黑曲霉β-葡聚糖酶基因eglA6 在乳酸克魯維酵母中的表達及重組酶性質(zhì)

王施嵐， 徐楚涵， 姚 雁， 楊夢蓮， 德青美朵，沈 微*，3， 楊海泉， 夏媛媛， 陳獻忠，3

（1. 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室， 江蘇無錫 214122；2. 無錫先秦生物科技有限公司， 江蘇無錫 214073；3. 江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)平臺，江蘇無錫 214122）

內(nèi)切型β-葡聚糖酶是纖維素酶類的重要成分之一， 主要降解纖維素長鏈分子中的β-1，4-糖苷鍵[1-2]。 除了降解纖維素，目前內(nèi)切β-葡聚糖酶最重要的商業(yè)化用途是在啤酒生產(chǎn)和飼料工業(yè)中降解β-1，3-1，4-葡聚糖，以達到降低底物黏度并最終實現(xiàn)改善工藝條件、防止啤酒低溫渾濁以及提高動物對飼料吸收率的目標(biāo)[1-2]。 在啤酒和飼料工業(yè)中使用的葡聚糖酶都需要經(jīng)受高溫、酸性條件，因此在上述條件下保持穩(wěn)定性和高活性的β-葡聚糖酶受到研究者的重視。 黑曲霉是工業(yè)應(yīng)用最廣泛的絲狀真菌之一，也是工業(yè)用葡聚糖酶的生產(chǎn)菌種之一。 人們從黑曲霉中克隆了多條葡聚糖酶編碼基因并實現(xiàn)了異源表達，這些基因的表達產(chǎn)物大多具有較高的耐酸性和一定的耐熱性[2-7]。 作者所在課題組在前期工作中，以黑曲霉全基因組序列信息[8]為依據(jù)，從黑曲霉中篩選到一條cDNA 基因eglA6， 這條基因在巴斯德畢赤酵母中的表達產(chǎn)物AnEglA6 反應(yīng)最適溫度可達75 ℃，在75 ℃下酶活半衰期達到1.9 h，能短時耐受80 ℃高溫[9]。 AnEglA6 的耐熱性明顯高于已見報道的黑曲霉來源的其他葡聚糖酶或其異源表達產(chǎn)物，在飼料加工中具有較好應(yīng)用潛力[9]。 而現(xiàn)代飼料生產(chǎn)一般都有一個高溫制粒過程，這個過程中高溫有利于飼料中淀粉的糊化，提高顆粒飼料穩(wěn)定度（PDI）[10]。 因此，高溫條件下的穩(wěn)定性是影響飼料用酶應(yīng)用前景的關(guān)鍵指標(biāo)之一。

乳酸克魯維酵母具有較強的蛋白質(zhì)分泌能力，是除巴斯德畢赤酵母外應(yīng)用最廣泛的外源蛋白質(zhì)分泌型表達宿主之一，已實現(xiàn)了多種外源蛋白質(zhì)的高效表達[11-13]。 可能由于翻譯后修飾過程的差異，乳酸克魯維酵母表達的外源蛋白質(zhì)與同一基因在巴斯德畢赤酵母中的表達產(chǎn)物常常表現(xiàn)出一定的差異[12-15]，因此有可能提供具有不同性質(zhì)的重組酶。 作者所在課題組嘗試以乳酸克魯維酵母為宿主表達eglA6 基因，結(jié)果顯示重組酶在相對分子質(zhì)量、耐熱性等方面與該基因在巴斯德畢赤酵母中的表達產(chǎn)物均有明顯不同。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒大腸桿菌JM109/pPIC9KeglA6（基因克隆的出發(fā)菌）為作者所在課題組前期構(gòu)建[9]；表達載體pKLAC1 和宿主菌乳酸克魯維酵母GG799：紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品；大腸桿菌JM109 為作者所在實驗室保藏；表達重組酶AnEglA6 的菌株P(guān)ichiapastoris GS115/pPIC9KeglA6 XQ12 為課題組前期構(gòu)建[9]；AnEglA6 按照文獻[9]中方法制備。

