白芍總苷調(diào)控 NF-κB/TGF-β1/Smad信號通路對慢性盆腔炎大鼠子宮組織的影響

于輝 陳輝

慢性盆腔炎是女性上生殖道感染性疾病，表現(xiàn)為子宮、陰道及周圍結(jié)締組織炎癥，具有遷延難愈、反復(fù)發(fā)作的特點，甚至可引發(fā)慢性盆腔痛、異位妊娠、不孕等[1-2]。目前，臨床上對于慢性盆腔炎主要采取抗菌藥物、激素等藥物治療或物理療法，但療效并不理想，并且長時間應(yīng)用抗菌藥物易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥、多重感染等諸多弊端，增加治療難度[3]。

NF-κB/轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）/Smad 信號通路在機體炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4]。傳統(tǒng)中藥白芍為毛茛科植物芍藥的干燥根，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛的功效，常用于月經(jīng)不調(diào)、盜汗、腹痛等癥的治療。白芍總苷（total glucosides of paeony,TGP）是中藥白芍的主要活性成分，具有良好的抗炎活性[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，TGP對NF-κB/TGF-β1/Smad信號通路具有調(diào)控作用[6]。本實驗通過制備慢性盆腔炎大鼠模型，以婦科千金片為陽性對照藥物，探討TGP對慢性盆腔炎大鼠子宮的保護作用及其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級健康成年雌性未孕SD大鼠120只，體質(zhì)量200～240 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2018-004。分籠飼養(yǎng)于河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，室溫25℃，相對濕度55%～65%，12 h光照黑暗交替，自由飲水進食，無菌通風(fēng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開展實驗。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器 TGP膠囊（批號：20191124）購自寧波立華制藥有限公司；婦科千金片（批號：B190030407）購自株洲千金藥業(yè)股份有限公司；HE染色試劑盒（批號：200115）購自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-1β、IL-10 ELISA 試劑盒（批號：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0006）購自北京索萊寶科技有限公司；NF-κB、TGF-β1、Smad 同源物 2（Smad2）、Smad同源物 3（Smad3）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體和IgG 二抗（批號：bs-23217R、bs-0086R、bs-0718R、bs-3484R、bs-0061R、bs-0295G）購自北京博奧森生物科技有限公司；3×1010混合細(xì)菌懸液（鏈球菌∶大腸埃希菌∶金黃色葡萄糖球菌以1∶2∶1比例混合）由河北醫(yī)科大學(xué)生化教研室提供；RM2016型組織切片機購自上海徠卡儀器有限公司；BMJ-Ⅲ型包埋機購自常州郊區(qū)中威電子儀器廠；Spectra Max3型多功能酶標(biāo)儀購自美國Molecuar Devices公司；VE180型小型高通量電泳槽購自上海天能科技有限公司；SE300型電泳儀、TE22型轉(zhuǎn)膜儀購自美國Hoefer公司；DHG-9140A型烘烤箱購自上?；厶﹥x器制造有限公司；X-70型光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組、模型制備與給藥 采用隨機數(shù)字表法將120只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、婦科千金片組（150 mg/kg）[7]和 TGP 低、中、高劑量組（20、40、80 mg/kg）6組，每組20只。參照秦翠梅等[8]報道的方法制備慢性盆腔炎大鼠模型：實施麻醉后仰臥位固定，沿下腹部中線切口（長度約1 cm），暴露子宮，用1 ml無菌注射器針頭于子宮分叉處刺入子宮，連續(xù)來回抽推針頭3次造成機械損傷，然后以0.2 ml劑量注入混合細(xì)菌懸液，然后逐層縫合，碘伏消毒；假手術(shù)組大鼠僅子宮注射0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液（不來回抽推針頭，不造成機械損傷）。造模10 d后，TGP低、中、高劑量組分別給予濃度 4、8、16 g/L 的 TGP 溶液（5 ml/kg）灌胃，婦科千金片組給予濃度30 g/L的婦科千金片溶液（5 ml/kg）灌胃，假手術(shù)組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液（5 ml/kg）灌胃，各組均1次/d、療程21 d。

