PCR-毛細電泳片段分析法檢測毛細支氣管炎病原的臨床價值探討

季妙玉 呂佳美 李海燕 陳小芳 溫順航 張海鄰 錢燕巧 董琳

毛細支氣管炎是嬰幼兒常見的下呼吸道疾病，嚴重影響嬰幼兒的身體健康。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）是毛細支氣管炎最常見的病原，約占 50%～80%[1]。鼻病毒（rhinovirus,RV）是毛細支氣管炎的第二大病原，約占20%～40%[2]。其他能引起毛細支氣管炎的病原包括偏肺病毒（human metapneumovirus,HMPV）、博卡病毒（human boca virus,HBoV）、副流感病毒（human parainfluenza virus,HPIV）、流感病毒（influenza virus,Flu）、腺病毒（adenovirus,ADV）等。不同病原對毛細支氣管炎患兒的遠期呼吸道結局的影響程度也有所差別，因此，明確毛細支氣管炎的病原顯得尤為重要。

目前，檢測呼吸道病毒的方法多種多樣。病毒培養(yǎng)仍是金標準，但是由于其耗時長、費用高且專業(yè)要求高，臨床應用并不廣泛。直接免疫熒光法（direct immunofluorescence assay,DFA）具有低成本、高效率等優(yōu)點，但其病毒檢測種類有限。相較于DFA，PCR具有病毒檢測種類多、靈敏度和特異度高等優(yōu)點[3]。本研究分別采用PCR-毛細電泳片段分析法（PCR-capillary electrophoresis fragment analysis,PCR-CEFA）和 DFA檢測毛細支氣管炎患兒的呼吸道病毒，從而了解PCRCEFA與DFA在病毒檢出率、檢測靈敏度及特異度上的差異，并探討PCR-CEFA檢測毛細支氣管炎病原的臨床應用價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年1至12月溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院兒科收治的因毛細支氣管炎住院的≤24個月且喘息次數(shù)≤2次的患兒932例，其中男702例，女230例；年齡1～24個月，中位年齡6個月，≤12月齡790例，＞12～24月齡142例。納入標準：（1）臨床診斷為毛細支氣管炎，診斷標準參考《諸福棠實用兒科學》第8版[4]；（2）喘息次數(shù)≤2次。排除標準：（1）患慢性心肺疾?。ㄏ忍煨孕呐K病、支氣管炎肺發(fā)育不良、肺纖維化等）、先天性呼吸道畸形、早產(chǎn)、雙胎、免疫缺陷等基礎疾病者；（2）臨床資料不全者。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過，所有患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 呼吸道標本采集及處理 患兒入院24 h內(nèi)取鼻咽分泌物1～2 ml，置于2 ml 0.9%氯化鈉溶液中待檢，用漩渦混合器打散鼻咽分泌物黏液后，1 500 r/min離心10 min，沉淀物用pH 7.2的PBS 8～10 ml洗滌2次，再用少量PBS調(diào)成懸液呈淡云霧狀，制片，用于DFA檢測。采用TANBeadOptiPure Viral Auto Tube（中國臺灣圓點奈米技術股份有限公司，型號：SLA-32）對鼻咽分泌物標本進行自動磁珠提取，提取核酸后置于PCR管中保存。

1.3 DFA檢測病毒抗原 吸管吸取細胞懸液點于帶孔玻片，干燥后冷丙酮固定10 min。采用熒光標記的呼吸道病毒單克隆抗體分別檢測RSV、ADV、Flu A、B型、HPIV 1-4型病毒抗原，具體過程按試劑說明書操作，結果判斷以見到≥2個完整細胞內(nèi)有明亮黃綠色熒光為陽性，否則為陰性。

1.4 PCR-CEFA檢測病毒核酸 （1）病原檢測：檢測病毒包括 RSV、RV、ADV、Flu A、B 型、HPIV 1-4 型、HBoV、HMPV、冠狀病毒（coronavirus,COV）。（2）引物設計：根據(jù)NCBI上公布的病原體目的序列，進行Blast比對分析，找到各個病毒的相對保守的區(qū)域并設計引物，將所有檢測靶點的反向和正向引物分別混合為反轉(zhuǎn)錄引物混合液（RT primer mix）和PCR引物混合液（PCR primer mix）。（3）多重 PCR擴增：按說明書在PCR管內(nèi)加入試劑（寧波海爾施基因科技有限公司，批號：180111004、190325003、190514002）和樣品以進行目的片段的反轉(zhuǎn)錄步驟，混勻后按以下溫度孵育：48℃1 min、42℃ 60 min、95℃ 5 min，然后4℃保存。之后按比例在新PCR管內(nèi)加入試劑和樣品以進行目的片段的PCR步驟，混合后按以下溫度進行熱循環(huán)反應：94℃1 min、94 ℃ 30 min、60 ℃ 30 min、70 ℃ 1 min，上述步驟重復35次，70℃ 1 min，然后4℃保存。（4）毛細電泳片段分析：配制下述毛細電泳體系：上樣液38.5 μl+DNA 內(nèi)標 0.5 μl+PCR 產(chǎn)物 1 μl，合計 40 μl，將約220 μl分離液加入96孔分離液板上對應的孔中。用遺傳分析儀（美國Thermo Fisher公司，型號：ABI 3500Dx）對各種樣品的PCR擴增產(chǎn)物進行毛細電泳片段分析。具體檢測由寧波海爾施基因科技有限公司完成。