1.1.2 工具酶及主要試劑質(zhì)粒提取、PCR 產(chǎn)物純化以及膠回收試劑盒：康寧生物（吳江）有限公司產(chǎn)品； 限制性核酸內(nèi)切酶、T4 連接酶、DL15000 DNA marker 等：大連寶生物工程公司產(chǎn)品；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、大麥葡聚糖、凝結(jié)多糖、昆布多糖等：Megazyme 公司產(chǎn)品； 引物合成、DNA 序列分析以及蛋白質(zhì)羧基端測序均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；YNB 培養(yǎng)基：BD Difco 公司產(chǎn)品，產(chǎn)品貨號BD Difco 291920，該產(chǎn)品由維生素和無機鹽組成， 不含碳源及氮源；SDS-PAGE 電泳預(yù)制膠：上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；微晶纖維素：國藥集團（上海）化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 引物合成及測序根據(jù)eglA6 的核苷酸序列（NCBI 登錄號：MG913988）設(shè)計PCR 擴增的引物：Psl01：5′-AATCAGATCTAGTCCGAGGGCTAAGC-3′Psl02：5′-AATAGTCGACCTACAAACACTGCGAATAC-3′

引物中帶下劃線部分分別為核酸內(nèi)切酶Bgl II和Sal I 的識別位點。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.1.4 培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)采用LB 培養(yǎng)基，酵母培養(yǎng)一般采用YPD 培養(yǎng)基， 均按常規(guī)方法配制[12]。 YCB 培養(yǎng)基（g/L）：YNB 2.0、葡萄糖3.0、乙酰胺0.6， 用于重組乳酸克魯維酵母轉(zhuǎn)化子的篩選。YPG 培養(yǎng)基（g/L）：乳糖20.0、酵母提取物10.0、蛋白胨20.0，用于乳酸克魯維酵母搖瓶發(fā)酵。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pKLAC1-eglA6的構(gòu)建以重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6 為模板，以Psl01、Psl02 為引物進行PCR 擴增。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并回收1.2 kb的目標(biāo)片段，用Bgl II 和Sal I 酶切并與經(jīng)同樣酶切的表達載體pKLAC1 連接， 連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞， 在含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 平板上篩選轉(zhuǎn)化子，任取4 個轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后酶切驗證并進一步測序鑒定。 驗證正確的轉(zhuǎn)化子命名為JM109/pKLAC1-eglA6。

1.2.2 乳酸克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備接種宿主菌乳酸克魯維酵母GG799 單菌落于10 mL 液體YPD 培養(yǎng)基中，200 r/min 條件下32 ℃培養(yǎng)24 h。 按2%的體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接到新的裝有50 mL YPD 培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，32 ℃條件下250 r/min 劇烈振蕩培養(yǎng)6 h，菌液在冰水浴中迅速降溫并維持30 min。 菌液轉(zhuǎn)入預(yù)冷的50 mL 離心管，4 ℃下4 000 r/min 離心3 min 收集菌體，用預(yù)冷的無菌水懸浮菌體，離心收集菌體后用預(yù)冷的1 mol/L 山梨醇溶液懸浮菌體，離心后再次用山梨醇溶液懸浮菌體， 再次離心后棄盡上清液， 用大約0.5～1.0 mL 山梨醇溶液懸浮菌體， 盡量縮小體積保持較高的細(xì)胞濃度。 以上操作均要保持菌體處于低溫狀態(tài)。

1.2.3 重組乳酸克魯維酵母的轉(zhuǎn)化含重組質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pKLAC1-eglA6 經(jīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，大量提取質(zhì)粒。 重組質(zhì)粒用內(nèi)切酶BstX I 酶切，進一步用DNA 片段純化試劑盒純化，操作步驟與試劑盒說明書一致，唯一的改變是最后一步從硅膠柱將DNA 片段洗脫時用純水替代試劑盒提供的專用洗脫液。由此獲得線性化的重組質(zhì)粒。取90 μL乳酸克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞菌，加入10 μL 線性化后的重組質(zhì)粒，混勻后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，在碎冰中冷卻10 min。 1 500 V 條件下5 ms 電擊兩次，迅速加入900 μL 預(yù)冷的山梨醇溶液懸浮菌體，將經(jīng)山梨醇溶液重懸后的菌體涂布到以乙酰胺為唯一氮源的YCB 固體培養(yǎng)基，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d獲得轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 重組葡聚糖酶的誘導(dǎo)表達與重組菌篩選取乳酸克魯維酵母轉(zhuǎn)化子單菌落，在新的YCB 平板上劃線分離， 再取單菌落接種到裝有5 mL YPD 液體培養(yǎng)基的25 mL 三角瓶中振蕩培養(yǎng)過夜。 取500 μL 菌液接種于裝有80 mL YPG 發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶，220 r/min 振蕩培養(yǎng)，間隔12 h 取樣檢測上清液葡聚糖酶酶活，最高酶活一般在誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h 時出現(xiàn)。 篩選酶活較高的轉(zhuǎn)化子用于后續(xù)工作。

