基于Caco-2 細(xì)胞模型對(duì)DPP-IV抑制肽IPQVS 的活性評(píng)價(jià)研究

徐斐然， 徐寶才， 鞠興榮

（1. 合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院， 安徽合肥 230601；2. 合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥 230601；3. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

當(dāng)前，基于反應(yīng)底物甘氨酰-脯氨酰-對(duì)硝基苯（Gly-Pro-p-nitroanilide） 的體外酶促法測(cè)定IPQVS的活性存在不足與局限性。 其主要體現(xiàn)在腸道中的若干環(huán)境因素可能會(huì)限制寡肽對(duì)DPP-IV 的抑制活性，例如，小腸消化酶的水解作用會(huì)破壞寡肽的一級(jí)序列結(jié)構(gòu)，寡肽在小腸上皮細(xì)胞中的滲透率會(huì)影響DPP-IV 抑制反應(yīng)的進(jìn)行[1-2]，此外，大多體外實(shí)驗(yàn)使用的DPP-IV 源自豬胰腺， 與人類DPP-IV 存在少許差異。

文獻(xiàn)報(bào)道，分化的人類結(jié)腸癌細(xì)胞系（Caco-2細(xì)胞）中DPP-IV 的mRNA 表達(dá)水平較高，接近于正常人體小腸細(xì)胞的表達(dá)水平，重要的是該細(xì)胞系分化后還可以形成擁有緊密連接蛋白的致密單層與小腸細(xì)胞腸腔側(cè)刷狀緣絨毛結(jié)構(gòu)[3]。 此外，Caco-2細(xì)胞分化為極化的腸上皮細(xì)胞后可以表達(dá)與人腸上皮細(xì)胞相同的刷狀邊緣酶、肽酶、堿性磷酸酶和二糖酶等[4]。因此，Caco-2 細(xì)胞單層模型是一種成熟的包括抑制劑在內(nèi)的眾多口服藥物的篩選工具，通過它可以研究藥物的吸收率、降解和轉(zhuǎn)化[5-6]。 近年來，有大量關(guān)于活性寡肽的小腸吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究， 其中就包括利用Caco-2 細(xì)胞單層模型鑒定并研究雞蛋蛋白源DPP-IV 抑制肽IRDLLER、YAEERYP 和IRNVLQPS[7]；鳙魚蛋白源DPP-IV 抑制肽IADHFL[8]。

在先前研究中[9]，菜籽蛋白源IPQVS 被證實(shí)具有出色的DPP-IV 抑制活性 （IC50=（52.16±5.91）μmol/L）。 基于分化的Caco-2 細(xì)胞模型對(duì)IPQVS 的DPP-IV 抑制活性進(jìn)行測(cè)定， 闡明其在模擬小腸上皮細(xì)胞中的吸收與降解機(jī)制，使用分子對(duì)接方法揭示小腸吸收、腸肽酶降解作用對(duì)IPQVS 活性的影響及規(guī)律。 這項(xiàng)研究的創(chuàng)新之處在于使用了體外Caco-2 細(xì)胞單層模型，該模型不僅更準(zhǔn)確地測(cè)定了IPQVS 的活性，還提供了其在小腸中吸收、降解的相關(guān)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鈉、鹽酸、Tris-HCl：中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)公司產(chǎn)品；人體結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2 細(xì)胞株：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（含體積分?jǐn)?shù)0.25%的EDTA）、DMEM 1x（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）高糖（4.5 g/L D-葡萄糖）培養(yǎng)基：美國(guó)Gibco 公司產(chǎn)品；重組人類DPP-IV（EC 3.4.14.5）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、TRIzol試劑、Diprotin A （Ile-Pro-Ile， 純度≥95%）： 美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品；三氟乙酸（TFA）、乙腈、甲醇均為色譜級(jí)：德國(guó)Merck 公司產(chǎn)品；無RNA 酶水：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；FMOC 固相合成的IPQVS 及其降解產(chǎn)物PQVS、QVS、VS： 合肥國(guó)肽生物有限公司產(chǎn)品；DPP-IV GloTM 測(cè)定試劑盒、siRNA （DPP-IV）、Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑、普通細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管（50、15、2 mL）：美國(guó)Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；12 孔Transwell?培養(yǎng)板（聚酯膜，孔徑0.4 μm，膜面積1.12 cm2）、25 cm2密封蓋細(xì)胞培養(yǎng)皿、0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜：美國(guó)康寧公司產(chǎn)品。

