四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化斑塊膠原和血管重構(gòu)的影響

樊欽華，金 榮，杜雅薇，吳圣賢

動脈粥樣硬化為腦卒中、心絞痛等多種血管性疾病發(fā)生的基礎(chǔ)因素，本質(zhì)是慢性炎癥性反應過程[1]，斑塊結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定或破裂繼發(fā)栓塞嚴重者危及生命。四妙勇安湯是治療熱毒壅盛型脈管炎的經(jīng)典名方，具有清熱活血的功效，近年來逐漸拓展用于診治心腦血管疾病。細胞外基質(zhì)為斑塊纖維帽的主體結(jié)構(gòu)組成，是影響斑塊結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的關(guān)鍵部分，骨架以血管平滑肌細胞合成的膠原為主[2]。膠原表達直接決定纖維帽厚薄程度，其表達減少影響斑塊內(nèi)部構(gòu)成，導致斑塊纖維帽厚度減小。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)具有抗炎、抑制脂肪條紋病變、防止動脈粥樣硬化發(fā)展、調(diào)節(jié)血管細胞功能的作用[3]，是細胞外基質(zhì)，特別是Ⅰ型/Ⅲ型膠原合成的主要調(diào)節(jié)因子[4]。經(jīng)過血管內(nèi)皮損傷、小血管新生、纖維帽變薄、血管病理性重構(gòu)等環(huán)節(jié)后破壞斑塊內(nèi)部穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，導致易破損斑塊形成。課題組前期研究顯示，四妙勇安湯治療動脈粥樣硬化療效確切[5-6]，可有效減輕血管炎癥反應，抑制動脈粥樣硬化進展，且安全性高[7]。本研究通過制載脂蛋白E(ApoE)-/-小鼠主動脈粥樣硬化動物模型，觀察四妙勇安湯對模型小鼠主動脈粥樣硬化斑塊膠原和血管重構(gòu)的影響，進一步探討其對穩(wěn)定斑塊的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級7～8周齡雄性ApoE-/-小鼠35只及同品系C57BL/6J小鼠10只，體質(zhì)量20～25 g，購自北京大學醫(yī)學部實驗動物中心。實驗室室溫22～24 ℃，相對濕度50%，光照時間07：00～19：00。

1.2 實驗藥物 辛伐他汀(商品名舒降之，默沙東公司生產(chǎn)，批號：20080224)。四妙勇安湯免煎顆粒(含金銀花免煎顆粒、玄參免煎顆粒、當歸免煎顆粒、生甘草免煎顆粒，批號分別為：20081225、20090112、20090218、20081129)，由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院提供。

1.3 實驗試劑及儀器 兔抗鼠平滑肌細胞α肌動蛋白(SMα-actin)，購自武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1025 ；二步法免疫組化檢測試劑(羊抗兔/鼠IgG抗體-HRP多聚體)，貨號：ZB1901，濃縮型DAB顯色試劑盒，均購自北京中衫生物技術(shù)有限公司；天狼星紅(Siriued)，美國Sigma公司產(chǎn)，貨號：G1360。旋轉(zhuǎn)式組織脫水機(型號4634)、組織包埋機(型號5235)、石蠟溶蠟箱(型號PM-401)、切片機(型號CRM-440)均系日本SAKURA產(chǎn)品；美國Image-Pro Plus Version 6.0 (IPP6.0)圖像分析軟件。光學顯微鏡Olympus(型號BX51)。

1.4 方法

1.4.1 造模及分組 高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠制備動脈粥樣硬化模型?；A(chǔ)飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠7～8周，之后改高脂飼料喂養(yǎng)13周后隨機處死5只，光鏡下觀察確認已形成基礎(chǔ)動脈粥樣硬化病變。其余30只ApoE-/-小鼠隨機分為模型組、辛伐他汀組和四妙勇安湯組，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)19周。以同品系C57BL/6J小鼠10只作為正常對照組，普通飲食飼養(yǎng)。

1.4.2 給藥方法 按成人與小鼠給藥劑量換算系數(shù)折算小鼠用藥量。辛伐他汀、四妙勇安湯組蒸餾水溶解灌胃。模型組和正常對照組按體重比例采用生理鹽水灌胃。各組小鼠每日給藥，連續(xù)19周。

1.5 觀察指標

1.5.1 取材 各組小鼠取材前夜禁食，次日按體重3.5%腹腔注射適量水合氯醛麻醉處死。無菌條件下取出心臟，4%多聚甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋。每只小鼠主動脈根部取4個切面：升主動脈最近端橫截面、主動脈瓣起始橫截面、主動脈瓣附著部位并有冠狀動脈開口、主動脈瓣完全出現(xiàn)并有匯合傾向。切片厚5 μm，每隔100 μm連續(xù)取6張切片。