1.3.2 子宮大體情況觀察及子宮粘連評分 末次給藥24 h后，各組分別隨機取10只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，開腹取子宮組織，觀察子宮大體情況。通過Verco評分評價子宮粘連狀況[9]：無粘連計0分；輕微膜狀粘連計1分；子宮角與腸管或膀胱粘連，根據(jù)粘連致密程度計2～3分；嚴(yán)重粘連、子宮固定不動計4分。

1.3.3 子宮系數(shù)計算 大鼠稱重后摘取子宮組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后稱量子宮重量，子宮系數(shù)=子宮重量/大鼠體重。

1.3.4 子宮組織病理學(xué)檢查及病理評分 將子宮組織置4%多聚甲醛溶液固定3 d，經(jīng)石蠟浸潤包埋、切片（厚度4 μm）、透明和脫蠟水化后行常規(guī)HE染色，中性樹膠封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察子宮組織病理學(xué)變化。分別從宮腔擴張或粘連、上皮變性壞死、慢性炎癥浸潤、內(nèi)膜充血水腫和上皮細(xì)胞增生5個方面進行病理評分[10]，根據(jù)病變程度分別計0～3分。

1.3.5 血清炎癥因子水平檢測 末次給藥24 h后，分別取各組剩余10只大鼠，麻醉后開腹，經(jīng)腹主動脈取血，3 500 r/min離心5 min后取血清，遵照ELISA試劑盒操作方法，通過酶標(biāo)儀檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平。

1.3.6 子宮組織 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表達水平檢測 采用Western blot法?！?.3.5”步驟取血完成后，頸椎脫臼處死大鼠，取每只大鼠子宮組織100 mg，0.9%氯化鈉溶液沖洗后加入適量4℃冷裂解液，冰上靜置30 min，通過蛋白提取試劑盒提取子宮組織總蛋白，12 000 r/min離心15 min后取上清液，BCA法檢測總蛋白含量，100℃變性10 min，90 V恒壓電泳分離蛋白后300 mA恒流將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，8%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，滴加目標(biāo)蛋白NF-κB（1∶800）、TGF-β1（1∶800）、Smad2（1 ∶1 000）、Smad3（1∶1 000）和 β-actin（1∶2 000）一抗后 4 ℃孵育過夜，洗膜后滴加 IgG二抗（1∶3 000）后室溫孵育2 h，滴加ECL顯影后，通過Image J軟件分析條帶的灰度值，然后以β-actin為內(nèi)參計算目標(biāo)蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。采用Shapiro-Wilk檢驗對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，方差齊時，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；方差不齊時，多組間比較采用 Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用 Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮大體狀況觀察及子宮粘連評分比較 假手術(shù)組大鼠子宮顏色正常，未見充血水腫及周圍組織粘連；模型組大鼠子宮呈灰白色，充血水腫明顯，柔韌度和彈性降低，與周圍組織粘連嚴(yán)重，活動度變差，質(zhì)地硬；與模型組比較，TGP低、中、高劑量組和婦科千金片組大鼠子宮充血水腫、柔韌度降低、與周圍組織粘連等呈不同程度改善，其中TGP高劑量組和婦科千金片組子宮顏色接近正常，輕微充血水腫，少量膜性粘連，效果優(yōu)于TGP低、中劑量組，見圖1（插頁）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Verco評分升高（P＜0.01）；與模型組比較，TGP中、高劑量組和婦科千金片組Verco評分均降低（均P＜0.01）；TGP高劑量組與婦科千金片組Verco評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 1。

表1 各組大鼠子宮子宮粘連評分比較（分）

圖1 各組大鼠子宮大體狀況觀察[a：假手術(shù)組；b：模型組；c：婦科千金片組；d：白芍總苷（TGP）低劑量組；e：TGP中劑量組；f：TGP高劑量組]

2.2 各組大鼠子宮系數(shù)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮系數(shù)升高（P＜0.01）；與模型組比較，TGP中、高劑量組和婦科千金片組大鼠子宮系數(shù)均降低（均P＜0.01）；與婦科千金片組比較，TGP高劑量組大鼠子宮系數(shù)降低（P＜0.01），見表 2。