Beckman Coulter J6 冷凍離心機(jī)：貝克曼庫(kù)爾特有限公司產(chǎn)品；SX-500 快速自動(dòng)高壓滅菌鍋：日本Tomy Digital Biology 公司產(chǎn)品；FE20K 精密pH 計(jì)：梅特勒儀器公司產(chǎn)品；SpectraMax M2e 多功能酶標(biāo)儀： 美國(guó)Molecular Devices 公司產(chǎn)品；7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀： 美國(guó)AB SCIEX 公司產(chǎn)品；Class II Type B2 生物安全柜、3701 型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱：美國(guó)Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)UVP imagaing 公司產(chǎn)品；LSM700 激光共聚焦顯微鏡：德國(guó)Zeiss 公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Caco-2 細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn) 將Caco-2 細(xì)胞以5×104個(gè)/cm2的密度接種在Transwell?細(xì)胞培養(yǎng)平板的插入物（上室，AP 側(cè)，即基底內(nèi)側(cè)）上，在12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的上下室的每個(gè)孔中加入0.5 mL DMEM， 每隔1 d 更換細(xì)胞培養(yǎng)基。 培養(yǎng)21 d 后，Caco-2 細(xì)胞完全分化為致密單層結(jié)構(gòu)。在進(jìn)行跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)測(cè)定之前，通過用Millicell ERS-2 測(cè)量跨上皮電阻（TEER）來評(píng)估Transwell?上室中細(xì)胞單層的完整性與致密性。 跨膜電阻值TEER 高于400 Ω 的Caco-2 細(xì)胞單層可以被用于模擬小腸上皮細(xì)胞吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。 丟棄完全分化的細(xì)胞單層中的培養(yǎng)基，使用PBS 洗滌細(xì)胞單層兩次。 隨后，將0.5 mL 含IPQVS 或其降解產(chǎn)物的HBSS 溶液（最終濃度為5 mmol/L）添加到AP 側(cè)，并將1.5 mL 不含測(cè)試樣品的HBSS 溶液添加到BL 側(cè) （基底外側(cè)）。Caco-2 細(xì)胞單層模擬小腸上皮細(xì)胞吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行120 min，在90 min 時(shí)從Caco-2 細(xì)胞單層的AP 側(cè)回收培養(yǎng)液， 在120 min 時(shí)從Caco-2 細(xì)胞單層的BL 側(cè)回收培養(yǎng)液，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）分析。 為了確定IPQVS 及其降解產(chǎn)物經(jīng)Caco-2 細(xì)胞吸收的機(jī)制， 在Caco-2 細(xì)胞單層中添加了降低細(xì)胞間緊密連接的松弛素D（0.5 μg/mL）、轉(zhuǎn)胞吞抑制劑渥曼青霉素 （500 nmol/L） 和肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（PepT1）競(jìng)爭(zhēng)抑制劑Gly-Pro（10 mmol/L）。以上試劑與Caco-2 細(xì)胞單層培養(yǎng)1 h 后， 在AP 側(cè)添加5 mmol/L IPQVS 或其降解產(chǎn)物。 Papp 計(jì)算公式如下：

