Hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4軸調(diào)控乳腺癌進展的研究

薛迪新 吳偉力 陳積賢 梁美珍 陳澄亮 賀新偉 余銘 林道浙

乳腺癌是我國女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率呈明顯上升趨勢。近年來，新的乳腺癌靶向藥物層出不窮，明顯改善了早期乳腺癌患者的預(yù)后，但是，局部晚期或者有轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者預(yù)后仍然較差。目前乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制仍舊不明，尋找新的生物靶點對于改善乳腺癌患者的預(yù)后意義重大。miR-7是一種小分子miRNA，研究顯示其在乳腺癌中表達異常，可抑制乳腺癌干細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[1-2]；研究還發(fā)現(xiàn)另一類非編碼環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）可調(diào)控miRNA的表達，進而參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。為了尋找新的調(diào)控miR-7的circRNA，筆者利用starBase數(shù)據(jù)庫（http://starbase.sysu.edu.cn/）進行檢索，結(jié)果顯示 hsa_circ_0001946與miR-7的結(jié)合位點最多，共有45個，因此，筆者預(yù)測hsa_circ_0001946可調(diào)控miR-7的表達。進一步檢索文獻發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0001946表達與非小細胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]，而在乳腺癌中，hsa_circ_0001946表達與癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機制尚未被闡明。研究顯示腫瘤上皮細胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力往往伴隨著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），還伴隨著E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達的變化[5]。因此，本研究探討hsa_circ_0001946表達與乳腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并闡述癌細胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移的能力與EMT的關(guān)系，為乳腺癌治療提供新的靶點。

1 材料和方法

1.1 組織標本的收集 收集2018年6月至2019年8月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院切除的乳腺癌組織標本及其癌旁正常乳腺組織標本91例，將標本用液氮速凍，保存在-80℃冰箱中。所有患者均為女性，術(shù)前均未進行放化療，乳腺癌分期根據(jù)2017年美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）提出的第8版分期。其中乳腺導(dǎo)管原位癌9例，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌82例。在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例（N1為22例，N2為8例，N3為11例）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過。

1.2 主要試劑和儀器 乳腺癌細胞株MCF-7（中國自北納生物公司）；RPMI1640細胞培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；sh-hsa_circ_0001946及其陰性對照核苷酸、miR-7 mimics及其陰性對照寡核苷酸、Kruppel樣因子 4（Kruppel-like factor 4，KLF4）小干擾 RNA（small interfering RNA,siRNA）及其陰性對照核苷酸（中國上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（日本 TaKaRa公司）；Matrigel（美國BD Bioscience公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；E-cadherin及N-cadherin一抗（美國Abcam公司）；200倍顯微鏡（日本Olympus公司）；RT-PCR儀（德國Biometra公司）；7500實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染和分組 乳腺癌細胞株MCF-7接種于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用Lipofectamine 2000進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 d將細胞接種至六孔板內(nèi)，每孔1×106個細胞，轉(zhuǎn)染時細胞長至90%融合。分別將Lipofectamine 2000和核苷酸加入到250 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基中稀釋，將稀釋液混合，輕輕混勻，室溫靜置20 min，轉(zhuǎn)染4～6 h后，細胞換液，轉(zhuǎn)染24 h后，收集細胞檢測miR-7、KLF4、E-cadherin、N-cadherin mRNA 表達及E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達。細胞分組：（1）轉(zhuǎn)染sh-hsa_circ_0001946組及陰性對照組：指轉(zhuǎn)染sh-hsa_circ_0001946的乳腺癌MCF-7細胞組及轉(zhuǎn)染陰性對照核苷酸的乳腺癌MCF-7細胞組，此組細胞分別采用實時熒光定量PCR法檢測miR-7、KLF4 mRNA表達水平及采用Transwell侵襲實驗檢測侵襲細胞數(shù)。（2）轉(zhuǎn)染miR-7 mimics組及其陰性對照組：指轉(zhuǎn)染miR-7 mimics的乳腺癌MCF-7細胞組及轉(zhuǎn)染陰性對照核苷酸的乳腺癌MCF-7細胞組，此組細胞采用實時熒光定量PCR法檢測KLF4 mRNA的表達水平。（3）轉(zhuǎn)染KLF4 siRNA組及其陰性對照組：指轉(zhuǎn)染KLF4 siRNA的乳腺癌MCF-7細胞組及轉(zhuǎn)染陰性對照核苷酸的乳腺癌MCF-7細胞組，此組細胞分別采用實時熒光定量PCR法和Western blot法檢測E-cadherin、N-cadherin mRNA和蛋白表達水平。