1.5 流行病學資料收集和分組比較 收集患兒性別、年齡、既往喘息史、濕疹史、哮喘家族史、家族過敏性疾病史、總IgE、血嗜酸性粒細胞計數(shù)（blood eosinophil count,B-Eos）等資料。對于流行病學資料不全的患兒進行電話詢問，部分患兒因停機、空號等原因在后續(xù)流行病學資料比較時予以剔除。比較RSV組與RV組患兒流行病學資料及實驗室檢查結果。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。一致性檢驗采用Kappa檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PCR-CEFA和DFA病毒檢出率比較 經(jīng)PCRCEFA檢測，有822例患兒至少檢測出1種病毒，共檢出981株病毒，病毒檢出率為88.2%（822/932）。以RV和RSV檢出率較高，分別為35.7%和34.2%。病毒混合感染150例（16.1%），其中兩種病毒混合感染141例，以RSV合并RV感染為主，占34.0%（48/141）；3種病毒混合感染9例，占6.0%（9/150）。經(jīng)DFA檢測，有313例患兒至少檢測出1種病毒感染，共檢出318株病毒，病毒檢出率為33.6%（313/932）。以RSV檢出率最高，占26.5%。病毒混合感染5例，占1.6%（5/313），均為兩種病毒混合感染。PCR-CEFA病毒檢出率高于DFA病毒檢出率，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=583.658，P＜0.01）。PCR-CEFA 對 RSV、HPIV、Flu、ADV 的檢出率均高于DFA，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表1。

表1 PCR-CEFA和DFA病毒檢出率比較[例（%）]

2.2 PCR-CEFA和DFA對呼吸道病毒檢測效能的比較 以DFA為參照，對PCR-CEFA檢測RSV、HPIV、Flu、ADV的效能進行分析，發(fā)現(xiàn)相較于DFA，R-CEFA檢測RSV、HPIV、Flu、ADV的特異度均達80%以上，見表2。此外，在932例毛細支氣管炎患兒中，DFA共檢出 RSV、HPIV、Flu、ADV 4種病毒，選擇與之相同病毒的PCR-CEFA檢測結果進行Kappa檢驗，兩者一致性較好（Kappa=0.459，P＜0.05），見表 3。

表2 PCR-CEFA和DFA對呼吸道病毒檢測效能的比較

表3 PCR-CEFA和DFA檢測4種呼吸道病毒的一致性比較

2.3 不同年齡組患兒病毒檢出率比較 ≤12月齡患兒 RSV檢出率高于＞12～24月齡患兒，RV、ADV、HBoV檢出率均低于＞12～24月齡患兒，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；但不同年齡組患兒HPIV、HMPV、Flu、COV檢出率比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表 4。

表4 不同年齡組患兒病毒檢出率比較[例（%）]

2.4 RSV組與RV組患兒流行病學資料及實驗室檢查結果比較 收集RSV、RV陽性患兒的臨床資料，剔除其中流行病學資料不齊全者，共納入582例患兒，其中RSV組284例，RV組298例。RV組患兒年齡、B-Eos升高比例均明顯高于RSV組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；而兩組患兒性別、既往喘息史、濕疹史、哮喘家族史、家族過敏性疾病史、總IgE升高比例比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表5。其余病毒例數(shù)較少，未予分析。

表5 RSV組與RV組流行病學資料及實驗室檢查結果比較

3 討論

毛細支氣管炎是1歲以下嬰兒住院最常見的疾病。能引發(fā)毛細支氣管炎的病毒多種多樣，準確地檢測病原體有利于指導治療、減少傳播和降低住院成本，而一種能涵蓋多種病毒且檢測陽性率高的檢測方法在此時顯得尤為重要。本研究采用PCR-CEFA和DFA對932例毛細支氣管炎患兒的鼻咽分泌物進行呼吸道病毒檢測，結果顯示PCR-CEFA病毒檢出率明顯高于DFA。此外，本研究中，PCR-CEFA對于混合感染的檢出率亦高于DFA。其中以RSV合并RV感染最為多見，這與Tran等[5]的研究結果相一致。

