熒光蛋白 （red fluorescent protein，RFP） 表達(dá)；當(dāng)胞內(nèi)丙二酰輔酶A 濃度較高時，F(xiàn)apR 蛋白結(jié)合游離的丙二酰輔酶A，RFP 正常表達(dá)，可檢測到顯著紅色熒光。 在此，設(shè)計了7 種不同F(xiàn)apR 蛋白結(jié)合位點的插入組合，見表1。 隨后，構(gòu)建丙二酰輔酶A 生物傳感器（pAJK-RFP 質(zhì)粒），用阿拉伯糖啟動子控制FapR 蛋白組成型表達(dá)， 用丙二酰輔酶A 響應(yīng)啟動子控制RFP 表達(dá)，見圖1（b）。

圖1 丙二酰輔酶A 生物傳感器原理圖及質(zhì)粒Fig. 1 Diagram and the plasmid of malonyl-CoA biosensor

表1 丙二酰輔酶A 響應(yīng)啟動子的序列Table 1 Sequences of malonyl-CoA responsive promoters

2.2 丙二酰輔酶A 生物傳感器的評估

為了驗證丙二酰輔酶A 生物傳感器的功能，采用pS7a-acc 質(zhì)粒過表達(dá)acc 基因促進丙二酰輔酶A 的積累，見圖2。 將pAJK-RFP、pS7a-acc 質(zhì)粒（見圖1（b）和圖2（b）） 轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3），分別采用0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)ACC 過表達(dá)，逐步使胞內(nèi)的丙二酰輔酶A 濃度增加，從而開啟生物傳感器的熒光信號。 通過檢測紅色熒光值和OD600，計算生物傳感器在不同IPTG 誘導(dǎo)濃度下的相對熒光值， 獲得丙二酰輔酶A 生物傳感器的響應(yīng)曲線（見圖3）。 J12 生物傳感器滲漏控制較好， 在沒有IPTG 的時候無顯著熒光， 在100 μmol/L 以上的IPTG 存在時，可檢測到顯著的紅色熒光，相對熒光值提高了3.26 倍；J233 生物傳感器的熒光響應(yīng)較為明顯，在10 mmol/L IPTG 存在時，相對熒光值提高了5.83 倍。 后續(xù)實驗選擇J233 生物傳感器進行。

圖2 丙二酰輔酶A 生物傳感器的功能驗證Fig. 2 Functional verification of malonyl-CoA biosensor

圖3 不同丙二酰輔酶A 生物傳感器的響應(yīng)曲線Fig. 3 Response curves of different malonyl-CoA biosensors

2.3 CRISPRi/ddCpf1 系統(tǒng)的構(gòu)建

為了構(gòu)建催化失活的Cpf1， 構(gòu)建了來自Francisella novicida 的Cpf1 效應(yīng)蛋白的3 個突變體， 分別是D917A 單突變、E1006A 單突變和D917A-E1006A 雙突變。 為了驗證CRISPRi/ddCpf1系統(tǒng)的功能及特點， 針對PTrc啟動子誘導(dǎo)型表達(dá)的RFP 基因設(shè)計了4 個crRNA （見圖4）：p-T、p-NT、R-T、R-NT，并分別靶向PTrc啟動子的模板鏈、非模板鏈和靶向RFP 基因的模板鏈、非模板鏈。 以熒光數(shù)值來判斷CRISPRi/ddCpf1 系統(tǒng)的效果。

圖4 基于CRISPRi/ddCpf1 的基因抑制設(shè)計Fig. 4 Design of gene inhibition based on CRISPRi/ddCpf1