1.4 hsa_circ_0001946、miR-7、KLF4、E-cadherin、N-cadherin mRNA表達水平檢測 采用實時熒光定量PCR法?？俁NA提取采用TRIzol試劑，乳腺組織用液氮研磨，細胞直接用TRIzol試劑進行裂解，提取的總RNA保存在4℃冰箱供后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR使用。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件如下：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存；實時熒光定量PCR采用SYBRPremix Ex TaqTMⅡ，20 μl體系參照說明書，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)，所有實驗重復(fù) 3次，以β-actin為內(nèi)參。RT-PCR的引物如下：miR-7莖環(huán)引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAACAAAAT-3'，正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTGGAAGACTAGTGAT-3'，反向引物：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；hsa_circ_0001946 正向引物：5'-GAAAATCCACATCTTCCAGACAA-3'，反 向 引物：5'-GAAGACATGGATATTGAGCCAGT-3'；KLF4 正向引物：5'-TTCCCATCTCAAGGCACACC-3'， 反 向 引 物 ：5'-CATGTGTAAGGCGAGGTGGT-3'；E-cadherin 正 向 引物：5'-CCTTCACAGCAGAACTAACA-3'，反向引物：5'-CGCTTTCAGATTTTCATCAA-3'；N-cadherin 正向引物：5'-ATTGGACCATCACTCGGCTTA-3'， 反 向 引 物：5'-CACACTGGCAAACCTTCACG-3'；β-actin 正向引物：5'-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，反向引物：5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'。 采 用 2-ΔΔCt法 計 算RNA的相對表達量。

1.5 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。使用Matrigel包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃ 30 min使Matrigel聚合成凝膠，撤血清讓細胞饑餓12 h，制備細胞懸濁液。取細胞懸液100 μl加入Transwell小室，24孔板下室加入500 μl含10%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)細胞24 h，取出Transwell小室，棄掉孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醛固定30 min，將小室適當風干，在200倍顯微鏡下隨機選取3個視野對侵襲的細胞進行計數(shù)。

1.6 E-cadherin及N-cadherin蛋白表達水平檢測采用Western blot法。使用RIPA裂解液裂解細胞，收集完蛋白樣品后，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白質(zhì)濃度測定，用SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)染到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準備好的Western洗滌液中，漂洗1～2 min，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉 60 min。然后用 E-cadherin（1∶1 000）及N-cadherin（1∶3 000）一抗孵育，4 ℃過夜，加入洗滌液，在搖床上緩慢搖動洗滌5～10 min，吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5～10 min，共洗滌3次，二抗孵育，顯影，用膠片進行拍照。Western blot條帶的灰度值采用Image J軟件進行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織比較采用配對t檢驗。采用Pearson相關(guān)分析乳腺癌組織中hsa_circ_0001946、miR-7、KLF4 mRNA表達水平的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中hsa_circ_0001 946、miR-7、KLF4 mRNA表達水平比較 與癌旁正常乳腺組織比較，乳腺癌組織中hsa_circ_0001946和KLF4 mRNA表達水平均升高，miR-7表達水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中hsa_circ_0001946、miR-7、KLF4 mRNA表達水平比較

2.2 乳腺癌組織中hsa_circ_0001946的表達與乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)系 正常乳腺組織、乳腺導(dǎo)管原位癌組織、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中hsa_circ_0001946 mRNA 表達水平分別為 0.686±0.458、0.628±0.216、1.256±0.614。與正常乳腺組織、乳腺導(dǎo)管原位癌組織比較，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中hsa_circ_0001946 mRNA表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.126和6.348，均P＜0.05）；而正常乳腺組織和乳腺導(dǎo)管原位癌組織中hsa_circ_0001946 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.668，P＞0.05），提示hsa_circ_0001946表達的升高與乳腺癌細胞的癌變無關(guān)，而與乳腺癌細胞發(fā)生浸潤有關(guān)，見圖1a。

進一步分析82例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者hsa_circ_0001946 mRNA表達水平為1.425±0.732，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的1.087±0.411，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.575，P＜0.05），提示 hsa_circ_0001946表達升高與乳腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，見圖1b。

圖1 乳腺癌組織中hsa_circ_0001946的表達與乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)系（a：正常乳腺組織、乳腺導(dǎo)管原位癌組織、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中hsa_circ_0001946 mRNA表達水平比較；b：有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中hsa_circ_0001946 mRNA表達水平比較；*P＜0.05）