1.5.2 組織內(nèi)膠原纖維類型及分布情況 采取天狼星紅-苦味酸染色。切片常規(guī)脫蠟至水；0.1%飽和苦味酸天狼星溶液染色2 h，流水沖洗10 min；蘇木素復染1～2 min，取出切片，流水沖洗10 min；最后脫水封片。光學顯微鏡采集圖像，40倍和200倍鏡下IPP 6.0圖像分析軟件測量各組小鼠主動斑塊內(nèi)膠原含量。

1.5.3 主動脈根部斑塊內(nèi)平滑肌細胞α肌動蛋白(SM-αactin)表達量 采取免疫組化二步法。SM-αactin一抗稀釋濃度為1∶100，每組取1張磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進行陰性對照。切片脫蠟至水，加入3%的H2O2，經(jīng)室溫孵育、PBS沖洗、微波修復，再滴加二抗(羊抗兔/鼠IgG抗體-HRP多聚體)，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，PBS沖洗3次，觀察DAB顯色。40倍和200倍鏡下采用IPP 6.0圖像分析軟計算陽性面積占斑塊面積比值，對斑塊內(nèi)SM-αactin表達量進行分析。

1.5.4 主動脈根部斑塊內(nèi)TGF-β1、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達量 選取第3切面，采用Envision免疫組化二步法。TGF-β1、VEGF的抗體稀釋度依次分別為1∶200與1∶200，每組均以PBS代替一抗作為陰性對照，每張切片分別選取左上、左下、下3個視野，100倍鏡下采用IPP 6.0圖像分析軟件對陽性表達區(qū)域累積面積進行測定，計算斑塊內(nèi)各指標陽性區(qū)域面積占斑塊面積的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈粥樣斑塊膠原面積的影響 正常對照組主動脈根部未形成斑塊，四妙勇安湯組斑塊內(nèi)膠原面積增加，辛伐他汀組斑塊內(nèi)膠原面積有一定程度增加。詳見圖1。與模型組比較，辛伐他汀組膠原面積增大，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而四妙勇安湯組斑塊內(nèi)膠原面積增大明顯(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠主動脈粥樣斑塊膠原面積比較(±s) 單位：%

圖1 各組小鼠主動脈粥樣斑塊膠原面積天狼星紅-苦味酸染色圖(×40)

2.2 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠TGF-β1、VEGF表達陽性面積的影響 正常對照組主動脈根部無TGF-β1表達；與正常對照組比較，模型組斑塊局部TGF-β1表達明顯增加；與模型組比較，四妙勇安湯組TGF-β1表達明顯升高(P<0.05)。正常對照組主動脈根部無VEGF表達；與正常對照組比較，模型組斑塊局部VEGF表達升高。模型組與四妙勇安湯組VEGF表達陽性面積比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖2、圖3、表2。

表2 各組小鼠TGF-β1、VEGF表達陽性面積比較(±s) 單位：%

圖2 各組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)TGF-β1表達量免疫組化染色圖(×200)

圖3 各組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)VEGF表達量免疫組化染色圖(×200)

2.3 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈根部粥樣斑塊SM-αactin陽性面積的影響 正常對照組主動脈根部未形成斑塊，動脈中膜無SM-αactin陽性表達顆粒，模型組和四妙勇安湯組小鼠動脈中膜和斑塊纖維帽處可見SM-αactin陽性表達顆粒。詳見圖4。與模型組比較，四妙勇安湯組和辛伐他汀組SM-αactin表達陽性面積差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組小鼠主動脈根部斑塊SM-αactin表達面積比較(±s) 單位：%

圖4 各組小鼠主動脈根部斑塊SM-αactin表達量免疫組化染色圖(×200)

2.4 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠血管重構(gòu)的影響 與模型組比較，辛伐他汀組和四妙勇安湯組血管內(nèi)彈力膜面積和血管腔面積均呈減小趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 各組小鼠主動脈血管內(nèi)外彈力膜面積和血管腔面積比較(±s) 單位：mm2

3 討 論

在血管內(nèi)皮損傷、脂肪條紋病變、炎癥反應等多種因素相互作用下形成不穩(wěn)定易破裂的動脈粥樣硬化斑塊，是諸多心腦血管系統(tǒng)病變急性發(fā)作的基礎(chǔ)，纖維帽變薄、脆弱與血管重構(gòu)是主要的病理特點。血管炎癥反應在動脈粥樣硬化復雜的病理過程中發(fā)揮著重要作用，白細胞和血管平滑肌細胞之間的平衡是維持斑塊穩(wěn)定的關(guān)鍵要素[8]。白細胞，尤其是巨噬細胞和T細胞聚集，是從正常血管壁結(jié)構(gòu)向初期動脈粥樣硬化轉(zhuǎn)變的特征性標志[9]。炎癥反應辨證屬“熱毒”范圍，四妙勇安湯以金銀花為君，并佐以玄參、當歸、生甘草，促進血液循環(huán)同時可有效改善超敏C反應蛋白、腫瘤壞死因子α、白細胞介素-1、白細胞介素-6等炎癥介質(zhì)，具有較好的抗炎作用。