結(jié)果顯示，當(dāng)crRNA 靶向啟動子區(qū)域時，p-T1、p-NT1 的相對熒光值在ddCpf1-M1 實驗組中分別下降了89.7%和88.0%， 在ddCpf1-M2 實驗組中分別下降了79.7%和87.8%， 在ddCpf1-M1-M2 實驗組中分別下降了91.8%和87.0%（見圖5）。 可見，突變效應(yīng)蛋白ddCpf1-M1、ddCpf1-M2 和ddCpf1-M1-M2 對于p-T1、p-NT1 有較為明顯的基因下調(diào)效果，且無論靶向模板鏈或非模板鏈均能得到較好的抑制效果，這與以前報道的研究結(jié)果一致[20]。當(dāng)crRNA靶向RFP 基因，R-T1、R-NT1 的相對熒光值在ddCpf1-M1 實驗組中分別下降了47.6%和2.2%，R-T1 的相對熒光值在ddCpf1-M1-M2 實驗組中下降了57.4%（見圖5）。 可見， 靶向RFP 基因時ddCpf1 的下調(diào)效率均小于靶向啟動子區(qū)域時的下調(diào)效率。 對于CRISPRi/ddCpf1 系統(tǒng)，crRNA 靶向基因表達(dá)的啟動子區(qū)域可以獲得較好的基因下調(diào)效果。

圖5 CRISPRi/ddCpf1 的基因抑制Fig. 5 Gene inhibition by CRISPRi/ddCpf1

2.4 CRISPRi/ddCpf1-Gp2 系統(tǒng)的構(gòu)建

在應(yīng)用中， 將dCas 蛋白融合其他功能蛋白是一個常見的改進策略。 有研究者利用dCas9 融合蛋白構(gòu)建的CRISPRoff 蛋白可以持久且特異性地沉默基因表達(dá)[27]；也有研究者融合dCas9 和轉(zhuǎn)錄抑制子（如Kox1 的KRAB 結(jié)構(gòu)域）， 在人類和酵母細(xì)胞中實現(xiàn)穩(wěn)定有效的轉(zhuǎn)錄抑制， 揭示了dCas 融合蛋白在CRISPR 功能優(yōu)化中的潛力[28]。 作者嘗試將功能蛋白和ddCpf1 蛋白融合， 優(yōu)化CRISPRi/ddCpf1 系統(tǒng)的調(diào)控功能。

研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體基因2 編碼的Gp2 蛋白可以降低RNA 聚合酶對啟動子區(qū)域的DNA 親和力，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制[29]。受此啟發(fā)，為了進一步提高轉(zhuǎn)錄抑制效率，將ddCpf1-M1 和Gp2 抑制蛋白進行融合表達(dá)（見圖6（a））。 選擇來自Enterobacteria phage BA14、Enterobacteria phage T3、Enterobacteria phage K1F和Klebsiella phage K11[30]的Gp2 蛋白，通過連接子（Ala-Ala，AA）， 分別在ddCpf1-M1 的N 端和C 端進行融合表達(dá)（CRISPRi/ddCpf1-Gp2），見圖6（b）。

圖6 CRISPRi/ddCpf1 關(guān)于Gp2 蛋白的基因轉(zhuǎn)錄抑制Fig.6 Transcriptional inhibition of CRISPRi/ddCpf1-Gp2

結(jié)果表明， 對于Enterobacteria phage BA14 的Gp2 蛋白，連接順序為Gp2-AA-ddcpf1-M1 的實驗組的相對熒光值下降了36.1%、OD600下降了47.4%，ddcpf1-M1-AA-Gp2 實驗組的相對熒光值下降了 30.3% 、OD600下降了 57.3% ； 對于Enterobacteria phage T3 的Gp2 蛋白，ddcpf1-M1-AA-Gp2 實驗組的相對熒光值下降了19.5%、OD600下降了63.5%； 對于Enterobacteria phage K1F 的Gp2 蛋白，Gp2-AA-ddcpf1-M1 實驗組的相對熒光值下降了37.4%、OD600下降了44.9%，ddcpf1-M1-AA-Gp2 實驗組的相對熒光值下降了24.2%、OD600下降了34.2%；對于Klebsiella phage K11 的Gp2 蛋白，Gp2-AA-ddcpf1-M1 實驗組的相對熒光值下降了21.0%、OD600下降了51.9%，ddcpf1-M1-AA-Gp2實驗組的相對熒光值下降了30.8%、OD600下降了65.1%（見圖7）。 可見，4 種Gp2 蛋白均有一定抑制基因轉(zhuǎn)錄的功能， 但表達(dá)Gp2 蛋白的實驗組中，OD600均顯著降低。 這可能是因為Gp2 蛋白的表達(dá)產(chǎn)生了毒性，在一定程度上干擾了大腸桿菌的生長和代謝，導(dǎo)致CRISPRi 的低效。