式中：Papp 為表觀滲透系數(shù)，cm/s；Cd0是Transwell?小室AP 側(cè)的初始肽濃度，mmol/L；MR是Transwell?小室BL 側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)后寡肽的濃度，mmol/L；t 是時(shí)間，s；A 是Transwell?小室AP 側(cè)細(xì)胞單層的表面積，cm2。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與毒性實(shí)驗(yàn)復(fù)蘇一瓶Caco-2 細(xì)胞（2.0 mL），將其置于型號(hào)為T75 的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為含有FBS（體積分?jǐn)?shù)10%）、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）的DMEM，每2 d 更換一次培養(yǎng)液。 將Caco-2 細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2及37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底面積的80%～90%，使用胰蛋白酶（含體積分?jǐn)?shù)0.25%的EDTA） 以1∶2 或1∶3 的分流比對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，每次傳代的密度限定為1×105個(gè)/cm2。 使用的Caco-2細(xì)胞均在第10 至25 代。 通過MTT 比色分析法[10]對(duì)Caco-2 細(xì)胞相對(duì)活力進(jìn)行了測(cè)定。 將Caco-2 細(xì)胞以每孔5×104個(gè)的密度接種在96 孔板中，并在體積分?jǐn)?shù)5%的CO2及37 ℃環(huán)境中孵育。 培養(yǎng)21 d 后，移出培養(yǎng)基， 分別用200 μL 含有不同濃度（0.5、2.0、5.0 mmol/L） 的IPQVS 及其降解產(chǎn)物， 以及Diprotin A 培養(yǎng)基替換，進(jìn)一步孵育2 h 或24 h。 僅加入DMEM 的孔作為對(duì)照組。 再將200 μL MTT（5.0 mg/mL） 加入每個(gè)孔，Caco-2 細(xì)胞在37 ℃下繼續(xù)孵育4 h。 接著除去含有MTT 的培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔中加入150 μL 的DMSO 溶液。 將96 孔板放置在臺(tái)式振蕩器上振蕩0.5 h。 最后，在酶標(biāo)儀中于570 nm處測(cè)量96 孔板吸光度。 與對(duì)照相比，細(xì)胞相對(duì)活力降低超過10%的肽樣品濃度被認(rèn)為具有細(xì)胞毒性。

1.2.3 DPP-IV 抑制活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行DPP-IV 抑制率的測(cè)定。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在37 °C 恒溫條件下進(jìn)行，使用Diprotin A 作為陽性對(duì)照物。實(shí)驗(yàn)組為50 μL 含有反應(yīng)底物Gly-Pro-p-nitroanilide 的測(cè)試樣品，底物最終濃度0.2 mmol/L。陰性對(duì)照包含100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0，50 μL）和反應(yīng)底物。 通過添加DPP-IV（質(zhì)量濃度0.002 5 mg/mL）來引發(fā)反應(yīng)，反應(yīng)1 h 后立即加入1 mol/L 的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.0）中止反應(yīng)。 所有試劑和樣品均在100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）中稀釋。 使用酶標(biāo)儀在405 nm 下讀取96 孔板的吸光度。 不同樣品中DPP-IV 的IC50通過測(cè)試樣品濃度對(duì)數(shù)值-相對(duì)活性的函數(shù)作圖， 計(jì)算50%DPP-IV 被抑制所需的測(cè)試樣品濃度。 參考已有的對(duì)體外DPP-IV 活性的研究[9]，使用DPP-IV GloTM 測(cè)定試劑盒評(píng)估IPQVS 的抑制活性。 將Caco-2 細(xì)胞以5×104個(gè)/cm2的密度接種到12 孔Transwell?板中，用25～250μmol/L IPQVS 或其降解產(chǎn)物處理Caco-2 細(xì)胞24 h。 然后使用BCA 蛋白質(zhì)分析試劑盒評(píng)估每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，使用Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）調(diào)節(jié)最終體積， 將Caco-2 細(xì)胞提取物和上清液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度歸一化。 使用上層培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液的混合物測(cè)量DPP-IV 的含量。 使用酶標(biāo)儀在10 min內(nèi)測(cè)量吸光度，該吸光度與DPP-IV 活性成正比。將處理樣品與對(duì)照樣品進(jìn)行比較，對(duì)照組樣品中僅含有加入DMEM 的細(xì)胞裂解物和細(xì)胞上清液。