在病變血管中，以Ⅰ型TGF-β表達為主，TGF-β1可大量增加于細胞外基質(zhì)。動脈粥樣硬化病變過程中，脂肪刺激血管平滑肌細胞肥大、去分化，并增殖遷移至內(nèi)膜，導致血管壁肥厚。模型組小鼠表現(xiàn)的低含量TGF-β1可能導致血管壁中白細胞聚集。TGF-β在體內(nèi)具有一系列協(xié)同保護效應[3]，這種保護作用喪失可增加脂質(zhì)病變沉積，導致穩(wěn)定的富含細胞外基質(zhì)的斑塊表型轉(zhuǎn)變?yōu)橛衅屏扬L險的不穩(wěn)定的促炎斑塊[10]。斑塊內(nèi)白細胞聚集增加，加之其余血管平滑肌細胞產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)減少，增加斑塊破裂風險。TGF-β1通過下游信號Smad3可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達，進而阻止細胞外基質(zhì)降解[11]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB是通過核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制因子A(IκBα)的磷酸化被激活，再經(jīng)絲裂原活化蛋白激酶刺激從而調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導[12]。課題組前期實驗研究表明，四妙勇安湯可降低核轉(zhuǎn)錄因子-κB，增高核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制因子A(IκBα)表達，還可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9，降低模型小鼠總膽固醇、三酰甘油水平[6，13-14]。本研究結(jié)果顯示，四妙勇安湯組斑塊局部TGF-β1與膠原表達增加，進一步證實了四妙勇安湯是通過增加TGF-β1，抑制炎性細胞聚集，防止脂質(zhì)損傷，并調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子-κB/IκBα/基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達，引起纖維帽血管平滑肌細胞產(chǎn)生細胞外基質(zhì)，抑制膠原分解，促進血管纖維化，進而維持正常的血管壁結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定斑塊。VEGF雖未見顯著差異，相較于模型組高VEGF表達情況，說明四妙勇安湯具有減少VEGF趨勢，提示四妙勇安湯可一定程度保護血管內(nèi)皮細胞，抑制斑塊內(nèi)血管新生。

血管病理性重構(gòu)是動脈粥樣硬化的晚期特征，內(nèi)外因素長期作用下刺激血管平滑肌細胞遷移，基質(zhì)金屬蛋白酶降解膠原纖維，細胞外基質(zhì)代謝失衡重組，導致血管適應性動態(tài)重塑[15]，主要表現(xiàn)為管壁增生肥厚、血管彈力下降等管壁厚度、管徑及血管形狀改變，增加斑塊破裂風險。血管病理性重構(gòu)，具備中醫(yī)“瘀血”特征。四妙勇安湯作為活血解毒代表方劑，《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載：“疏其血氣，令其調(diào)達”，概括了四妙勇安湯抗凝、改善血液循環(huán)、抗氧化、抑制血栓形成的功效。本研究中血管內(nèi)外彈力膜面積與血管腔面積雖未表現(xiàn)出顯著差異，但均明顯縮小，作用強度與辛伐他汀相近，提示四妙勇安湯可一定程度上改善管腔狹窄，穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)，抑制血管重構(gòu)。

破潰斑塊屬于動脈粥樣硬化病變過程的“痰核毒化期”，此階段的病機特點是熱毒瘀血互結(jié)致?lián)p[16]，動脈粥樣硬化與脈管炎皆是血管性病變，破潰斑塊與熱毒壅盛型脈管炎病機相近，與四妙勇安湯清熱解毒活血的功效、方義相符。本研究結(jié)果顯示，四妙勇安湯主要通過增加TGF-β1表達從而增加斑塊內(nèi)膠原含量。TGF-β受體的表達模式對已發(fā)生的血管壁改變具有鎖定作用，即使TGF-β活動恢復正常，已分化的內(nèi)膜血管平滑肌細胞通過產(chǎn)生細胞外基質(zhì)而不是恢復至收縮狀態(tài)來反映，因而，高含量TGF-β1表達可形成穩(wěn)定的富含基質(zhì)的動脈粥樣硬化斑塊[3]。

四妙勇安湯可抑制血管內(nèi)彈力膜面積與血管腔面積增厚，防止病理性重構(gòu)，有利于穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)。四妙勇安湯應用于改善動脈粥樣硬化打破了傳統(tǒng)觀念認為其是脈管炎專方的看法，通過觀察四妙勇安湯對斑塊膠原和血管重構(gòu)的影響，為臨床治療動脈粥樣硬化、穩(wěn)定動脈斑塊進一步提供了動物實驗依據(jù)，以期拓寬臨床的治療思路。