1.2.5 重組葡聚糖酶的純化及酶活測定葡聚糖酶發(fā)酵液用0.22 μm 微孔濾膜過濾除去雜質(zhì)。 用超濾離心柱濃縮至酶活200.0 U/mL 左右。 再用5 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 5.5）平衡后上樣于1 mL QHP 陰離子交換柱，用含1 mol/L NaCl 的5 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 5.5）線性洗脫，進行離子交換層析， 收集活性峰，SDS-PAGE 電泳驗證純化效果，Bradfoard 法測定蛋白質(zhì)含量。

采用DNS 法測定葡聚糖酶的活力。取50 μL 適當(dāng)稀釋的酶液， 加入450 μL 質(zhì)量濃度為10 g/L 的大麥葡聚糖 （由0.05 mol/L 檸檬酸與0.1 mol/L Na2HPO4構(gòu)成的緩沖液配置，pH 5.0），70 ℃下反應(yīng)20 min，加入750 μL DNS 試劑，沸水浴煮15 min，在540 nm 波長下測定吸光度。

酶活單位定義：在相應(yīng)條件下，每分鐘分解底物產(chǎn)生的還原糖， 其還原力相當(dāng)于1 μmol 葡萄糖所需的酶量，用1 U 表示。 如無特別說明，酶活檢測一般是在最適條件下進行， 反應(yīng)液不添加金屬離子，底物為大麥葡聚糖。 底物特異性檢測時，將底物改為同質(zhì)量的相應(yīng)底物，其他步驟不變。

考馬斯亮藍法測定純酶的蛋白質(zhì)含量，用于計算酶的比活力。

1.2.6 重組葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的分析

1） 重組酶在不同條件下的酶活測定 在60～80 ℃內(nèi)，溫度梯度間隔為5 ℃。 對于pH 3.0～7.0 的緩沖液（由0.05 mol/L 檸檬酸與0.1 mol/L Na2HPO4構(gòu)成），pH 梯度間隔為0.5， 測定不同溫度和pH 下重組酶活力，以最高酶活為100%，計算各不同溫度及pH 條件下的相對酶活， 初步確定重組酶最適反應(yīng)條件。

2） 最適pH 的測定 分別配置pH 3.0～7.0 的緩沖液（由0.05 mol/L 檸檬酸與0.1 mol/L NaH2PO4構(gòu)成），測定酶在不同pH 緩沖液中酶活力，以最高酶活性為100%，計算不同pH 條件下酶相對活性。

3） 金屬離子對酶活的影響 在pH 5.0 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中分別添加金屬離子 （均為氯化物）， 使金屬離子的最終濃度為1 mmol/L 和5 mmol/L，檢測酶活。 以原酶液活力為100%，分析不同金屬離子對酶活力的影響。

4） 重組酶對不同底物特異性研究 分別以大麥葡聚糖、凝結(jié)多糖、CMC-Na、微晶纖維素等為底物，在最適條件下測定重組酶的活力，分析重組酶對不同底物的水解能力。

酶學(xué)性質(zhì)分析均做3 個平行樣。

1.2.7 重組葡聚糖酶對底物的降解配制葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖混合標(biāo)準(zhǔn)樣，每種糖為5 g/L。 為更清晰地顯示麥芽三糖和五糖的位置，配制混合標(biāo)樣時沒有加入麥芽四糖。 取5 g/L 的大麥葡聚糖溶液與過量葡聚糖酶反應(yīng)。 用“海洋”牌硅膠板，體積比7∶11∶2 的乙酸乙酯、冰乙酸和水的混合液作展開劑，2 g 二苯胺、2 mL苯胺、10 mL 體積分?jǐn)?shù)85%的磷酸和100 mL 丙酮溶解后混勻作為顯色劑，對大麥葡聚糖水解產(chǎn)物進行薄層層析定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉葡聚糖酶基因eglA6 的克隆與表達載體的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6 為模板， 經(jīng)PCR 擴增獲得一個1.2 kb 的目標(biāo)片段，從電泳凝膠中分離該片段，與表達載體pKLAC1 連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞， 任取4 個轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后酶切鑒定，圖1 為其中1 號轉(zhuǎn)化子的酶切圖譜。 該轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒用Bgl II 和Sal I 酶切后獲得約9.0 kb 和1.2 kb 的兩個條帶， 分別與pKLAC1 空載體和基因eglA6 大小一致，符合重組質(zhì)粒應(yīng)有特征。 進一步將該質(zhì)粒送至上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司測序，結(jié)果顯示，質(zhì)粒中插入片段序列與MG913988 序列中成熟肽編碼區(qū)序列完全一致。 為便于敘述，將上述重組質(zhì)粒命名為pKLAC1-eglA6，用于后續(xù)實驗。