1.2.4 DPP-IV 基因表達(dá)分析使用Lipofectamine 2000 和不含血清的優(yōu)化DMEM 培養(yǎng)基配置得到混合物（siRNA（DPP-IV）濃度為40 pmol/L）。取出接種了Caco-2 細(xì)胞的6 孔板，用PBS 清洗兩次，再用不含血清的優(yōu)化DMEM 培養(yǎng)基清洗一次。 吸棄清洗液，每孔加入不含血清的優(yōu)化DMEM 培養(yǎng)基，再加0.5 mL 含siRNA（DPP-IV）的混合液。 輕輕搖勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育6 h （體積分?jǐn)?shù)5% CO2，37 ℃）。6 h 后吸棄孔板中液體， 換入正常的含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h，再用不同濃度的IPQVS 處理Caco-2細(xì)胞24 h，隨后Caco-2 細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 通過蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果可以表征siRNA 對(duì)DPP-IV 基因的沉默效率[12]。

1.2.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)用250 μmol/L IPQVS 和50 μmol/L Diprotin A 處理Caco-2 細(xì)胞單層， 再用DPBS 洗滌3 次， 用體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛水溶液固定10 min， 用體積分?jǐn)?shù)0.5%Triton X-100 在25℃下放置5 min。 在25 ℃下用體積分?jǐn)?shù)5%的牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h 后，將Caco-2 細(xì)胞單層與一抗（濃度比1∶50，在體積分?jǐn)?shù)5%BSA 中稀釋）在4℃下孵育過夜。 接下來，將一抗吸棄，用PBST 溶液洗滌Caco-2 細(xì)胞3 次，將山羊抗鼠FITC 二抗的稀釋液加入，25 ℃下避光孵育2 h。 二抗孵育完畢以后，以PBST 洗滌Caco-2 細(xì)胞3 次，將DAPI 染色液加入，25 ℃下避光孵育10 min。 最后用PBST 洗滌Caco-2 細(xì)胞3 次， 使用激光共聚焦顯微鏡獲取Caco-2 細(xì)胞單層圖像。

1.2.6 模擬分子對(duì)接使用分子對(duì)接軟件（MOE）對(duì)IPQVS 及其代謝物進(jìn)行分子對(duì)接并優(yōu)化到DPPIV（PDB ID：1X70）的結(jié)合位點(diǎn)。 對(duì)接口袋與已發(fā)表的文章一致[13-15]。 DPP-IV 的3D 結(jié)構(gòu)可從RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) （www.rcsb.org） 下載。 使用Accelrys Discovery Studio 1.1.2 版軟件來去除水分子并優(yōu)化肽的空間結(jié)構(gòu)。 選擇產(chǎn)生的具有最小結(jié)合能的構(gòu)象進(jìn)行分析，并使用PyMOL 軟件生成分子結(jié)構(gòu)。 根據(jù)一級(jí)配體的位置， 確定DPP-IV 活性位點(diǎn)的坐標(biāo)為center_x =-10.733，center_y =12.416 和 center_z =68.829，其中size_x=20，size_y=20，size_z=20。使用活性位點(diǎn)和底物之間的總相互作用能評(píng)估最終穩(wěn)定肽-底物復(fù)合物的分?jǐn)?shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次， 采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較應(yīng)用t 檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析。

表格中結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示，圖中數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。 以P<0.05 作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 IPQVS 及其降解產(chǎn)物在Caco-2 細(xì)胞模型中的吸收