表2 各組大鼠子宮系數(shù)比較

2.3 各組大鼠子宮組織病理學(xué)改變及病理評分比較 假手術(shù)組大鼠子宮組織結(jié)構(gòu)清晰，肌纖維排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠子宮呈現(xiàn)上皮細(xì)胞增生，肌纖維紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤，腺體數(shù)量減少等病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；與模型組比較，TGP低、中、高劑量組和婦科千金片組子宮病變呈不同程度改善，其中TGP高劑量組效果最為顯著，見圖2（插頁）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮宮腔擴張或粘連、上皮變性壞死、慢性炎癥浸潤、內(nèi)膜充血水腫、上皮細(xì)胞增生5方面評分均升高（均P＜0.01）；與模型組比較，TGP中、高劑量組和婦科千金片組上述5方面評分均降低（均P＜0.01）；與婦科千金片組比較，TGP高劑量組上皮變性壞死、慢性炎癥浸潤評分均降低（均P＜0.01），但兩組宮腔擴張或粘連、內(nèi)膜充血水腫、上皮細(xì)胞增生評分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＞0.05），見表 3。

表3 各組大鼠子宮組織病理評分比較（分）

圖2 各組大鼠子宮組織病理學(xué)檢查所見[a：假手術(shù)組；b：模型組；c：婦科千金片組；d：白芍總苷（TGP）低劑量組；e：TGP中劑量組；f：TGP 高劑量組；HE 染色，×200]

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均升高且IL-10水平降低（均P＜0.01）；與模型組比較，TGP中、高劑量組和婦科千金片組TNF-α、IL-1β水平均降低且IL-10水平均升高（均P＜0.05）；與婦科千金片組比較，TGP高劑量組TNF-α水平降低且IL-10水平升高（均P＜0.05），但TGP高劑量組與婦科千金片組IL-1β水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平比較

2.5 各組 大 鼠 子 宮 組 織 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表達水平均上調(diào)（均P＜0.01）；與模型組比較，TGP中、高劑量組 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3 表達水平均下調(diào)（均P＜0.01）；與婦科千金片組比較，TGP高劑量組 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3 表達水平均下調(diào)（均P＜0.01），見圖 3和表 5。

表5 各組大鼠子宮組織NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達水平比較

圖3 各組大鼠子宮組織NF-κB、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、Smad 同源物 2（Smad2）、Smad 同源物 3（Smad3）蛋白表達的電泳圖[a：假手術(shù)組；b：模型組；c：婦科千金片組；d：白芍總苷（TGP）低劑量組；e：TGP 中劑量組；f：TGP 高劑量組]

3 討論

慢性盆腔炎為女性上生殖道的常見病和多發(fā)病，患病率超過10%，與經(jīng)期、性生活衛(wèi)生、宮腔手術(shù)及流產(chǎn)等密切相關(guān)。臨床上主要通過給予足療程的廣譜抗菌藥物來治療慢性盆腔炎，但長期應(yīng)用抗菌藥物可能導(dǎo)致人體菌群失調(diào)并產(chǎn)生耐藥性，增加治療難度[11]。近年來，隨著對中醫(yī)藥認(rèn)知的提升，中藥多靶點、多方位的整體調(diào)節(jié)且毒副作用小的優(yōu)點逐漸得到關(guān)注，其在慢性病治療領(lǐng)域的應(yīng)用日漸廣泛。