圖1 重組載體pKLAC1-eglA6 的酶切鑒定Fig. 1 Indentification of pKLAC1-eglA6 by restriction analysis

2.2 eglA6 基因的表達與高產(chǎn)菌的篩選

將質(zhì)粒PKLAC1-eglA6 線性化后， 電轉(zhuǎn)化進乳酸克魯維酵母G799 感受態(tài)細(xì)胞， 轉(zhuǎn)化后涂布到以乙酰胺為唯一氮源的YCB 平板。由于pKLAC1 質(zhì)粒上帶有乙酰胺酶基因，因此只有轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子才能分解乙酰胺獲得氮源并長成菌落，但實際操作上在YCB 平板上一般會有大量假陽性轉(zhuǎn)化子，GG799 轉(zhuǎn)化后需要進行大量篩選才能獲得真正表達目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子。 因此一次任選50 個轉(zhuǎn)化子，劃線分離后進行搖瓶發(fā)酵。 結(jié)果顯示，其中僅2個轉(zhuǎn)化子發(fā)酵后表現(xiàn)出明顯降解大麥葡聚糖的活性。 為了篩選相對酶活較高的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)多次轉(zhuǎn)化后共計篩選了800 個轉(zhuǎn)化子進行搖瓶發(fā)酵，篩選到有明顯酶活的轉(zhuǎn)化子31 個，發(fā)酵酶活大約在10.0～25.0 U/mL，其余轉(zhuǎn)化子與空質(zhì)粒pKLAC1 轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母獲得的轉(zhuǎn)化子一樣，未檢測出葡聚糖酶酶活， 有可能是假陽性。 由以上分析可知， 基因eglA6 編碼的是一種葡聚糖酶。 在上述轉(zhuǎn)化子中，一株編號為SL105 的菌株發(fā)酵酶活相對較高，該重組菌命名為Kluyveromyces lacis GG799/pKLAC1-eglA6 SL105，簡稱為SL105，用于后續(xù)工作。 為便于敘述， 將eglA6 基因在乳酸克魯維酵母中的表達產(chǎn)物命名為AnEglA6K， 而前期工作中由巴斯德畢赤酵母表達的產(chǎn)物與文獻[9]一致，命名為AnEglA6。

2.3 重組酶AnEglA6K 的純化

將重組菌SL105 的發(fā)酵液先后用離子交換和分子篩的方法進行純化。 SDS-PAGE 電泳顯示了純化結(jié)果（見圖2）。 SL105 發(fā)酵液在5.5×104附近顯示出一條明顯的高表達條帶。 經(jīng)過純化后，純化液中的單一電泳條帶與這一高表達條帶相對分子質(zhì)量一致。 用圖像分析軟件Image lab 4.0 推算重組蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量，結(jié)果顯示，重組AnEglA6K 的表觀相對分子質(zhì)量為5.63×104。 根據(jù)基因eglA6 推測的翻譯產(chǎn)物的理論相對分子質(zhì)量為4.13×104， 表觀相對分子質(zhì)量比理論相對分子質(zhì)量高出約36%，這是用酵母表達系統(tǒng)表達外源蛋白質(zhì)時的常見現(xiàn)象，一般是重組蛋白在分泌過程中被糖基化所致。

圖2 AnEglA6K SDS-PAGE 電泳分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of AnEglA6K