RSV是引起嬰幼兒毛細支氣管炎的最常見病毒，本研究中PCR-CEFA對RSV的檢出率明顯高于DFA。PCR-CEFA對RSV的檢出率更接近于孫亞林等[6]的研究，但稍低于Jain等[1]的研究。此外，在本研究中，以DFA為參照，PCR-CEFA表現(xiàn)出良好的特異度，這意味著采用PCR-CEFA可以較大程度地減少對RSV感染患兒的誤診，從而更有利于明確感染病原、指導后續(xù)治療。

ADV在≤3歲嬰幼兒中感染風險更高[7]。ADV感染在對肺部造成損害的同時，也會對其他器官、系統(tǒng)造成損傷，從而引起較高的病死率。因此，一種更高效的檢測方法亟待應用。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管DFA能夠?qū)DV進行檢測，但其檢出率較低，DFA在932份樣本中僅發(fā)現(xiàn)5例感染者，而PCR-CEFA則檢出36例感染者，顯然，PCR-CEFA對ADV的檢測優(yōu)于DFA。

由于RV的血清型多且缺乏常見的群抗原，導致利用DFA檢測RV抗原變得困難。近年來，隨著PCR技術的應用，人們對于RV的研究逐漸增多。研究顯示RV是僅次于RSV的能引發(fā)毛細支氣管炎的病毒[2]。但也有部分研究發(fā)現(xiàn)在毛細支氣管炎患兒中RV占比較高，甚至高于RSV[8]。本研究中，經(jīng)PCR-CEFA檢測后亦發(fā)現(xiàn)，RV的檢出率略高于RSV，這可能與樣本量及流行年份有關。隨著對RV認識的不斷增加，不難發(fā)現(xiàn)，RV是引發(fā)毛細支氣管炎的重要病毒，需引起廣大臨床醫(yī)生的重視。

HMPV、HBoV、COV亦可引發(fā)毛細支氣管炎。大量研究顯示，HMPV、HBoV、COV感染所致毛細支氣管炎與其后反復喘息，甚至哮喘的發(fā)生息息相關[9-11]。因此，對于HMPV、HBoV、COV的研究不容忽視。PCR-CEFA能檢測DFA所不能檢測的病毒（包括RV、HMPV、HBoV、COV），有利于今后對相關病毒及其亞型開展進一步研究，了解其臨床表現(xiàn)及臨床結局的異同。

本研究中，經(jīng)PCR-CEFA檢測發(fā)現(xiàn)，RSV、RV是毛細支氣管炎的主要病原體。因此，筆者對RSV、RV感染患兒的流行病學資料及實驗室檢查結果進行了分析。芬蘭的一項研究發(fā)現(xiàn)，RSV是12月齡以下毛細支氣管炎患兒中最常見的病原體，而RV則在12～24月齡患兒中更為突出[12]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，RSV、RV存在年齡分布差異，RSV主要見于≤12月齡患兒，RV主要見于＞12～24月齡患兒。本研究中ADV、HBoV亦存在年齡分布差異，但由于總例數(shù)較少，仍需加大樣本量以明確其是否存在年齡分布規(guī)律。有研究發(fā)現(xiàn)，RV毛細支氣管炎患兒B-Eos和總IgE常增高[12]，過敏、濕疹是毛細支氣管炎患兒反復喘息、學齡期兒童過敏性哮喘的危險因素[13]。本研究中，RV組患兒B-Eos升高比例高于RSV組，但兩組患兒濕疹史、總IgE比較差異均無統(tǒng)計學意義。目前關于RV和RSV與過敏性疾病的關系尚無定論，仍有待進一步研究證實。

綜上所述，RV、RSV是毛細支氣管炎的主要病原體，RSV感染主要見于≤12月齡患兒，而RV感染主要見于＞12～24月齡患兒；相較于RSV感染患兒，RV感染患兒更有可能出現(xiàn)B-Eos的升高。盡管PCRCEFA價格相對較高，但其具有檢測陽性率高、檢測病毒種類多且特異度良好的優(yōu)勢，可早期明確毛細支氣管炎的感染病原，從而為毛細支氣管炎后反復喘息乃至哮喘的早期預防和治療提供依據(jù)。