圖7 4 種Gp2 蛋白的基因抑制結(jié)果Fig. 7 Gene suppression of four Gp2 proteins

2.5 通過CRISPRi/ddCpf1 技術(shù)促進大腸桿菌中丙二酰輔酶A 的積累

CRISPR 干擾可以下調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄， 從而調(diào)控基因表達(dá)。為了促進大腸桿菌中丙二酰輔酶A 的合成，利用ddCpf1 雙突變體（D917A-E1006A） 構(gòu)建了CRISPRi/ddCpf1 雙靶點系統(tǒng)，設(shè)計了CRISPR array（ 見表2） 同時靶向兩個基因：adhE （ 編碼acetaldehyde dehydrogenase， 乙醛脫氫酶） 基因、fabF （編碼3-oxoacyl-acyl carrier protein synthase II，3-氧代?；?酰基載體蛋白合酶II） 基因和fabB（編碼3-oxoacyl-acyl carrier protein synthase I，3-氧代酰基-?；d體蛋白合酶I ）基因、sucC（編碼succinyl-CoA synthetase，琥珀酰輔酶A 合成酶） 基因[1]，并進行CRISPR 干擾。通過檢測RFP 相對熒光值，對胞內(nèi)丙二酰輔酶A 進行測量，見圖8（a）。 其中，CRISPRi/ddCpf1 系統(tǒng)由載體pBVSC 表達(dá)，丙二酰輔酶A 生物傳感器由載體pAJK-J233 表達(dá)。

表2 CRISPRi/ddCpf1 基因轉(zhuǎn)錄抑制系統(tǒng)的CRISPR array 序列Table 2 Sequences of CRISPR array in CRISPRi/ddCpf1 gene transcriptional inhibition system

如圖8（b）所示，相對于對照組（丙二酰輔酶A生物傳感器菌株，不加誘導(dǎo)劑），CRISPRi/ddCpf1 系統(tǒng)靶向adhE/fabF 基因時相對熒光值增加了46.2%， 靶向fabB/sucC 基因時相對熒光值增加了149.5%。 可見，CRISPRi/ddCpf1 多重靶向策略顯著促進了丙二酰輔酶A 的積累。

圖8 CRISPRi/ddCpf1 促進丙二酰輔酶A 的積累Fig. 8 CRISPRi/ddCpf1 promotes the accumulation of malonyl-CoA

3 結(jié) 語

丙二酰輔酶A 是重要的前體物質(zhì)，其合成被認(rèn)為是大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)次級代謝產(chǎn)物的潛在瓶頸。 研究表明，其常規(guī)基因敲除會影響細(xì)胞生長。 因此，利用CRISPR 干擾技術(shù)實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)， 從而促進丙二酰輔酶A 的積累。為了比較丙二酰輔酶A 的濃度，作者以J23119 啟動子為改造基礎(chǔ)，構(gòu)建了7 個不同的丙二酰輔酶A 生物傳感器，通過紅色熒光值的測定實現(xiàn)了丙二酰輔酶A 的快速、 可視化測量。然后，構(gòu)建了CRISPRi/ddCpf1 基因干擾系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了目的基因的基因沉默，并比較了不同ddCpf1突變體、 不同crRNA 靶向位置對基因沉默的影響。隨后， 嘗試融合Gp2 和ddCpf1 效應(yīng)蛋白對該CRISPRi/ddCpf1 系統(tǒng)進行優(yōu)化，但基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)效率沒有顯著提升。 最后，利用CRISPRi/ddCpf1 技術(shù)同時靶向兩個基因（adhE、fabF 和fabB、sucC） 進行CRISPR 干擾，顯著促進了丙二酰輔酶A 的積累，為其下游目的產(chǎn)物的高效合成提供了技術(shù)參考。 在后續(xù)研究中， 需要嘗試融合其他蛋白、 設(shè)計CRISPR array 進行多重基因抑制等，實現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)效率的控制。