作者所在課題組在前期研究中用巴斯德畢赤酵母實現(xiàn)了eglA6 基因的表達， 畢赤酵母表達的重組酶相對分子質(zhì)量為5.2×104。從相對分子質(zhì)量推算結(jié)果看，用乳酸克魯維酵母表達的重組酶相對分子質(zhì)量明顯大于前者[9]。 為進一步驗證兩者的差異，將兩種純酶一起電泳，結(jié)果見圖3。乳酸克魯維酵母的表達產(chǎn)物AnEglA6K 的表觀相對分子質(zhì)量明顯大于畢赤酵母的表達產(chǎn)物AnEglA6。 由于這兩條肽鏈的氨基酸序列幾乎完全一樣，相對分子質(zhì)量差異很可能源于糖基化的差異， 還有一種可能是源于AnEglA6 翻譯時出現(xiàn)提前終止的情況。為此，將純化后的AnEglA6 和AnEglA6K 送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進行C-端測序，結(jié)果顯示，兩種蛋白質(zhì)的最后4 個氨基酸均為Ser-Glu-Cys-Leu， 與根據(jù)eglA6 基因序列推測的氨基酸序列一致。 由此可見，AnEglA6 和AnEglA6K 的氨基酸序列是一致的，相對分子質(zhì)量差異應(yīng)該是源于糖基化程度的差異。

圖3 兩種蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量比較Fig. 3 Molecular weight comparison of two proteins

2.4 重組酶AnEglA6K 的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 重組酶在不同條件下的酶活在pH 3.0～7.0和60～80 ℃內(nèi)，對AnEglA6K 的酶活進行檢測，結(jié)果見圖4。 AnEglA6K 的最適溫度為75 ℃，最適pH 為5.0。 偏離最適條件時酶活逐步下降。

圖4 AnEglA6K 在不同pH 和溫度條件下的相對酶活Fig. 4 Relative activity of AnEglA6 in different pH and temperature

2.4.2 重組酶溫度穩(wěn)定性AnEglA6K 在低于65℃的條件下活性穩(wěn)定， 保溫6 h 酶活損失不超過20%。在70 ℃及以上保溫一定時間后，AnEglA6K 剩余酶活力變化情況見圖5。 在70 ℃和75 ℃下保溫，AnEglA6K 有比較明顯的失活， 但在相當(dāng)長的時間內(nèi)仍能保持較高酶活。 進一步檢測顯示，AnEglA6K在70 ℃和75 ℃下的酶活半衰期分別為5.4 h 和2.3 h。 在80 ℃下失活較快，保溫1 h 后相對殘余酶活54%， 實際測定其酶活半衰期為65.0 min， 可見AnEglA6K 能在一段時間內(nèi)耐受80 ℃高溫。AnEglA6K 在85 ℃下極易失活， 保溫1 h 后相對殘余酶活約為12%，酶活半衰期大約為15.0 min，可見AnEglA6K 能短時耐受85 ℃高溫。 溶液pH 條件對AnEglA6K 影響不明顯，在60 ℃及以下條件，pH 在2.0～8.0 時AnEglA6K 保溫6 h 酶活損失均在10%以內(nèi)。

圖5 AnEglA6K 的熱穩(wěn)定性Fig. 5 Thermostability of AnEglA6K

2.4.3 基因eglA6在兩種酵母中表達產(chǎn)物的性質(zhì)差異將AnEglA6K 和AnEglA6 的酶學(xué)性質(zhì)進行比較發(fā)現(xiàn)， 溫度對兩種酶酶活的影響基本相同，但pH 對兩者的影響以及兩者的溫度穩(wěn)定性有明顯差異，兩種重組酶的性質(zhì)比較見圖6～7。 由圖6 可見，基因eglA6 在兩種酵母中表達產(chǎn)物的pH 適應(yīng)性有明顯差異，AnEglA6 的最適pH 為4.0 而AnEglA6K的最適pH 為5.0。 比較發(fā)現(xiàn)在70 ℃以下溫度時，AnEglA6 和AnEglA6K 的熱穩(wěn)定性比較接近， 但在75 ℃下兩者的熱穩(wěn)定性表現(xiàn)出一定差異，由圖7 可見，AnEglA6K 的熱穩(wěn)定性略高于AnEglA6。 在80℃下，AnEglA6K 的熱穩(wěn)定性顯著高于AnEglA6，在保溫1 h 后AnEglA6 的相對殘余酶活約23%，而經(jīng)同樣處理的AnEglA6K 的相對殘余酶活達到54%。進一步檢測結(jié)果顯示， 在80 ℃下，AnEglA6 的酶活半衰期為23.0 min 而AnEglA6K 為65.0 min。 可見AnEglA6K 在80 ℃下的熱穩(wěn)定性顯著高于AnEglA6。 AnEglA6K 能短時耐受85 ℃高溫，AnEglA6 在85 ℃下迅速失活，保溫1 h 后基本檢測不到酶活，其酶活半衰期在5 min 內(nèi)。