IPQVS 在Caco-2 細(xì)胞單層（經(jīng)過21 d 培養(yǎng)）上孵育90 min 后，52%的IPQVS 在Transwell?的上室AP 側(cè)保持結(jié)構(gòu)完整，然而轉(zhuǎn)運(yùn)至下室BL 側(cè)并保留其原始結(jié)構(gòu)的只占初始量的2.7%， 見圖1 （a）～（c）。 Transwell?小室的AP 側(cè)和BL 側(cè)發(fā)現(xiàn)了IPQVS 的3 個(gè)主要降解片段， 經(jīng)HPLC-MS 鑒定IPQVS（保留時(shí)間為12.90 min）降解的3 個(gè)肽片段分別是PQVS（保留時(shí)間為11.07 min）、QVS（保留時(shí)間為13.99 min）和VS（保留時(shí)間為17.10 min）。表1為IPQVS 及其降解產(chǎn)物跨小腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)數(shù)據(jù)，IPQVS 的Papp 為（1.35±0.09）×10-6cm/s，降解肽PQVS、QVS、VS 的Papp 分別為（1.46±0.18）×10-6、（0.95±0.08）×10-6、（3.01±0.15）×10-6cm/s。 不難發(fā)現(xiàn)，氨基酸殘基數(shù)越少的寡肽在小腸吸收上更具優(yōu)勢(shì)。如圖1（d）所示，細(xì)胞松弛素D 顯著增加了IPQVS及其降解產(chǎn)物的吸收量（P<0.05），表明細(xì)胞旁路均是4 條肽的吸收方式。其中疏水性最強(qiáng)的IPQVS 與二肽VS 的吸收量在渥曼青霉素預(yù)處理的情況下被顯著抑制，表明轉(zhuǎn)胞吞作用可能也是它們的吸收方式。值得注意的是，VS 存在3 種可能的吸收途徑（細(xì)胞旁路、胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)和PepT1 轉(zhuǎn)運(yùn)），這主要因?yàn)槠浒被釟埢鶖?shù)小于3，且為疏水性氨基酸。

圖1 IPQVS 跨Caco-2 細(xì)胞單層膜吸收作用的分析Fig. 1 Analysis of the transepithelial transport of IPQVS across Caco-2 cell monolayer

2.2 IPQVS 及其降解產(chǎn)物對(duì)Caco-2 單層細(xì)胞的毒性

用不同濃度（0.5、2.0、5.0 mmol/L）的IPQVS 處理單層Caco-2 細(xì)胞后， 使用MTT 法確定單層Caco-2 細(xì)胞相對(duì)活力。 如圖2（a）所示，濃度為5.0 mmol/L 的PQVS、QVS、VS 持續(xù)作用24 h 會(huì)顯著降低Caco-2 細(xì)胞的相對(duì)活力 （P<0.05）； 濃度為2.0 mmol/L 及以上的Diprotin A 作用24 h 對(duì)單層Caco-2 細(xì)胞有毒性，細(xì)胞相對(duì)活力均低于90%。 但是， 同樣濃度的上述寡肽作用于Caco-2 細(xì)胞2 h，細(xì)胞相對(duì)活力沒有顯著降低（見圖2（b），P>0.05）。因此，使用濃度為5.0 mmol/L 的寡肽IPQVS 及其降解產(chǎn)物進(jìn)行2 h 的模擬小腸上皮細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)是安全且無生物毒性的。 雞蛋蛋白源降血壓肽LKP 和IQW 模擬小腸上皮細(xì)胞吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與上述相似，Caco-2 細(xì)胞與目標(biāo)肽 （濃度為2.0、5.0 mmol/L）的短時(shí)間共同孵育（2h）不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性[16]。

圖2 MTT 法檢測(cè)IPQVS 及其降解產(chǎn)物在Caco-2 細(xì)胞中的細(xì)胞毒性Fig. 2 Cytotoxicity of IPQVS and its degradation products in Caco-2 cells by MTT assay