2.3 乳腺癌組織中 hsa_circ_0001946、miR-7、KLF4 mRNA表達的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)顯示，乳腺癌組織中hsa_circ_0001946 mRNA的表達與miR-7的表達呈負相關(guān)（r=-0.418，P＜0.05），miR-7 的表達與 KLF4 mRNA mRNA 的表達呈負相關(guān)（r=-0.340，P＜0.05），提示在乳腺癌組織中，存在hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4的調(diào)控軸，見圖2。

圖2 乳腺癌組織中hsa_circ_0001946、miR-7、Kruppel樣因子4（KLF4）mRNA表達的散點圖（a：乳腺癌組織中hsa_circ_0001946與miR-7表達的散點圖；b：乳腺癌組織中miR-7與KLF4 mRNA表達的散點圖）

2.4 轉(zhuǎn)染sh-hsa_circ_0001946組及其陰性對照組中miR-7、KLF4 mRNA表達水平比較以及轉(zhuǎn)染miR-7 mimics組及其陰性對照組中KLF4 mRNA表達水平比較 轉(zhuǎn)染sh-hsa_circ_0001946組miR-7表達水平為2.119±0.135，高于陰性對照組的 0.675±0.139，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-22.351，P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染 sh-hsa_circ_0001946組 KLF4 mRNA表達水平為 0.752±0.088，低于陰性對照組的1.694±0.141，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.965，P＜0.05）。轉(zhuǎn)染 miR-7 mimics組 KLF4 mRNA表達水平為0.532±0.151，低于陰性對照組的1.619±0.138，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.966，P＜0.05）。上述結(jié)果提示在乳腺癌細胞株MCF-7中，存在hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4的調(diào)控軸。

2.5 轉(zhuǎn)染sh-hsa_circ_0001946組及其陰性對照組侵襲細胞數(shù)比較 轉(zhuǎn)染sh-hsa_circ_0001946組侵襲細胞數(shù)為54.220±12.686，少于陰性對照組的153.986±16.733，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.255，P＜0.05），表明在乳腺癌細胞中，通過抑制hsa_circ_0001946的表達，可抑制癌細胞發(fā)生侵襲，見圖3（插頁）。

圖3 轉(zhuǎn)染sh-hsa_circ_0001946組及其陰性對照組侵襲細胞數(shù)比較（a：轉(zhuǎn)染sh-hsa_circ_0001946組；b：陰性對照組）

2.6 轉(zhuǎn)染KLF4 siRNA組及其陰性對照組中E-cadherin、N-cadherin mRNA和蛋白表達水平比較 轉(zhuǎn)染KLF4 siRNA組E-cadherin mRNA和蛋白表達水平均高于陰性對照組，N-cadherin mRNA和蛋白表達水平均低于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染KLF4 siRNA組中癌細胞的EMT受到抑制，見表2和圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染Kruppel樣因子4（KLF4）小干擾RNA（siRNA）組及其陰性對照組中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）蛋白表達的電泳圖（a：E-cadherin；b：N-cadherin）

表2 轉(zhuǎn)染KLF4 siRNA組及其陰性對照組中E-cadherin、N-cadherin mRNA和蛋白表達水平

3 討論

circRNA是一種非編碼RNA，缺乏5'和3'末端，曾被認為沒有生物學(xué)功能。而近年來，越來越多的circRNA的生物學(xué)功能被發(fā)現(xiàn)，研究顯示，許多circRNA在腫瘤中出現(xiàn)異常表達[6-7]，并參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，包括細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。進一步研究顯示，circRNA是通過海綿作用，抑制miRNA的功能，進而調(diào)節(jié)癌基因或者抑癌基因的表達來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。Liu等[9]研究顯示，乳腺癌細胞及組織中hsa_circ_001783表達升高，通過沉默hsa_circ_001783的表達，可抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲，進一步研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_001783是通過海綿吸附miR-200c-3p來發(fā)揮作用的。