圖6 pH 對AnEglA6K 和AnEglA6 酶活的影響Fig. 6 Effects of pH on the activity of AnEglA6K and AnEglA6

圖7 AnEglA6K 和AnEglA6 的熱穩(wěn)定性比較Fig. 7 Comparison of thermostabiligy of AnEglA6K and AnEglA6

2.4.4 金屬離子對重組酶活力的影響常見金屬離子對AnEglA6K 的影響見表1。 大部分常見金屬離子以及EDTA 均對AnEglA6 酶活性影響不大。 在常見金屬離子中只有高濃度的Cu2+對酶活性有比較明顯的促進作用， 但過量Cu2+對人和動物都有潛在的傷害， 因此在葡聚糖酶的應(yīng)用環(huán)境中很少出現(xiàn)，這個結(jié)果對酶的實際應(yīng)用幫助不大。與AnEglA6 相比，AnEglA6K 對金屬離子更加不敏感。 Co2+、Mn2+對AnEglA6 的酶活有明顯促進作用， 高濃度的Fe3+則有顯著的抑制作用[9]。 而上述幾種離子對AnEglA6K的酶活影響都比較小。 高濃度的Cu2+是惟一一種能明顯促進AnEglA6K 活性的金屬離子， 但這種離子對AnEglA6 卻有輕微的抑制作用[9]。

表1 常見金屬離子對AnEglA6K 催化活力的影響Table 1 Effects of metal ions on AnEglA6K catalytic activity

2.5 重組酶AnEglA6K 的底物特異性

如表2 所示，以大麥葡聚糖和地衣多糖為底物時，AnEglA6K 酶活最高，比酶活分別為12 221.5 U/mg和17 824.1 U/mg。以CMC-Na 為底物時，AnEglA6K表現(xiàn)出較低的酶活， 為1 255.1 U/mg。 以酵母葡聚糖、凝結(jié)多糖等4 種以β-1，3-糖苷鍵為主的多糖為底物時，AnEglA6K 均未表現(xiàn)出明顯的酶活。 可見，AnEglA6K 不能降解β-1，3-糖苷鍵。 這個特點上AnEglA6K 和AnEglA6 完全一致， 但與黑曲霉來源的其他葡聚糖酶有明顯的差異。 根據(jù)文獻報道，黑曲霉來源的葡聚糖酶EglB[16]和葡聚糖酶En3gA、En3gB 和En3gC[2]都對凝結(jié)多糖或昆布多糖有一定的降解能力，只是活性都不高。 AnEglA6K 對表2 中前6 種底物降解活性的特點與AnEglA6 基本一致，可以推斷兩種酶均為內(nèi)切型β-1，4-葡聚糖酶[9]。

表2 AnEglA6K 與AnEglA6 的底物特異性Table 2 Substrate specificity of AnEglA6K and AnEglA6

AnEglA6K 純酶與微晶纖維素在經(jīng)過20 min 的反應(yīng)后，在反應(yīng)液中能檢測到明顯的還原糖，這說明AnEglA6K 對結(jié)晶型纖維素也有降解能力。AnEglA6K 的這一特點可能與AnEglA6K 分子羧基端的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域有一定的關(guān)系。 用Blast 軟件將eglA6 基因表達產(chǎn)物（為便于與兩種酵母表達的經(jīng)糖基化修飾的產(chǎn)物相區(qū)別，圖中標(biāo)注為AnEglA的氨基酸序列） 與美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）儲存的黑曲霉CBS513.88 基因組序列[8]中其他蛋白質(zhì)分子進行氨基酸序列比對， 結(jié)果見圖8。AnEglA 與葡聚糖酶EglB 顯示出最高同源性， 同源性為50.63%。