2.3 基于Caco-2 細(xì)胞單層對(duì)IPQVS 的DPP-IV抑制活性

如圖3（a）及表1 所示，IPQVS 以劑量依賴型方式抑制Caco-2 細(xì)胞單層中的DPP-IV 活性，IC50為（101.66±6.02） μmol/L，數(shù)值高于體外化學(xué)底物法測(cè)量值。 Diprotin A 的IC50也從（3.62±0.37） μmol/L 增加至 （12.18±0.36） μmol/L。 當(dāng)IPQVS 的濃度超過250 μmol/L 時(shí)，抑制率曲線趨于平緩。 圖3（d）表明濃度為250 μmol/L 的IPQVS 在Caco-2 細(xì)胞單層中孵育60、90、180、360 min 后， 細(xì)胞內(nèi)DPP-IV 的相對(duì)活性分別降低了36.49%、42.37%、62.71%和64.70%。 IPQVS 調(diào)節(jié)DPP-IV 基因表達(dá)的能力亦在Caco-2 細(xì)胞單層上進(jìn)行了測(cè)試。 如圖3（b）所示，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明siRNA（DPP-IV）顯著降低了Caco-2 細(xì)胞中DPP-IV 的表達(dá)。 與對(duì)照組相比，siRNA（DPP-IV）組DPP-IV 的mRNA 表達(dá)水平下降了50%以上，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 不難發(fā)現(xiàn)，IPQVS 不會(huì)影響Caco-2 細(xì)胞單層中DPP-IV的mRNA 表達(dá)。

圖3 IPQVS 對(duì)體外Caco-2 細(xì)胞中DPP-IV 活性的影響Fig. 3 Effects of IPQVS on DPP-IV activity in vitro in Caco-2 cell

IPQVS 及其降解產(chǎn)物在體外對(duì)DPP-IV 的IC50如表1 所示， 其中PQVS 和VS 的IC50分別為（120.74±8.60） μmol/L 和 （68.59±4.28） μmol/L，均高于IPQVS，QVS 的體外IC50甚至超過了500 μmol/L。Caco-2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，PQVS （IC50=（195.69±6.37）μmol/L）和QVS（IC50＞500 μmol/L）對(duì)DPP-IV 的抑制活性顯著低于IPQVS。 VS 在Caco-2 細(xì)胞單層模型測(cè)定中的IC50小于IPQVS， 但由于VS 含量是IPQVS 降解產(chǎn)物中最低的，所以并不能改變IPQVS在Caco-2 細(xì)胞單層模型中DPP-IV 抑制率降低的結(jié)果。 免疫熒光是研究細(xì)胞內(nèi)源蛋白酶表達(dá)的一種有效方法[17]。 如圖4 所示，與對(duì)照組相比，濃度為250 μmol/L 的IPQVS 和50 μmol/L Diprotin A 能夠使Caco-2 細(xì)胞單層的DPP-IV 對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度下降60%以上（P<0.01）。 此外，兩者處理后的Caco-2細(xì)胞邊緣和培養(yǎng)空隙中的綠色熒光亮度大幅降低（見圖4（a））。

圖4 激光共聚焦掃描顯微鏡的二維熒光檢測(cè)與定量分析Fig. 4 Confocal laser scanning microscopy depicting two-dimensional fluorescence detection and quantification

結(jié)合表1 中IPQVS 及其降解產(chǎn)物對(duì)DPP-IV的IC50，推測(cè)IPQVS 在Caco-2 細(xì)胞模型中對(duì)DPPIV 抑制活性降低的原因是在小腸吸收過程中發(fā)生了降解作用， 新產(chǎn)生的肽段碎片PQVS 和QVS 的DPP-IV 抑制活性較IPQVS 發(fā)生了不同程度的降低。 同樣， 有研究者發(fā)現(xiàn)乳源DPP-IV 抑制肽LPYPY 在Caco-2 細(xì)胞單層模型中的降解產(chǎn)物YPY、LP、YP 的抑制活性均不如IPQVS，其中抑制活性最強(qiáng)的二肽YP 的酶抑制率相較于IPQVS 也下降了63%[18]。 當(dāng)然，也有特殊的肽被發(fā)現(xiàn)，來自鳙魚蛋白的DPP-IV 抑制肽IADHFL 產(chǎn)生了相反的現(xiàn)象，其片段IADHF 不僅具有更好的DPP-IV 抑制活性，而且還具有減弱DPP-IV 基因表達(dá)的能力[8]。