近年研究顯示，miR-7通過抑制ESAM的表達來抑制乳腺癌干細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]；研究還顯示許多circRNA可調(diào)控miR-7的表達，例如hsa_circRNA_0006528[10]、circ-TPGS2[11]、Circ-TFCP2L1[12]，那么，是否還存在其他circRNA來調(diào)控miR-7的表達呢？為了尋找新的具有調(diào)控miR-7的circRNA，筆者利用starBase數(shù)據(jù)庫（http://starbase.sysu.edu.cn/）進行檢索，結(jié)果顯示，在5大miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫中（targetScan、picTar、RNA22、PITA、miRanda） 共有 784 條 circRNA，其中hsa_circ_0001946與miR-7的結(jié)合位點最多，共有45個可供結(jié)合的位點，表明hsa_circ_0001946與miR-7具有很高的結(jié)合效率，更為有效地調(diào)控miR-7的表達。因此筆者預(yù)測hsa_circ_0001946的靶點為miR-7。

miR-7是一種非編碼小RNA，可負性調(diào)控靶基因的表達，來抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Zhu等[13]研究顯示miR-7-5p可通過負性調(diào)控METTL7B靶基因，來抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖和侵襲。Zheng等[14]研究顯示miR-7-5p可通過抑制靶基因OGT的表達，來抑制結(jié)直腸癌癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Huang等[15]研究顯示KLF4是miR-7的靶基因，miR-7通過負性調(diào)控KLF4的表達來調(diào)控食管鱗狀細胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。同樣，Dong等[16]在大腸癌中的研究也顯示KLF4是miR-7的靶基因。而在乳腺癌細胞中，研究顯示miR-7表達下降[1]，KLF4表達升高[17]，提示在乳腺癌細胞中，KLF4也可能是miR-7的靶基因，進一步檢索相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌干細胞中miR-7表達下降，通過負性調(diào)節(jié)靶基因KLF4，導(dǎo)致癌基因 KLF4表達升高，促進癌細胞向顱腦轉(zhuǎn)移[18]。

眾所周知，干細胞在乳腺癌組織中比例極低，上述提到miR-7在干細胞中表達下降使其具有轉(zhuǎn)移潛能，而在乳腺癌組織中占絕大比例的普通癌細胞中，其miR-7表達下降，是否也可通過上調(diào)KLF4的表達，促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移呢？因此，本研究提出如下假設(shè)：在普通乳腺癌細胞中存在一條新的調(diào)控軸，即hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4，上述的調(diào)控軸可調(diào)節(jié)乳腺癌細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究顯示在91例乳腺癌組織中，hsa_circ_0001946表達升高，miR-7表達下降，KLF4 mRNA表達升高。本研究還顯示hsa_circ_0001946在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中表達明顯高于乳腺正常組織，提示hsa_circ_0001946表達的升高可促進乳腺癌發(fā)生侵襲。本研究還發(fā)現(xiàn)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中hsa_circ_0001946表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織，提示hsa_circ_0001946表達升高可促進乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織中miR-7的表達與hsa_circ_0001946、KLF4的表達均呈負相關(guān)，上述結(jié)果提示在乳腺癌組織中存在hsa_circ_00019 46/miR-7/KLF4調(diào)控軸，調(diào)控著乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究繼續(xù)在細胞水平驗證hsa_circ_0001946、miR-7、KLF4的調(diào)控關(guān)系，通過轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞株MCF-7中存在hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4的調(diào)控軸。為了進一步驗證hsa_circ_0001946表達與乳腺癌細胞侵襲的關(guān)系，本研究采用Transwell侵襲實驗，通過抑制hsa_circ_0001946的表達，可抑制癌細胞發(fā)生侵襲，因此，在乳腺癌細胞水平中也存在hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4的調(diào)控軸，此調(diào)控軸與癌細胞的侵襲有關(guān)。

KLF4是一種轉(zhuǎn)錄因子，有研究認為KLF4具有抑癌基因的功能[19]。在胃癌細胞中，KLF4的表達可促進胃癌細胞發(fā)生EMT，促進癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[20]。在頭頸部鱗狀細胞癌中，KLF4表達也與腫瘤的EMT有關(guān)[21]。EMT指上皮細胞失去細胞之間的連接，獲得間葉細胞的表型及侵襲、轉(zhuǎn)移的能力，EMT期間伴隨著上皮細胞標志物E-cadherin和細胞角化蛋白表達的下降，間葉細胞標志物波形蛋白和N-cadherin表達的升高[5]，本研究探討在乳腺癌細胞中KLF4的表達與EMT的關(guān)系，結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染KLF4 siRNA組MCF-7細胞中E-cadherin mRNA及蛋白表達水平均升高，而N-cadherin mRNA及蛋白表達水平均下降，提示KLF4的表達可促進乳腺癌細胞發(fā)生EMT，從而引起乳腺癌細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，在乳腺癌細胞中存在hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4調(diào)控軸，激活上述調(diào)控軸，可使癌細胞中hsa_circ_0001946表達升高，使癌細胞發(fā)生EMT，進而促進乳腺癌細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。