在黑曲霉來源的葡聚糖酶基因中，Eng1 是最早被克隆的基因，其表達產(chǎn)物具有很高的耐熱性[17]。不同的文獻對黑曲霉葡聚糖酶的命名不完全一致，但對文獻所提供的基因序列以及引物序列等進行分析可以發(fā)現(xiàn)，一些文獻[1，4，5，17-19]報道的黑曲霉葡聚糖酶的基因序列與Eng1 一致或基本一致。 在黑曲霉基因組中一段cDNA 基因 （GenBanK 登錄號：XM_001391932.2） 表達的內(nèi)切-β-葡萄糖酶B（EgIB） 的氨基酸序列與Eng1 的表達產(chǎn)物幾乎完全一致， 為便于敘述將這些基因的表達產(chǎn)物統(tǒng)稱為EglB。研究者對EglB 的結(jié)構(gòu)功能已經(jīng)進行了深入研究[16，18]。 根據(jù)前人[16]報道，圖8 中星號標(biāo)注的兩個Glu 殘基（E142 和E248）很可能是EglB 的催化活性基團。在催化活性基團附近，AnEglA 和EglB 的氨基酸序列高度保守，由此可以推斷兩種酶可能有相似的催化機理。 另外一個值得注意的現(xiàn)象是，與EglB相比，AnEglA 在C-端多出一段81 個氨基酸殘基的區(qū)域。將這81 個氨基酸的序列提交NCBI 網(wǎng)站進行Blast 搜索比對， 結(jié)果顯示其最后36 個氨基酸殘基（圖8 方框部分） 的區(qū)域與真菌纖維素酶的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域I 高度同源， 這個結(jié)構(gòu)域與結(jié)晶型纖維素的降解有關(guān)[20]。 這一結(jié)構(gòu)域的差異可能是AnEglA6K 具有微晶纖維素降解能力而EglB 不具有這一能力的原因[16]。 分析表2 的數(shù)據(jù)還可以發(fā)現(xiàn)，AnEglA6 與AnEglA6K 對結(jié)晶纖維素的降解能力有顯著差異，前者完全不水解微晶纖維素。 這是一個比較意外的結(jié)果，因為AnEglA6 與AnEglA6K 的氨基酸序列完全一致， 前者同樣具有上述36 個氨基酸殘基組成的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。 為了防止純化不完全對檢測結(jié)果的影響， 將含空質(zhì)粒的對照菌K.lactis GG799/pKLAC1 的發(fā)酵液以及對照菌發(fā)酵液與AnEglA6 的混合液分別同微晶纖維素反應(yīng)，結(jié)果均未檢測到明顯的還原糖， 可見AnEglA6K 與AnEglA6 對微晶纖維素降解能力的差異只可能源于兩者本身，從上述結(jié)果看，兩者糖基化方式或程度的不同最有可能導(dǎo)致這一差異。 糖基化對真菌纖維素酶的性質(zhì)有復(fù)雜的影響[21]，Chen 等發(fā)現(xiàn)，里氏木霉（Trichoderma reesei）纖維素酶纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域某些位點的連接糖基化能提高蛋白質(zhì)分子的纖維素結(jié)合活性[22]，這與結(jié)晶纖維素的降解有著密切的關(guān)系。

圖8 AnEglA 與EglB 氨基酸序列比對Fig. 8 Sequence alignment of AnEglA and EglB

2.6 重組酶AnEglA6K 的水解產(chǎn)物

AnEglA6K 過度水解大麥葡聚糖（見圖9），主要產(chǎn)物是相對分子質(zhì)量介于麥芽五糖和二糖之間的小分子寡糖，大于五糖的產(chǎn)物幾乎未見，沒有明顯的高相對分子質(zhì)量葡聚糖，這一特點與前人從黑曲霉中得到的另外3 種內(nèi)切型β-葡聚糖酶一致[2]。 內(nèi)切型β-葡聚糖酶的一個重要特點是對葡聚糖分子內(nèi)部的β-1，4-糖苷鍵進行隨機水解，但優(yōu)先水解與β-1，3-糖苷鍵臨近的β-1，4-糖苷鍵[1]，產(chǎn)生大量相對分子質(zhì)量較小的寡糖。外切型β-葡聚糖酶降解大麥葡聚糖一般首先產(chǎn)生大量的二糖，水解過程被β-1，3-糖苷鍵阻擋而無法繼續(xù)進行，從而留下大量的高相對分子質(zhì)量葡聚糖。 從水解產(chǎn)物可見，AnEglA6K 是一種內(nèi)切型β-葡聚糖酶， 這與根據(jù)其底物特異性推測的結(jié)果一致， 也與前文報道的AnEglA6 特性一致[9]。

圖9 AnEglA6K 降解大麥葡聚糖的產(chǎn)物分析Fig. 9 Products of AnEglA6K decomposition of barley glucan