表1 IPQVS 及其降解產(chǎn)物的鑒定、抑制活性及PappTable 1 Amino acid reside sequence, IPQVS activity, and Papp value of IPQVS and its degradation products

2.4 IPQVS 及其降解產(chǎn)物與DPP-IV 的分子對(duì)接

分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了IPQVS 及其降解產(chǎn)物與DPP-IV 之間的相互作用和關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)信息。 表2 中詳細(xì)列出了4 條寡肽（IPQVS、PQVS、QVS 和VS）的分子建模參數(shù)與對(duì)接信息。 IPQVS 和DPP-IV 相互作用并形成的復(fù)合物具有最高的親和力絕對(duì)值。 4 條肽的結(jié)合能分別為-8.95、-7.99、-6.87、-8.24 kJ/mol。Pymol 3D 圖上標(biāo)記了分子間能量低于-2.0 kJ/mol 的結(jié)合位點(diǎn)（見圖5）。 IQPVS 與DPP-IV 的氨基酸殘基位點(diǎn)Arg125、Tyr631、His740、Glu205 和Glu206 形成了5 個(gè)氫鍵；此外，IPQVS 的N 端與Glu205 形成了離子鍵。IPQVS 的3 種降解產(chǎn)物和DPP-IV 之間的氨基酸殘基相互作用位點(diǎn)的數(shù)量相對(duì)于IPQVS 發(fā)生了減少， 特別是對(duì)于QVS，其氨基酸作用位點(diǎn)的數(shù)量最少（僅Glu205 和Glu206），見圖5（c）。IPQVS 活性在小腸細(xì)胞中衰減的現(xiàn)象與先前報(bào)道的DPP-IV 抑制肽ELHQEEPL 一致[19]。

圖5 分子對(duì)接結(jié)果的Pymol 3D 圖Fig. 5 Pymol 3D graphs for the information of molecular docking

表2 計(jì)算模型對(duì)接能量得分和相互作用結(jié)果Table 2 Computational-modeling energy scores and interaction results

IPQVS 的降解產(chǎn)物PQVS、QVS 與DPP-IV 相互作用中的氫鍵、π-Cation（陽離子和芳香性體系之間的相互作用）數(shù)量減少，進(jìn)而導(dǎo)致它們與DPP-IV之間結(jié)合能的絕對(duì)值降低。說明IPQVS 在腸道吸收過程中無法維持其體外原有的DPP-IV 抑制活性，原因可能是Caco-2 細(xì)胞中包括二肽基肽酶在內(nèi)的氨基肽酶、內(nèi)肽酶等腸肽酶會(huì)破壞其原有結(jié)構(gòu)[20-21]。

另外， 前文涉及的Caco-2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法對(duì)DPP-IV 的篩選與鑒定具有快速、簡(jiǎn)便且精準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì)[15]。盡管模擬分子對(duì)接技術(shù)已作為標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算工具廣泛應(yīng)用于DPP-IV 抑制肽的篩選與研究中，但仍需通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)[22]。

3 結(jié) 語

基于Caco-2 細(xì)胞研究了DPP-IV 抑制肽IPQVS 的活性與小腸吸收機(jī)制， 主要從IPQVS 在Caco-2 細(xì)胞單層中的DPP-IV 抑制活性較體外化學(xué)底物法的測(cè)定結(jié)果顯著降低這一現(xiàn)象入手，揭示了其小腸吸收途徑、表觀滲透系數(shù)，評(píng)價(jià)了其降解肽片段對(duì)DPP-IV 抑制活性的影響。 總體來說，Caco-2 細(xì)胞模型可被作為一種全面評(píng)價(jià)IPQVS 活性的有效生物技術(shù)與工具。