白芍為我國傳統(tǒng)中藥品種，在《本經(jīng)》《別錄》等典籍中均有記載，其味苦、性微寒，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛之功效，用于血虛萎黃、脅痛，腹痛等癥的調(diào)治。TGP為中藥白芍的主要活性成分，包括芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等成分，具有良好的抗炎活性和免疫調(diào)節(jié)作用。婦科千金片由千斤拔、金櫻根、穿心蓮、功勞木、單面針、當(dāng)歸、雞血藤、黨參共八味中藥配伍組成，具有抑菌、抗炎、提高免疫力等多種藥理學(xué)作用，是臨床治療慢性盆腔炎的一線用藥，總有效率達86%[12]。機械損傷聯(lián)合混合細(xì)菌感染法制備的慢性盆腔炎動物模型與人類慢性盆腔炎的病理特征及發(fā)病機制十分相似，是目前最常用且公認(rèn)的造模方法[13]。本實驗采用機械損傷聯(lián)合混合細(xì)菌感染的方法制備慢性盆腔炎大鼠模型后給予TGP進行治療，以婦科千金片作為陽性對照藥物，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)TGP或婦科千金片治療能夠明顯改善慢性盆腔炎大鼠子宮水腫、柔韌度和活動度，降低子宮粘連Verco評分和子宮系數(shù)，改善子宮上皮細(xì)胞增生、肌纖維紊亂、炎性細(xì)胞浸潤等病變，降低宮腔擴張或粘連、上皮變性壞死、慢性炎癥浸潤、內(nèi)膜充血水腫、上皮細(xì)胞增生病理評分，并且TGP高劑量組對子宮水腫及組織病理學(xué)改變的保護作用優(yōu)于婦科千金片組，提示TGP對慢性盆腔炎大鼠子宮具有保護作用。

慢性盆腔炎病理機制非常復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)在其疾病進展過程中發(fā)揮著重要作用。病原菌激活機體免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)機體炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β大量釋放，引發(fā)系列炎癥反應(yīng)進而導(dǎo)致子宮組織損傷；并且TNF-α、IL-1β作為炎性趨化因子能夠刺激粒細(xì)胞進一步釋放炎癥因子，形成炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而加重炎癥損傷[14]。IL-10是機體關(guān)鍵的抗炎因子，對維持機體正常的免疫功能至關(guān)重要[15]。NF-κB是機體廣泛存在的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，具有促進炎癥因子TNF-α、IL-1β合成與釋放并抑制IL-10合成的作用，在機體炎癥反應(yīng)中具有關(guān)鍵調(diào)控作用[16]；TGF-β1是一種受NF-κB調(diào)控表達的多效性因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡過程，并且對慢性炎癥、免疫應(yīng)答具有重要調(diào)控作用；Smad蛋白是TGF-β1下游信號傳導(dǎo)分子，其中Smad2、Smad3與受體結(jié)合被磷酸化活化后，能夠?qū)⑿盘杺鬟f到細(xì)胞核而促轉(zhuǎn)錄活化[17]。楊靜等[18]研究發(fā)現(xiàn)NF-κB/TGF-β1/Smad信號通路在慢性盆腔炎大鼠炎癥反應(yīng)及組織病理性損傷過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。目前，TGP在臨床上主要用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療，近年來藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TGP對腎臟、心肌等部位炎癥也具有抑制作用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGP治療能夠明顯降低慢性盆腔炎大鼠血清TNF-α、IL-1β水平并提高IL-10水平，下調(diào)子宮組織NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3表達，并且 TGP 高劑量組上述作用優(yōu)于婦科千金片組，提示抑制NF-κB/TGF-β1/Smad信號通路可能是TGP對慢性盆腔炎大鼠子宮起到保護作用的重要分子機制。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)婦科千金片治療能夠明顯降低血清TNF-α、IL-1β水平并提高IL-10水平，提示婦科千金片對慢性盆腔炎大鼠炎癥反應(yīng)具有抑制作用，與楊堃等[21]和李鑫等[22]研究報道一致；但婦科千金片對NF-κB/TGF-β1/Smad通路相關(guān)蛋白表達無顯著影響，說明婦科千金片和TGP的作用機制可能不同。易麗貞等[23]研究發(fā)現(xiàn)婦科千金片對慢性盆腔炎大鼠炎癥反應(yīng)的抑制作用可能與調(diào)控Toll樣受體4-磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路有關(guān)。

綜上所述，TGP具有抑制慢性盆腔炎大鼠子宮粘連和組織病變的作用，其機制可能與抑制NF-κB/TGF-β1/Smad信號通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)論為TGP作為慢性盆腔炎治療備選藥物提供了理論支持。纖維化是慢性盆腔炎所致子宮組織病變的另一重要機制[24-25]，TGP能否通過抑制纖維化對其起到保護作用還有待于進一步研究。