3 結(jié) 語

黑曲霉是工業(yè)用葡聚糖酶的生產(chǎn)菌種之一，多年來人們對黑曲霉來源的葡聚糖酶進行了大量的研究并克隆表達了多條β-葡聚糖酶編碼基因。研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉來源的葡聚糖酶基因的異源表達產(chǎn)物大多具有較好的耐熱性和耐酸性[2-7，17-19]。 韓冰等[9]研究者對這些基因的異源表達產(chǎn)物進行了比較，結(jié)果顯示， 黑曲霉來源的葡聚糖酶中， 以Eng1 基因和eglA6 基因在巴斯德畢赤酵母中的異源表達產(chǎn)物的耐熱性最高。 其中Eng1 基因的表達產(chǎn)物最適溫度為70 ℃，eglA6 基因的表達產(chǎn)物AnEglA6 最適溫度為75 ℃， 后者是黑曲霉來源的葡聚糖酶基因異源表達產(chǎn)物中熱穩(wěn)定性最高的重組酶[9]。 作者以乳酸克魯維酵母為宿主表達eglA6 基因， 獲得了比AnEglA6 耐熱性更高的表達產(chǎn)物AnEglA6K。 關(guān)于黑曲霉耐熱性葡聚糖酶的研究中，有一個有趣的現(xiàn)象是黑曲霉本身并未發(fā)現(xiàn)耐熱性很高的葡聚糖酶。Li 等研究發(fā)現(xiàn)， 黑曲霉本身表達野生型EglB 的最適溫度只有60 ℃， 該基因在畢赤酵母中的表達產(chǎn)物最適溫度為70 ℃， 而后者的相對分子質(zhì)量明顯高于前者，由此推測，酵母宿主對產(chǎn)物的過度糖基化很可能是其耐熱性提高的原因[16]。 作者以乳酸克魯維酵母表達eglA6 基因， 表達產(chǎn)物AnEglA6K 的相對分子質(zhì)量為5.6×104，而同一基因在巴斯德畢赤酵母中的表達產(chǎn)物AnEglA6 的相對分子質(zhì)量為5.2×104，前者比后者高出7.7%。酶學(xué)性質(zhì)分析顯示，AnEglA6K 的熱穩(wěn)定性明顯高于AnEglA6， 前者在80 ℃下的酶活半衰期為65.0 min 而后者只有23.0 min。 從實驗數(shù)據(jù)看， 糖基化程度的提高與eglA6 基因表達產(chǎn)物耐熱性提高存在明顯的相關(guān)性，這與Li 等的推測一致[16]。 耐熱型葡聚糖酶的一個重要應(yīng)用方向是用作飼料添加劑。 飼料生產(chǎn)的造粒工段的溫度一般在75～90 ℃。 AnEglA6K 在80 ℃左右明顯比AnEglA6 具有更高的穩(wěn)定性， 可見eglA6 基因在乳酸克魯維酵母中的表達產(chǎn)物在應(yīng)用上有明顯的優(yōu)勢。

在項目前期研究中發(fā)現(xiàn)，eglA6 基因在巴斯德畢赤酵母中的表達產(chǎn)物AnEglA6 能高效降解葡聚糖及地衣多糖，但不降解結(jié)晶型纖維素。 而該研究卻發(fā)現(xiàn)，eglA6 基因在乳酸克魯維酵母中的表達產(chǎn)物AnEglA6K 具有明顯水解結(jié)晶型纖維素的能力。蛋白質(zhì)序列分析顯示，AnEglA6K 的C-端具有明顯的纖維素結(jié)合區(qū)域 （cellulose bingding domain，CBD）。 CBD 有助于纖維素酶分子吸附在結(jié)晶型纖維素表面從而有利于底物的降解[23]。 李相前等將海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）的內(nèi)切型葡聚糖酶Cel12B 與木聚糖酶的CBD 編碼基因進行融合表達獲得嵌合體酶，結(jié)果顯示嵌合體酶對微晶纖維素有明顯水解功能而Cel12B 則完全不水解微晶纖維素[20]。 從結(jié)果看，eglA6 基因表達產(chǎn)物水解纖維素的功能與其糖基化的情況有著復(fù)雜的關(guān)系，因此要準(zhǔn)確揭示eglA6 在原宿主中的功能， 最可靠的方法是在黑曲霉中高效表達該基因，再分析表達產(chǎn)物的性質(zhì)。

作者采用乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng)對eglA6 基因進行異源表達，獲得的重組酶最適溫度75 ℃，最適pH 為5.0，在80 ℃下酶活半衰期為65.0 min，能短時耐受85 ℃高溫，是一種高耐熱葡聚糖酶，在飼料加工中有較好的應(yīng)用前景。